クライオ電子顕微鏡による微小管-タンパク質複合体の研究のための哺乳類細胞からの修飾微小管抽出

注意: このプロトコルで使用されるすべての材料と機器に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。 1. 細胞培養 注:すべての細胞培養は、滅菌層流フードで行う必要があります。 このプロトコルに従うには、まず凍結細胞のバイアルを37°Cの水浴中で解凍します。ここでは、3つの既知の脱チロシン化酵素であるVASH1、VASH2、およびMATCAPを欠く遺伝子組み換えHCT116細胞株を使用して、チロシン化チューブリンを作成します。 10 mLの適切な細胞培養培地を含むØ10 cmプレートを準備します。注:このプロトコルでは、10%v / v FCS(ウシ胎児血清)およびペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質(培養培地)を添加したDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)を遺伝子組み換えHCT116細胞株に使用しました。 細胞をカウントし、準備した10 cmプレートに~2.5×10個の6 個の生細胞(~20%コンフルエント)を播種します。プレートを軽く振って、細胞を均等に分散させます。細胞が80%〜90%のコンフルエントに達するまで、5%(v / v)CO2 でガス化された37°Cの細胞培養インキュベーターで皿をインキュベートします。注:通常、HCT116細胞の場合、これには3日かかりますが、時間は特定の播種密度と使用する細胞株に依存する可能性があります。 ピペットまたは真空アスピレーターを使用して細胞培養培地を廃棄し、皿2 x 5 mLのPBSを洗浄します。注意: PBSをセル単層に強く分注しすぎると、セルがプレートから剥がれる可能性があるため、注意してください。 1〜2 mLのトリプシンを加え、インキュベーター内で細胞を2〜5分間インキュベートして細胞を剥離します。 プレートに2 mLの培養液を加えて、トリプシンをクエンチします。 細胞懸濁液を3〜5等分し、それらを再播種して、6〜12個のコンフルエントな15 cmプレートが得られるまで培養液中の細胞を拡張します。 2.収穫 10 mLのPBS(1x)で細胞を穏やかに洗浄し、細胞培養培地を除去します。 5 mM EDTA(滅菌/ろ過)を添加した3 mLの氷冷PBSを用いて室温で5分間細胞をインキュベートし、続いてセルスクレーパーを使用して、細胞をプレートから剥離します。 氷上で50 mLチューブに細胞を集め、スピンダウンします(10分、250 × g)。採取した細胞の体積を50 mLチューブ上の容量スケールでメモします。注:予想される容量は、~0.5mLから4mLの間の任意の場所にあります。一時停止ステップ:LN2中のセルペレットをフラッシュ凍結し、使用するまで-20°Cで保存します。セルペレットは数週間または数ヶ月間しか保存できないことに注意してください。ペレットをより長く保持すると、収量が低下したり、微小管がまったくなくなったりする可能性があります。 3.微小管抽出 注意: 手順3.1〜3.5のすべてを氷上に置いてください。ステップ3.6以降のすべては暖かく保つ必要があります(30-37°C)。 100 mMパイプ/KOH(pH 6.9)、2 mM EGTA/KOH、1 mM MgCl2、1 mM PMSF、および1つのプロテアーゼ阻害剤錠剤(ミニ)を含む10 mLの氷冷溶解バッファーを調製します。 採取した細胞ペレットを1:1 v/v溶解バッファーに再懸濁します(正確な量に疑問がある場合は、溶解バッファーを増やすのではなく、少なくします)。 超音波処理によって細胞を溶解する:15秒オン、45秒オフ、アンプ30、4サイクル(実験的に条件を決定し、超音波処理器に応じて変更)。超音波処理後、SDS-PAGE分析のためのサンプルを収集します:ライセート2μL+ 水18μL+ 5x SDSサンプルバッファー5μL。注:細胞が実際に完全に溶解したかどうかを標準の光学顕微鏡で確認してください。 溶解した細胞を遠心チューブにピペットで入れます。超遠心ローターで4°Cで100,000 × g で1時間回転し、ライセートを除去します。注意: 遠心分離機の正しいバランスを確保するために、ローターのすべてのポケットが乾いていて清潔であることを確認してください。 注射器を使用して、クリアしたライセートを取り出します。ペレットと上部の浮遊層を乱さないように注意してください。透明化したライセートのサンプルを収集します:ライセート2 μL+水18 μL+ 5 μLの5x SDSサンプルバッファー。 ペレットを注意深くすすぎ、ペレットを通してP10ピペットチップを回転させてペレットを少しすくい上げます。200 μLの水と50 μLのSDSバッファーを加えます。 前のステップの上清に1 mM GTPと20 μMパクリタキセルを補充して微小管を重合します。1 mLの容量の場合、10 μLの2 mMパクリタキセルと10 μLの100 mM GTPを追加します。注意:パクリタキセルは、皮膚の炎症、深刻な目の損傷、呼吸器の炎症、遺伝的欠陥、胎児の損傷、および臓器の損傷を引き起こす可能性があります。.長期または反復暴露は臓器に損傷を与えます。いかなる方法でも、物質を吸い込んだり、スプレーしたり、ほこりを払ったりしないでください。皮膚との接触を防ぐためにゴム製のニトリル手袋を着用してください。 GTP/パクリタキセルを添加した上清を37°Cで30分間インキュベートし、微小管を組み立てます。 このインキュベーションステップでは、ローターと超遠心分離機を30°Cまで温めます。 クッションバッファーの調製:0.4 mLの溶解バッファーに0.6 mLのグリセロールを加え、混合物に20 μMのパクリタキセルを補充します。クッションバッファーを37°Cに予熱します。 800 μLのクッションバッファーを超遠心チューブに加えます。GTP/パクリタキセルを添加したライセートをクッションバッファーの上に注意深くピペットで留めます。注意: 非常に穏やかにピペッティングすることにより、クッションバッファーとライセートの混合を防ぎます。 超遠心ローターで30°C、100,000 × g で30分間回転します。遠心分離チューブの外向きの端に印を付けて、微小管ペレットが形成される場所を簡単に認識できるようにします。 微小管ペレットを乱さないように注意しながら、ピペットを使用してクッションバッファーを慎重に取り除きます。クッションバッファーのサンプルを収集します:2 μL + 18 μLの水+ 5 μLの5x SDSサンプルバッファー。 ペレットを温かい溶解バッファーで3回注意深く洗浄し、グリセロールを除去します。ペレットの横にある温かいバッファーを静かに分注し(液体をペレットに直接流さないでください)、チューブを数回回転させてペレットとチューブの壁からできるだけ多くのグリセロールを除去してから、吸引して繰り返します。注:グリセロールが適切に洗い流されない場合、グリッドは電子照明の下で非常に急速に溶けます。これは、粒子の動きが大きく、ぼやけた画像を作成することで証明される可能性があります。 100 mMパイプ/KOH(pH 6.9)、2 mM EGTA/KOH、および1 mM MgCl2の成分を含む再懸濁バッファーを調製し、バッファーを37°Cに温めます。 洗浄したペレットをカットチップで~50 μLの予温した再懸濁バッファーに穏やかに再懸濁し、チューブを37°Cに保ちます。再懸濁ペレット画分のサンプルを収集します:2 μL + 18 μLの水+ 5 μLの5x SDSサンプルバッファー。先端:カットチップは微小管の破損を防ぎます。金属製の加熱ブロックを37°Cに用意し、サンプル管を室温まで冷却せずに簡単に輸送できるように、ポリスチレンボックスに保管してください。 4. クライオ電子顕微鏡グリッドの準備 吸い取り紙を取り付けて、プランジフリーザー装置を準備します。プランジフリーザーを30°Cまで温め、加湿を100%に設定します。温度と湿度を平衡化するために~30分待ちます。 プランジフリーザーの設定を2つのアプリケーションに準備し、プログラム全体を一度実行して、設定が正しく設定されていることを確認します。最初のアプリケーションの力が10、2秒のブロット時間、および0秒の待機時間であり、2番目のアプリケーションの力が10、6.5秒のブロット時間、および10秒の待機時間であることを確認します。 クライオEMグリッドを30mAで60秒間グロー放電します。 LN2でポリスチレン容器アセンブリを冷却し、エタンガスを冷たい金属カップに凝縮して金属カップで液体エタンを準備します。 100 mM PIPES/KOH (PH 6.9)、2 mM EGTA/KOH、および 1 mM MgCl2 の成分を含む希釈バッファーを準備し、37 °C に温めます。 微小管相互作用タンパク質をグリッドに適用する直前に希釈バッファーで1:1 v/vに希釈して、塩濃度を確実に下げます(最終塩濃度50 mM NaClを使用しました)。混合物を37°Cに保ちます。 プランジピンセットでグロー放電グリッドをつかみ、プランジフリーザーにクリックします。 液体エタンの入ったポリスチレン容器をプランジフリーザーに入れ、準備したプログラムを実行します:最初に3.5 μLの微小管溶液をグリッドに塗布し、プランジフリーザーでグリッドを吸い取り、次にすぐに3.5 μLの新たに希釈したタンパク質を塗布し、最後にプランジャーを吸い取り、液体エタンでグリッドを急落凍結させます。 グリッドをグリッドストレージボックスに移し、イメージングするまでLN2デュワーに保管します。