从哺乳动物细胞中提取修饰的微管以通过冷冻电子显微镜研究微管 - 蛋白质复合物

注意：有关此协议中使用的所有材料和设备的详细信息，请参阅 材料表 。 1. 细胞培养 注意：所有细胞培养都应在无菌层流罩中进行。 为了遵循该协议，首先在37°C水浴中解冻一瓶冷冻细胞。在这里，我们使用缺乏三种已知去酪氨酸酶VASH1，VASH2和MATCAP的转基因HCT116细胞系来产生酪氨酸微管蛋白。 准备含有 10 mL 适当细胞培养基的 Ø 10 cm 板。注意：在该协议中，DMEM（Dulbecco的改良Eagle培养基）补充了10%v / v FCS（胎牛血清）和青霉素/链霉素抗生素（培养基）用于转基因HCT116细胞系。 计数细胞，并在制备的10cm平板中接种~2.5×106 个活细胞（~20%汇合）。轻轻摇动板以使细胞均匀分布。将培养皿在用5%（v / v）CO2 气体的37°C细胞培养箱中孵育，直到细胞达到80%-90%汇合。注意：通常，HCT3细胞需要116天，但时间可能取决于所使用的特定接种密度和细胞系。 使用移液器或真空吸液器丢弃细胞培养基，并洗涤培养皿2 x 5 mL PBS。注意：注意不要将PBS过于用力地分配到细胞单层上，因为这会使细胞从板上分离。 加入1-2mL胰蛋白酶，并将细胞在培养箱中孵育2-5分钟以分离细胞。 向平板中加入 2 mL 培养基以淬灭胰蛋白酶。 将细胞悬液分成三到五个相等的部分，并重新接种它们以在培养基中扩增细胞，直到获得6-12个汇合的15cm板。 2. 收获 用 10 mL PBS （1x） 轻轻洗涤细胞以去除任何细胞培养基。 通过在室温下用补充有5mM EDTA（无菌/过滤）的3mL冰冷PBS孵育细胞5分钟，然后使用细胞刮刀，将细胞从板上分离。 将细胞收集在冰上的 50 mL 管中，然后向下旋转（10 分钟，250 × g）。在 50 mL 管上用体积刻度记录收获的细胞的体积。注意：预期体积可以在 ~0.5 mL 和 4 mL 之间。暂停步骤：将细胞沉淀在LN 2中快速冷冻，并储存在-20°C直至使用。请注意，细胞沉淀只能储存几周或几个月。如果沉淀保存时间更长，则可能导致产量降低或根本没有微管。 3. 微管提取 注意：将步骤 3.1-3.5 的所有内容保存在冰上;从步骤3.6开始的所有东西都应保持温暖（30-37°C）。 制备 10 mL 冰冷裂解缓冲液，含有 100 mM 管/KOH（pH 6.9）、2 mM EGTA/KOH、1 mM MgCl2、1 mM PMSF 和 1 片蛋白酶抑制剂片剂（迷你）。 将收获的细胞沉淀重悬于1：1 v / v裂解缓冲液中（如果对确切体积有疑问，请少用而不是多用裂解缓冲液）。 通过超声处理裂解细胞：15 秒开，45 秒关，安培 30，四个周期（通过实验确定条件，并根据超声仪改变）。超声处理后，收集样品进行 SDS-PAGE 分析：2 μL 裂解物 + 18 μL 水 + 5 μL 5x SDS 样品缓冲液。注意：在标准光学显微镜下检查细胞是否确实完全裂解。 将裂解的细胞移液到离心管中。在超速离心机转子中以4°C以100，000× g 旋转1小时以清除裂解物。注意： 确保转子中的所有口袋干燥清洁，以确保离心机的正确平衡。 使用注射器取出清除的裂解物。注意不要打扰颗粒以及顶部的浮动层。收集清除裂解物的样品：2 μL 裂解物 + 18 μL 水 + 5 μL 5x SDS 样品缓冲液。 小心地冲洗颗粒，并通过旋转P10移液器吸头穿过颗粒来舀起一点颗粒;加入 200 μL 水和 50 μL SDS 缓冲液。 用1mM GTP和20μM紫杉醇补充上一步的上清液以聚合微管;对于 1 mL 的体积，加入 10 μL 2 mM 紫杉醇和 10 μL 100 mM GTP。注意：紫杉醇可能会引起皮肤刺激、严重的眼睛损伤、呼吸道刺激、遗传缺陷、对未出生婴儿的损害和器官的损害。长期或反复接触会对器官造成损害。请勿以任何方式呼吸、喷洒或除尘该物质。戴橡胶丁腈手套，防止皮肤接触。 将补充GTP /紫杉醇的上清液在37°C孵育30分钟，以使微管组装。 在此孵育步骤中，让转子和超速离心机升温至30°C。 准备缓冲液：将 0.6 mL 甘油加入 0.4 mL 裂解缓冲液中，并用 20 μM 紫杉醇补充混合物。将缓冲液预热至37°C。 向超速离心管中加入 800 μL 缓冲液。将补充GTP/紫杉醇的裂解液小心地移液放在缓冲液的顶部。注意：通过非常轻柔地移液来防止缓冲缓冲液和裂解物混合。 在超速离心机转子中以100，000× g 在30°C下旋转30分钟。标记离心管的朝外边缘，以轻松识别微管沉淀应形成的位置。 使用移液管小心地取出缓冲液，注意不要干扰微管沉淀。收集缓冲液样品：2 μL + 18 μL 水 + 5 μL 5x SDS 样品缓冲液。 用温热的裂解缓冲液仔细清洗沉淀3次以除去甘油。轻轻分配沉淀旁边的温热缓冲液（不要将液体直接冲洗在沉淀上），旋转试管几次以从沉淀和管壁中去除尽可能多的甘油，然后吸出并重复。注意：如果甘油没有正确洗掉，网格将在电子照明下很快熔化。这可能通过高粒子运动来证明，从而产生模糊的图像。 使用以下成分制备重悬缓冲液：100 mM 管/KOH（pH 6.9）、2 mM EGTA/KOH 和 1 mM MgCl2，并将缓冲液加热至 37 °C。 用切割的尖端将洗涤的沉淀轻轻重悬于~50μL预热的重悬缓冲液中，并将管保持在37°C。收集重悬沉淀级分的样品：2 μL + 18 μL 水 + 5 μL 5x SDS 样品缓冲液。提示：切割尖端可防止微管断裂。准备一个金属加热块至37°C，并将其保存在聚苯乙烯盒中，以便样品管可以轻松运输，而无需将其冷却至室温。 4. 冷冻电镜网格准备 通过安装吸墨纸来准备跳入式冷冻机设备。将低温冰箱加热至30°C，并将加湿度设置为100%。允许~30分钟以平衡温度和湿度。 将跳入式冰箱的设置准备到两个应用程序中，并运行一次整个程序以确保设置正确。确保第一次应用的力为 10、2 秒印迹时间和 0 秒等待时间，第二次施用的力为 10、6.5 秒印迹时间和 10 秒等待时间。 对冷冻电镜网格在 30 mA 下辉光放电 60 秒。 用LN2冷却聚苯乙烯容器组件，通过将乙烷气体冷凝到冷金属杯中，在金属杯中制备液态乙烷。 用以下组分制备稀释缓冲液：100 mM PIPES/KOH （PH 6.9）、2 mM EGTA/KOH 和 1 mM MgCl2，并将其加热至 37 °C。 在将其应用于网格之前，用稀释缓冲液以1：1 v / v稀释微管相互作用蛋白，以确保盐浓度降低（我们使用50mM NaCl的最终盐浓度）。将混合物保持在37°C。 用镊子拿起一个发光的网格，然后将它们按入跳入冰箱。 将装有液态乙烷的聚苯乙烯容器放置在小型冰箱中，并运行准备好的程序：首先将 3.5 μL 微管溶液涂在网格上，让跳入式冰箱吸干网格，然后立即应用 3.5 μL 新鲜稀释的蛋白质，最后，让柱塞印迹并将网格浸入液体乙烷中。 将网格转移到网格存储盒中，并将它们存储在 LN2 杜瓦瓶中直至成像。