חילוץ מיקרוטובולים מהונדסים מתאי יונקים לחקר קומפלקסים של מיקרוטובולים-חלבונים באמצעות מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה. 1. תרבית תאים הערה: כל תרבית התאים צריכה להיעשות במכסה מנוע סטרילי של זרימה למינרית. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, תחילה הפשיר בקבוקון של תאים קפואים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. כאן, אנו משתמשים בקו תאים HCT116 מהונדס גנטית שחסר את שלושת האנזימים הידועים לנטרול טירוזינאט, VASH1, VASH2 ו-MATCAP, כדי ליצור טובולין שעבר טירוזיזציה. הכינו צלחת Ø בקוטר 10 ס”מ המכילה 10 מ”ל של מדיום תרבית התאים המתאים.הערה: בפרוטוקול זה, DMEM (מדיום הנשר המעובד של Dulbecco) בתוספת 10% v/v FCS (נסיוב עגל עובר) ואנטיביוטיקה פניצילין/סטרפטומיצין (מדיום תרבית) שימש לקו התאים HCT116 המהונדס גנטית. לספור את התאים, זרע ~ 2.5 × 106 תאים קיימא (~ 20% מפגש) בצלחת מוכן 10 ס”מ. נערו את הצלחת בעדינות כדי לפזר את התאים באופן שווה. דוגרים על הצלחת באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C עם 5% (v/v)CO2 עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%-90%.הערה: בדרך כלל, פעולה זו נמשכת 3 ימים עבור תאי HCT116, אך הזמן עשוי להיות תלוי בצפיפות הזריעה הספציפית ובקו התאים שבהם נעשה שימוש. השליכו את מדיום תרבית התאים באמצעות פיפטה או שואב ואקום ושטפו את הצלחת 2 x 5 מ”ל של PBS.הערה: היזהר לא לחלק את PBS בכוח רב מדי על monolayer התא כמו זה יכול לנתק את התאים מן הצלחת. מוסיפים 1-2 מ”ל טריפסין, ודגרים על התאים באינקובטור למשך 2-5 דקות כדי לנתק את התאים. מוסיפים 2 מ”ל של מדיום התרבית לצלחת כדי להרוות את טריפסין. מפצלים את תרחיף התא לשלושה עד חמישה חלקים שווים וזורעים אותם מחדש כדי להרחיב את התאים בתווך תרבית עד לקבלת 6-12 לוחות 15 ס”מ מתמזגים. 2. קציר שטפו את התאים בעדינות עם 10 מ”ל PBS (1x) כדי להסיר כל מדיום תרבית תאים. נתקו את התאים מהלוחות על ידי דגירה של התאים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם 3 מ”ל של PBS קר כקרח בתוספת 5 mM EDTA (סטרילי/מסונן), ולאחר מכן, באמצעות מגרד תאים. לאסוף את התאים בצינור 50 מ”ל על קרח, ולסובב למטה (10 דקות, 250 × גרם).שים לב לנפח התאים שנקטפו עם קנה המידה הנפחי על צינור 50 מ”ל.הערה: אמצעי האחסון הצפוי יכול להיות בכל מקום בין ~0.5 מ”ל ל- 4 מ”ל. שלב השהיה: יש להקפיא במהירות הבזק את כדורית התא ב-LN2, ולאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש. שים לב כי גלולת התא ניתן לאחסן רק במשך כמה שבועות או חודשים. אם הגלולה נשמרת זמן רב יותר, אז זה יכול לגרום לירידה ביבול או ללא מיקרוטובולים בכלל. 3. מיצוי מיקרוטובול הערה: שמור הכל עבור שלבים 3.1-3.5 על קרח; כל דבר משלב 3.6 ואילך צריך להישמר חם (30-37 מעלות צלזיוס). הכינו 10 מ”ל של חיץ ליזה קר כקרח המכיל צינורות 100 mM/KOH (pH 6.9), 2 mM EGTA/KOH, 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF וטבליה מעכבת פרוטאז אחת (mini). השהה מחדש את גלולת התא שנקטפה במאגר ליזיס ביחס של 1:1 v/v (אם יש ספק לגבי הנפח המדויק, קח פחות חיץ ליזיס במקום יותר). ליז את התאים על ידי סוניקציה: 15 שניות על, 45 שניות כבוי, אמפר 30, ארבעה מחזורים (לקבוע את התנאים בניסוי, ולשנות בהתאם הסוניקטור).לאחר סוניקציה, לאסוף דגימה עבור ניתוח SDS-PAGE: 2 μL של lysate + 18 μL של מים + 5 μL של 5x SDS מאגר דגימה.הערה: בדוק תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי אם התאים אכן ליזה במלואה. פיפטה את התאים lysed לתוך צינור צנטריפוגלי. סחרור במשך שעה אחת ב- 100,000 × גרם ב- 4 ° C ברוטור אולטרה-צנטריפוגה כדי לנקות את הליזט.הערה: ודא שכל הכיסים ברוטור יבשים ונקיים כדי להבטיח איזון נכון של הצנטריפוגה. השתמש מזרק כדי להוציא את lysate מנוקה החוצה. יש להקפיד לא להפריע לגלולה כמו גם לשכבה הצפה מלמעלה.אסוף דגימה של הליזט שפונה: 2 μL של ליזט + 18 μL של מים + 5 μL של 5x SDS מאגר דגימה. שטפו בזהירות את הכדור, וגרפו מעט מהגלולה על ידי ערבול קצה פיפטה P10 דרך הכדור; הוסף 200 μL מים ו 50 μL של חיץ SDS. להשלים את supernatant מן השלב הקודם עם 1 mM GTP ו 20 μM paclitaxel כדי פולימריזציה microtubules; לקבלת נפח של 1 מ”ל, הוסף 10 μL של 2 mM paclitaxel ו- 10 μL של 100 mM GTP.אזהרה: Paclitaxel עלול לגרום לגירוי בעור, נזק חמור לעיניים, גירוי נשימתי, פגמים גנטיים, נזק לילד שטרם נולד ונזק לאיברים. חשיפה ממושכת או חוזרת גורמת נזק לאיברים. אין לנשום, לרסס או לאבק את החומר בכל דרך שהיא. יש ללבוש כפפות גומי ניטריל כדי למנוע מגע עם העור. דגרו על סופרנאטנט עם תוספת GTP/פקליטקסל למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C כדי לאפשר למיקרוטובולים להתכנס. במהלך שלב הדגירה הזה, לאפשר את הרוטור ואת ultracentrifuge להתחמם עד 30 °C (75 °F). הכינו את מאגר הכרית: הוסיפו 0.6 מ”ל גליצרול ל-0.4 מ”ל של חיץ ליזיס, והשלימו את התערובת עם 20 מיקרומטר פקליטקסל. מחממים מראש את כרית כרית ל 37 ° C. הוסף 800 μL של חיץ כרית לצינור אולטרה-צנטריפוגה. פיפטה הליזט בתוספת GTP/פקליטקסל בזהירות על גבי מאגר הכרית.הערה: יש למנוע ערבוב של חיץ הכרית והליזט על-ידי פיפטינג עדין מאוד. סחרור במשך 30 דקות ב- 100,000 × גרם ב- 30 ° C ברוטור אולטרה-צנטריפוגה. סמן את הקצה הפונה כלפי חוץ של צינור הצנטריפוגה כדי לזהות בקלות היכן אמורה להיווצר גלולת המיקרוטובול. הסר את חיץ הכרית בזהירות באמצעות פיפטה, נזהר לא להפריע גלולת microtubule.אסוף דגימה של מאגר הכרית: 2 μL + 18 μL מים + 5 μL של מאגר דגימה 5x SDS. שטפו את הגלולה בזהירות 3x עם חיץ ליזה חם כדי להסיר את הגליצרול. מוציאים בעדינות את החיץ החם ליד הגלולה (לא שוטפים את הנוזל ישירות על הכדור), מסובבים את הצינור כמה פעמים כדי להסיר כמה שיותר גליצרול מהגלולה ומדפנות הצינור, ואז שואפים וחוזרים.הערה: אם הגליצרול לא נשטף כראוי, הרשת תימס מהר מאוד תחת תאורת האלקטרונים. עדות לכך עשויה להיות תנועת חלקיקים גבוהה, היוצרת תמונות מטושטשות. הכינו חיץ השעיה עם המרכיבים הבאים: צינורות 100 mM/KOH (PH 6.9), 2 mM EGTA/KOH ו-1 mM MgCl2, וחממו את החיץ ל-37°C. השהה מחדש את הגלולה שטופה בעדינות עם קצה חתוך ב~ 50 μL של חיץ השעיה שחומם מראש, ושמור על הצינור ב 37 ° C.אסוף דגימה של חלק הגלולה המושעה: 2 μL + 18 μL מים + 5 μL של מאגר דגימה 5x SDS.טיפ: קצה החיתוך מונע את שבירת המיקרוטובולים. הכינו גוש חימום מתכתי לטמפרטורה של 37°C, ושמרו אותו בקופסת פוליסטירן, כך שניתן יהיה להעביר את צינורות הדגימה בקלות מבלי לקרר אותם לטמפרטורת החדר. 4. הכנת רשת Cryo-EM הכינו את מכשיר המקפיא על ידי התקנת נייר הניקוי. מחממים את המקפיא עד 30 מעלות צלזיוס, ומכוונים את הלחות ל -100%. אפשר ~ 30 דקות כדי לאזן את הטמפרטורה והלחות. הכינו את ההגדרות של המקפיא לשני יישומים, ועברו על התוכנית כולה פעם אחת כדי לוודא שההגדרות מוגדרות כראוי. ודא שליישום הראשון יש כוח של 10, זמן כתם של 2 שניות וזמן המתנה של 0 שניות ושליישום השני יש כוח של זמן המתנה של 10, 6.5 שניות וזמן המתנה של 10 שניות. זוהר-לפרוק את רשתות cryo-EM ב 30 mA במשך 60 שניות. קררו את מכלול מיכל הפוליסטירן עם LN2, והכינו אתאן נוזלי בכוס מתכת על ידי עיבוי גז אתאן לכוס מתכת קרה. הכינו חיץ דילול עם הרכיבים הבאים: צינורות 100 mM/KOH (pH 6.9), 2 mM EGTA/KOH ו-1 mM MgCl2, וחממו אותו ל-37°C. דללו את החלבון באינטראקציה מיקרוטובולית 1:1 v/v עם חיץ דילול ממש לפני החלתו על הרשתות, כדי להבטיח שריכוז המלח יורד (השתמשנו בריכוז מלח סופי של 50 mM NaCl). שמור את התערובת על 37 מעלות צלזיוס. תפוס רשת משוחררת זוהרת עם פינצטה צלולה ולחץ אותם לתוך המקפיא. מקמו את מיכל הפוליסטירן עם אתאן נוזלי במקפיא הצלילה, ועברו על התוכנית המוכנה: ראשית מרחו 3.5 מיקרוליטר של תמיסת מיקרוטובול על הרשת, תנו למקפיא לצלול לכתם את הרשת, ואז מרחו מיד 3.5 מיקרוליטר של חלבון מדולל טרי, ולבסוף, תנו לבוכנה לכתם ולצלול-להקפיא את הרשת באתאן נוזלי. העבירו את הרשתות לקופסת אחסון רשת, ואחסנו אותן בדיואר LN2 עד להדמיה.