Ici, nous décrivons un protocole pour extraire la tubuline endogène de cellules de mammifères, qui peuvent manquer ou contenir des enzymes modificateurs de microtubules spécifiques, pour obtenir des microtubules enrichis pour une modification spécifique. Nous décrivons ensuite comment les microtubules extraits peuvent être décorés avec des protéines purifiées de liaison aux microtubules pour préparer des grilles pour la cryo-microscopie électronique.
Les microtubules sont une partie importante du cytosquelette et sont impliqués dans l’organisation intracellulaire, la division cellulaire et la migration. Selon les modifications post-traductionnelles, les microtubules peuvent former des complexes avec diverses protéines en interaction. Ces complexes microtubule-protéine sont souvent impliqués dans les maladies humaines. Comprendre la structure de tels complexes est utile pour élucider leurs mécanismes d’action et peut être étudié par cryo-microscopie électronique (cryo-EM). Pour obtenir de tels complexes pour les études structurales, il est important d’extraire des microtubules contenant ou dépourvus de modifications post-traductionnelles spécifiques. Ici, nous décrivons un protocole simplifié pour extraire la tubuline endogène de cellules de mammifères génétiquement modifiées, impliquant la polymérisation des microtubules, suivie d’une sédimentation par ultracentrifugation. La tubuline extraite peut ensuite être utilisée pour préparer des grilles de cryo-microscope électronique avec des microtubules liés à une protéine purifiée de liaison aux microtubules d’intérêt. À titre d’exemple, nous démontrons l’extraction de microtubules entièrement tyrosinés à partir de lignées cellulaires conçues pour ne pas avoir les trois enzymes détyrosinantes connues de la tubuline. Ces microtubules sont ensuite utilisés pour fabriquer un complexe protéique avec la tubuline détyrosinase associée à la microtubule enzymatiquement inactive sur des grilles cryo-EM.
Les microtubules sont une partie cruciale du cytosquelette; Ils sont impliqués dans différentes fonctions telles que la migration et la division cellulaires mais contribuent également à l’organisation intracellulaire. Pour s’adapter à différents destins fonctionnels, les microtubules interagissent avec une variété de protéines associées aux microtubules (MAP), d’enzymes et d’autres protéines, que nous appellerons collectivement « protéines interagissant avec les microtubules ». La liaison microtubule de ces protéines peut être guidée par différentes modifications de la tubuline, communément appelées « code de la tubuline »1. Des exemples de cette préférence sont la kinésine mitotique associée au centromère (MCAK)2 et le domaine dynéine-dynactine CAP-Gly de p1503, qui s’associent de préférence à la tubuline tyrosinée, tandis que les moteurs kinésiens de la protéine E associée au centromère (CENP-E)4 et kinésine-25 préfèrent la tubuline dépourvue de tyrosine C-terminale.
Bien qu’une variété de méthodes puissent être utilisées pour étudier les interactions microtubule-protéine, la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) est souvent utilisée pour étudier ces interactions à une résolution quasi atomique 6,7. Ces dernières années, les structures cryo-EM ont révélé comment les grandes protéines motrices telles que la dynéine 8,9,10 et la kinésine 11, les protéines +TIP telles que EB312,13 et MCAK 14, d’autres protéines telles que Tau15,16, et même de petites molécules telles que le paclitaxel, le péloroside et le zampanolide 17 interagir avec les microtubules. Pour étudier les interactions microtubule-protéine, les microtubules sont généralement extraits du cerveau porcin18. Par la suite, la plupart des études in vitro, y compris les structures de microtubules cryo-EM, sont réalisées à l’aide de tubuline cérébrale porcine. Les résultats de ces études masquent donc l’importance de la nature hétérogène des modifications de la tubuline19 entre les tissus et les types cellulaires. Cela crée un problème particulier lors de l’étude d’une protéine qui nécessite ou préfère une modification spécifique pour se lier aux microtubules. Cela peut être illustré avec la tubuline tyrosinée, le substrat de la microtubule détyrosinase MATCAP.
La détyrosination est une modification de la tubuline dans laquelle l’acide aminé C-terminal tyrosine de la α-tubuline fait défaut, ce qui est associé à la fonction mitotique, cardiaque et neuronale20. Bien que les microtubules entièrement tyrosinés soient le substrat idéal pour MATCAP, cela est largement absent dans les microtubules disponibles dans le commerce du cerveau porcin en raison de la fonction des vasohibines 21,22 et des MATCAP 23 détyrosinases dans ce tissu 22,23,24,25,26. Bien que la tubuline HeLa disponible dans le commerce contienne principalement des microtubules tyrosinés, une détyrosination pourrait se produire, et cette source de tubuline est donc moins appropriée pour créer un échantillon uniforme pour l’analyse cryo-EM.
Pour stimuler la liaison de MATCAP aux microtubules et créer un échantillon homogène pour l’analyse structurelle, nous avons cherché une source de microtubules entièrement tyrosinée. À cette fin, une lignée cellulaire déficiente en MATCAP et en vasohibin a été créée, qui a été utilisée pour extraire des microtubules entièrement tyrosinés. La procédure d’extraction était basée sur des protocoles bien établis qui utilisent des cycles répétés de polymérisation et de dépolymérisation des microtubules pour extraire la tubuline du tissu cérébral ou des cellules 18,27,28,29,30, avec une seule étape de polymérisation et de centrifugation sur un coussin de glycérol. En utilisant MATCAP comme exemple, nous démontrons ensuite comment ces microtubules peuvent être utilisés pour les études cryo-EM. Pour préparer des grilles cryo-EM, un protocole d’application en deux étapes à une faible concentration en sel est décrit. Les méthodes décrites dans cet article décrivent l’extraction de microtubules personnalisables en quantités et puretés suffisantes pour effectuer une analyse cryo-EM et fournissent un protocole détaillé sur la façon d’utiliser ces microtubules pour créer des complexes protéine-microtubule sur des grilles cryo-EM.
Cette méthode décrit comment extraire rapidement la tubuline endogène des lignées cellulaires et ensuite décorer ces microtubules sur des grilles cryo-EM. Les microtubules sont sensibles à la température. Ils se dépolymérisent dans un environnement froid et polymérisent dans un environnement chaud31. Il est donc essentiel d’exécuter la rotation de sonication et de clairance (étapes 1.1-1.5) à 4 °C pour solubiliser la tubuline. Si des facteurs stabilisaient si bien les microtubules qu’ils ne se dépolymériseraient pas à cette étape, ces microtubules et les facteurs de stabilisation seraient éliminés dans la pastille après le spin de clairance initial. Après (ré)polymérisation des microtubules, il est important de garder la solution contenant les microtubules polymérisés au chaud en tout temps. Nous avons extrait les microtubules des cellules HCT116, qui sont déficientes en protéines VASH1, VASH2 et MATCAP. D’autres lignées cellulaires, ainsi que des tissus, peuvent être utilisés pour extraire des microtubules29, bien que les contaminants, les isotypes de tubuline et le rendement puissent être très différents de ce qui est décrit ici. Les plasmides surexprimant qui contiennent des enzymes modificatrices peuvent également être utilisés pour introduire des modifications spécifiques de la tubuline.
D’autres protocoles 18,27,28,29,30 utilisent plusieurs cycles de polymérisation et de dépolymérisation des microtubules pour obtenir des microtubules dépourvus d’autres protéines en interaction. Ici, nous avons simplifié ces protocoles et ne polymérisons les microtubules qu’une seule fois. Il est possible qu’en raison de cette polymérisation unique, ces microtubules puissent co-sédimenter avec d’autres protéines interagissant avec les microtubules. Cependant, nous avons constaté que ce protocole donne des microtubules suffisamment purs pour les cryo-EM. Si un échantillon plus pur est nécessaire pour des essais spécifiques, des cycles supplémentaires de polymérisation et de dépolymérisation pourraient produire un échantillon plus pur, bien que cela puisse se faire au détriment du rendement en microtubules. Dans ce protocole, nous avons utilisé le paclitaxel pour polymériser les microtubules. Cependant, le paclitaxel pourrait biaiser le réseau des microtubules vers une certaine torsion et augmentation, ce qui pourrait interférer avec l’affinité microtubule de la protéine d’intérêt. D’autres réactifs stabilisateurs des microtubules pourraient être utilisés si le paclitaxel ne convient pas; des exemples de ces réactifs sont des molécules non taxanes telles que le peloruside ou des variantes GTP non hydrolysables telles que GMPCPP 17,32.
Pour étudier structurellement les protéines qui se lient aux microtubules sur des grilles cryo-EM, il faut lier une quantité suffisante de la protéine d’intérêt pour les microtubules. Un problème courant est que les complexes protéiques qui sont stables en solution se désagrègent sur la grille. Pour former le complexe protéique sur la grille, il était crucial de superposer d’abord les microtubules, puis d’appliquer la protéine de liaison aux microtubules avec une faible concentration de sel sur la grille recouverte de microtubules, assemblant ainsi le complexe protéique directement sur la grille. D’autres ont également signalé un protocole à faible teneur en sel 33,34 et un protocole d’application en deux étapes34,35,36 pour une décoration réussie des microtubules. Il est probable qu’une concentration de sel plus faible oriente le complexe protéique vers une interaction plus stable en raison de la diminution des charges électrostatiques. Cependant, en raison de la faible concentration en sel, la protéine d’intérêt risque de précipiter. Par conséquent, il est fortement recommandé de maintenir la protéine à ou autour des concentrations de sel physiologiquement pertinentes jusqu’à peu de temps avant de vitrifier les grilles. Ce protocole d’application en deux étapes empêche probablement le complexe protéique de se désagréger pendant les étapes de transfert ou de congélation. Dans ce protocole, nous avons utilisé le Vitrobot. Cependant, des méthodes de vitrification plus rapides (VitroJet) ou l’utilisation de grilles sans taches (Puffalot) ou de dispositifs ayant les deux propriétés (caméléon) pourraient potentiellement surmonter l’application en deux étapes, mais ceux-ci ne sont actuellement pas largement disponibles pour les tests.
La résolution finale de la densité cryo-EM reconstruite peut être affectée par un certain nombre de facteurs, y compris le mouvement de la protéine de liaison aux microtubules par rapport au microtubule et le niveau de décoration qui peut être atteint. Une décoration plus élevée des microtubules est probablement bénéfique pour la résolution finale obtenue dans la reconstruction de densité 3D. Cela peut être limité par quelques facteurs, tels que la concentration protéique la plus élevée obtenue lors de la purification de la protéine de liaison aux microtubules, la concentration de sel la plus faible que la protéine interagissant avec les microtubules peut supporter sans agrégation et le mode de liaison de la protéine interagissant avec les microtubules (par exemple, la protéine pourrait couvrir plus d’un dimère de tubuline, entravant ainsi un rapport de liaison de 1:1). Bien que la résolution de la reconstruction cryo-EM puisse être compromise par des microtubules peu décorés, l’analyse informatique peut contourner de nombreux problèmes, comme en témoigne une structure complexe microtubule-protéine récemment rapportée qui était extrêmement peu décorée8.
Le protocole que nous décrivons ici présente une méthode rapide et peu coûteuse pour obtenir des microtubules adaptés à des fins cryo-EM. Contrairement à la tubuline cérébrale porcine disponible dans le commerce, les microtubules dérivés de cellules HCT116 déficientes en MATCAP et en vasohibin sont entièrement tyrosinés (Figure 4). La tubuline HeLa commerciale, un réactif coûteux, est en principe relativement uniformément tyrosinée et contient peu d’autresmodifications4 telles que la glutamylation, mais les lots peuvent varier et la modification ne peut être réalisée que in vitro. Un avantage de l’extraction de microtubules à partir de lignées cellulaires sur mesure est la flexibilité dont on dispose pour surexprimer ou supprimer les enzymes modifiant la tubuline, telles que les tubulines détyrosinases, pour créer un pool plus homogène de microtubules. Cela peut améliorer la décoration et l’uniformité de l’échantillon cryo-EM et, en fin de compte, la facilité et la qualité des cartes de densité cryo-EM et des structures moléculaires dérivées de cet échantillon.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions tous les membres des groupes Sixma, Brummelkamp et Perrakis pour leurs discussions scientifiques fructueuses et pour avoir fourni un environnement de travail agréable, et plus particulièrement, nous remercions Jan Sakoltchik (« personne 2 ») d’avoir aidé à déterminer la concentration de protéines représentée à la figure 3C. Nous tenons également à remercier l’installation cryo-EM NKI et le Centre néerlandais de nanoscopie électronique (NeCEN) de l’Université de Leiden pour leur soutien. Ce travail a été soutenu par la subvention NWO Vici 016.Vici.170.033 accordée à T.R.B.. A.P. et T.R.B. sont des enquêteurs Oncode et reçoivent un financement de NWO ENW (OCENW. M20.324). L.L. a reçu un financement du Fonds autrichien pour la science (FWF JB4448-B). Cette recherche a été financée par une subvention institutionnelle de la Société néerlandaise du cancer et du ministère néerlandais de la Santé, du Bien-être et des Sports.
Material | |||
0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Cell culture |
10 cm plate | Falcon | 353003 | Cell culture |
15 cm plate | Thermo FisherScientific | 168381 | Cell culture |
50 mL tubes | Sarstedt | 62.547255 | Cell culture |
300 mesh quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3 | Quantifoil Micro Tools | N1-C14nCu30-01 | Cryo-EM grid preparation |
Cell scrapers | Falcon | 353085 | Cell culture |
DMEM | Gibco | 41966-029 | Cell culture |
EDTA | Merck | 108418 | Cell culture |
EGTA | Sigma Aldrich | E3899 | Microtubule extraction |
Ethane gas | Cryo-EM grid preparation | ||
FCS | Serana | s-FBS-EU-015 | Cell culture |
Glycerol | VWR | 24.397.296 | Microtubule extraction |
GTP | Fisher Scientific | G8877-1G | Microtubule extraction |
HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO cells | self made | Wild type HCT116 cells RRID: CVCL_0291 | Cell culture |
KOH | Merck | 1.05033 | Microtubule extraction |
MgCl2 | Merck | 105833 | Microtubule extraction |
Microtubule binding protein | self made | Cryo-EM grid preparation | |
Needle | BD microlance | 300600 | Microtubule extraction |
Paclitaxel | Santa Cruz Biotechnology | sc-212517 | caution toxic, microtubule extraction |
PBS | Fisher Scientific | BP399 | Cell culture |
Penicillin and streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | Cell culture |
PIPES | Merck | P8203 | Microtubule extraction |
PMSF (in EtOH) | Roche | 16837091001 | Microtubule extraction |
SDS sample buffer | self made | Quality assessment | |
Syringe | BD plastipak | 309658 | Microtubule extraction |
Ultra protease tables mini | Fisher Scientific | NC0975224 | Microtubule extraction |
Whatman blotting paper | Whatman | 47000-100 | Cryo-EM grid preparation |
Equipment | |||
Flow hood | cell culture | ||
GloQube | Quorum | Cryo-EM grid preparation | |
Grid storage box | SWISSCI | 41018 | Cryo-EM grid storage |
Heating block, electric or metal | to warm the buffers | ||
Incubator, cell culture | NUAIR | cell culture | |
LN2 dewar | Cryo-EM grid storage | ||
Plunge-tweezers | Electron Microscopy Sciences | 0508-L5-PS | Cryo-EM grid preparation, hole drilled in top to fit the vitrobot |
Polystyrene box | to keep the buffers warm | ||
Sonicator | Qsonica | Q700 | Microtubule extraction |
Standard light microscope | Olympus | CKX 41 | Quality assessment |
TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
Tubes for TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | 326819 | Microtubule extraction |
Tubes for TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | 347356 | Microtubule extraction |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Microtubule extraction |
Vitrobot | FEI, ThermoFischer Scientific | mark IV | Cryo-EM grid preparation |
Vitrobot polystyrene container assembly with metal ethane cup | ThermoFisher Scientific | 200703 | Cryo-EM grid preparation |
Water bath | cell culture |