نصف هنا بروتوكولا لاستخراج التوبولين الداخلي من خلايا الثدييات، التي يمكن أن تفتقر إلى إنزيمات محددة معدلة للأنابيب الدقيقة أو تحتوي عليها، للحصول على أنابيب دقيقة مخصبة لإجراء تعديل معين. ثم نصف كيف يمكن تزيين الأنابيب الدقيقة المستخرجة ببروتينات مرتبطة بالأنيبيبات الدقيقة المنقاة لإعداد شبكات للمجهر الإلكتروني بالتبريد.
تعد الأنابيب الدقيقة جزءا مهما من الهيكل الخلوي وتشارك في التنظيم داخل الخلايا وانقسام الخلايا والهجرة. اعتمادا على تعديلات ما بعد الترجمة ، يمكن أن تشكل الأنابيب الدقيقة مجمعات مع بروتينات متفاعلة مختلفة. غالبا ما تكون مجمعات البروتين الدقيقة هذه متورطة في الأمراض البشرية. إن فهم بنية هذه المجمعات مفيد لتوضيح آليات عملها ويمكن دراستها بواسطة المجهر الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM). للحصول على مثل هذه المجمعات للدراسات الهيكلية ، من المهم استخراج الأنابيب الدقيقة التي تحتوي أو تفتقر إلى تعديلات محددة بعد الترجمة. هنا ، نصف بروتوكولا مبسطا لاستخراج التوبولين الداخلي من خلايا الثدييات المعدلة وراثيا ، بما في ذلك بلمرة الأنابيب الدقيقة ، تليها الترسيب باستخدام الطرد المركزي الفائق. يمكن بعد ذلك استخدام التوبولين المستخرج لإعداد شبكات مجهر إلكتروني بالتبريد مع أنابيب دقيقة مرتبطة ببروتين مرتبط بالأنابيب الدقيقة المنقى ذي الأهمية. على سبيل المثال ، نوضح استخلاص الأنابيب الدقيقة التيروزينية بالكامل من خطوط الخلايا المهندسة لتفتقر إلى الإنزيمات الثلاثة المعروفة لإزالة التيوبولين. ثم يتم استخدام هذه الأنابيب الدقيقة لصنع مركب بروتيني مع التيوبولين المرتبط بالأنابيب الدقيقة غير النشطة إنزيميا على شبكات cryo-EM.
الأنابيب الدقيقة هي جزء مهم من الهيكل الخلوي. يشاركون في وظائف مختلفة مثل هجرة الخلايا والانقسام ولكنهم يساهمون أيضا في التنظيم داخل الخلايا. للتكيف مع المصائر الوظيفية المختلفة، تتفاعل الأنابيب الدقيقة مع مجموعة متنوعة من البروتينات المرتبطة بالأنيبيبات الدقيقة (MAPs)، والإنزيمات، والبروتينات الأخرى، والتي سنشير إليها مجتمعة باسم «البروتينات المتفاعلة مع الأنابيب الدقيقة». يمكن توجيه ارتباط الأنابيب الدقيقة لهذه البروتينات بتعديلات توبولين مختلفة ، يشار إليها عادة باسم “رمز التوبولين”1. ومن الأمثلة على هذا التفضيل الكينيسين المرتبط بالسنترومير الانقسامي (MCAK)2 ومجال CAP-Gly من الدينين والدينين CAP-Gly من p1503 ، والذي يفضل أن يرتبط بالتوبولين التيروزين ، في حين أن محركات كينيسين البروتين المرتبط بالسنترومير E (CENP-E)4 و kinesin-25 تفضل التوبولين الذي يفتقر إلى التيروزين C-terminal.
بينما يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الطرق لدراسة تفاعلات البروتين في الأنابيب الدقيقة ، غالبا ما يستخدم المجهر الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) لدراسة هذه التفاعلات بدقة قريبةمن الذرية 6,7. في السنوات الأخيرة ، كشفت هياكل cryo-EM عن كيفية البروتينات الحركية الكبيرة مثل dynein8،9،10 و kinesin 11 ، + بروتينات TIP مثل EB312,13 و MCAK14 ، والبروتينات الأخرى مثل Tau 15,16 ، وحتى الجزيئات الصغيرة مثل باكليتاكسيل ، بيلوروسيد ، وزامبانوليد 17 التفاعل مع الأنابيب الدقيقة. لدراسة تفاعلات الأنابيب الدقيقة والبروتين ، عادة ما يتم استخراج الأنابيب الدقيقة من دماغ الخنزير18. بعد ذلك ، يتم إجراء معظم الدراسات في المختبر ، بما في ذلك هياكل الأنابيب الدقيقة cryo-EM ، باستخدام توبولين دماغ الخنازير. وبالتالي ، فإن نتائج هذه الدراسات تحجب أهمية الطبيعة غير المتجانسة لتعديلات التوبولين19 بين الأنسجة وأنواع الخلايا. هذا يخلق مشكلة معينة عند التحقيق في البروتين الذي يتطلب أو يفضل تعديلا معينا لربط الأنابيب الدقيقة. يمكن توضيح ذلك باستخدام توبولين التيروزين ، الركيزة ل microtubule detyrosinase MATCAP.
Detyrosination هو تعديل توبولين يفتقر فيه إلى التيروزين الأحماض الأمينية C-terminal من α-tubulin ، والذي يرتبط بوظيفة ميتوتيك والقلب والخلايا العصبية20. في حين أن الأنابيب الدقيقة التيروزينية بالكامل هي الركيزة المثالية ل MATCAP ، فإن هذا غائب إلى حد كبير في الأنابيب الدقيقة المتاحة تجاريا من دماغ الخنازير بسبب وظيفة vasohibins 21,22 و MATCAP 23 detyrosinases في هذا النسيج 22،23،24،25،26. على الرغم من أن هيلا توبولين المتاح تجاريا يحتوي في الغالب على أنابيب دقيقة تيروزينية ، إلا أن نزع التيروزين يمكن أن يحدث ، وبالتالي فإن مصدر التوبولين هذا أقل ملاءمة لإنشاء عينة موحدة لتحليل cryo-EM.
لتحفيز ارتباط MATCAP بالأنابيب الدقيقة وإنشاء عينة متجانسة للتحليل الهيكلي ، سعينا للحصول على مصدر للأنابيب الدقيقة التي يتم تيروزينها بالكامل. تحقيقا لهذه الغاية ، تم إنشاء خط خلية MATCAP ونقص vasohibin ، والذي تم استخدامه لاستخراج الأنابيب الدقيقة التيروزينية بالكامل. استند إجراء الاستخراج إلى بروتوكولات راسخة تستخدم دورات متكررة من البلمرة وإزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة لاستخراج التوبولين من أنسجة المخ أو الخلايا18،27،28،29،30 ، مع خطوة بلمرة واحدة فقط والطرد المركزي على وسادة الجلسرين. باستخدام MATCAP كمثال ، نوضح بعد ذلك كيف يمكن استخدام هذه الأنابيب الدقيقة لدراسات cryo-EM. لتحضير شبكات cryo-EM ، يتم وصف بروتوكول تطبيق من خطوتين بتركيز ملح منخفض. تصف الطرق الواردة في هذه الورقة استخراج الأنابيب الدقيقة القابلة للتخصيص بكميات ونقاء كافيين لإجراء تحليل cryo-EM وتوفير بروتوكول مفصل حول كيفية استخدام هذه الأنابيب الدقيقة لإنشاء مجمعات الأنابيب الدقيقة للبروتين على شبكات cryo-EM.
تصف هذه الطريقة كيفية استخراج التوبولين الداخلي بسرعة من خطوط الخلايا ثم تزيين تلك الأنابيب الدقيقة على شبكات cryo-EM. الأنابيب الدقيقة حساسة لدرجة الحرارة. أنها تبلمر في بيئة باردة والبلمرة في بيئة دافئة31. لذلك ، من الأهمية بمكان تنفيذ دوران الصوتنة والتخليص (الخطوات 1.1-1.5) عند 4 درجات مئوية لإذابة التوبولين. إذا كانت هناك أي عوامل تعمل على استقرار الأنابيب الدقيقة بشكل جيد بحيث لا تتبلمر في هذه الخطوة ، التخلص من هذه الأنابيب الدقيقة وعوامل التثبيت في الحبيبات بعد دوران التخليص الأولي. بعد (إعادة) بلمرة الأنابيب الدقيقة ، من المهم الحفاظ على المحلول الذي يحتوي على الأنابيب الدقيقة المبلمرة دافئا في جميع الأوقات. استخلصنا الأنابيب الدقيقة من خلايا HCT116 ، والتي تعاني من نقص في بروتينات VASH1 و VASH2 و MATCAP. يمكن استخدام خطوط الخلايا الأخرى ، وكذلك الأنسجة ، لاستخراج الأنابيب الدقيقة29 ، على الرغم من أن الملوثات والأنماط المتماثلة للتوبولين والمحصول قد تكون مختلفة تماما عما هو موضح هنا. يمكن أيضا استخدام البلازميدات المفرطة في التعبير التي تحتوي على إنزيمات معدلة لإدخال تعديلات توبولين محددة.
تستخدم البروتوكولات الأخرى18،27،28،29،30 دورات متعددة من البلمرة وإزالة البلمرة من الأنابيب الدقيقة للحصول على أنابيب دقيقة خالية من البروتينات المتفاعلة الأخرى. هنا ، قمنا بتبسيط هذه البروتوكولات وبلمرة الأنابيب الدقيقة مرة واحدة فقط. من الممكن أنه بسبب هذه البلمرة المفردة ، قد تشارك هذه الأنابيب الدقيقة في الرواسب مع البروتينات الأخرى المتفاعلة مع الأنابيب الدقيقة. ومع ذلك ، فقد وجدنا أن هذا البروتوكول يعطي أنابيب دقيقة نقية بما فيه الكفاية لأغراض cryo-EM. إذا كانت هناك حاجة إلى عينة أنقى لفحوصات محددة ، فإن دورات إضافية من البلمرة وإزالة البلمرة يمكن أن تنتج عينة أنقى ، على الرغم من أن هذا قد يكون على حساب محصول الأنابيب الدقيقة. في هذا البروتوكول ، استخدمنا باكليتاكسيل لبلمرة الأنابيب الدقيقة. ومع ذلك ، يمكن أن ينحاز باكليتاكسيل إلى شبكة الأنابيب الدقيقة نحو تطور وارتفاع معين ، مما قد يتداخل مع تقارب الأنابيب الدقيقة للبروتين محل الاهتمام. يمكن استخدام كواشف تثبيت الأنابيب الدقيقة الأخرى إذا كان باكليتاكسيل غير مناسب. ومن الأمثلة على هذه الكواشف جزيئات غير تاكسان مثل peloruside أو متغيرات GTP غير القابلة للتحلل المائي مثل GMPCPP17,32.
للتحقيق الهيكلي للبروتينات التي ترتبط بالأنابيب الدقيقة على شبكات cryo-EM ، يحتاج المرء إلى ربط كمية كافية من البروتين الذي يهم الأنابيب الدقيقة. المشكلة الشائعة هي أن مجمعات البروتين المستقرة في المحلول تنهار على الشبكة. لتشكيل مركب البروتين على الشبكة ، كان من الضروري أولا وضع طبقة من الأنابيب الدقيقة ثم تطبيق البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة بتركيز ملح منخفض على الشبكة المغلفة بالأنابيب الدقيقة ، وبالتالي تجميع مركب البروتين مباشرة على الشبكة. أبلغ آخرون بالمثل عن بروتوكول33,34 قليل الملح وبروتوكولتطبيق من خطوتين 34,35,36 لتزيين الأنابيب الدقيقة بنجاح. من المحتمل أن يؤدي انخفاض تركيز الملح إلى تحيز مركب البروتين نحو تفاعل أكثر استقرارا بسبب انخفاض الشحنات الكهروستاتيكية. ومع ذلك ، نظرا لانخفاض تركيز الملح ، فإن البروتين محل الاهتمام معرض لخطر الترسيب. لذلك ، يوصى بشدة بالحفاظ على البروتين عند أو حول تركيزات الملح ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية حتى قبل وقت قصير من تزجيج الشبكات. من المحتمل أن يمنع بروتوكول التطبيق المكون من خطوتين مركب البروتين من الانهيار أثناء خطوات النشاف أو التجميد. في هذا البروتوكول ، استخدمنا Vitrobot. ومع ذلك ، فإن طرق التزجيج الأسرع (VitroJet) أو استخدام الشبكات الخالية من البقع (Puffalot) أو الأجهزة التي لها كلتا الخاصيتين (الحرباء) يمكن أن تتغلب على التطبيق المكون من خطوتين ، ولكن هذه ليست متاحة حاليا على نطاق واسع للاختبار.
يمكن أن تتأثر الدقة النهائية لكثافة cryo-EM المعاد بناؤها بعدد من العوامل ، بما في ذلك حركة البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة بالنسبة إلى الأنابيب الدقيقة ومستوى الزخرفة الذي يمكن تحقيقه. من المحتمل أن تكون زخرفة الأنابيب الدقيقة العالية مفيدة للقرار النهائي الذي تم الحصول عليه في إعادة بناء كثافة 3D. يمكن أن يكون هذا محدودا بعدة عوامل ، مثل أعلى تركيز للبروتين يتم الحصول عليه أثناء تنقية البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة ، وأقل تركيز ملح يمكن أن يتحمله البروتين المتفاعل مع الأنابيب الدقيقة دون تجميع ، وطريقة الربط للبروتين المتفاعل مع الأنابيب الدقيقة (على سبيل المثال ، يمكن أن يمتد البروتين لأكثر من ثنائي توبولين واحد ، مما يعيق نسبة الارتباط 1: 1). على الرغم من أن دقة إعادة بناء cryo-EM قد تتعرض للخطر بسبب الأنابيب الدقيقة ذات الزخرفة القليلة ، إلا أن التحليل الحسابي يمكن أن يتحايل على الكثير من المشكلات ، كما يتضح من بنية معقدة من الأنابيب الدقيقة التي تم الإبلاغ عنها مؤخرا والتي تم تزيينها بشكل ضئيل للغاية8.
يقدم البروتوكول الذي وصفناه هنا طريقة سريعة ومنخفضة التكلفة للحصول على الأنابيب الدقيقة المناسبة لأغراض cryo-EM. على عكس توبولين دماغ الخنازير المتاح تجاريا ، فإن الأنابيب الدقيقة المشتقة من خلايا HCT116 التي تعاني من نقص MATCAP ونقص الفاسوهيبين هي تيروزين بالكامل (الشكل 4). توبولين HeLa التجاري ، وهو كاشف باهظ الثمن ، من حيث المبدأ ، هو تيروزين موحد نسبيا ويحتوي على القليل من التعديلات الأخرى4 مثل الغلوتاميل ، ولكن قد تختلف الدفعات ، ولا يمكن تحقيق التعديل إلا في المختبر. تتمثل إحدى مزايا استخراج الأنابيب الدقيقة من خطوط الخلايا المصممة خصيصا في المرونة التي يتمتع بها المرء للإفراط في التعبير عن الإنزيمات المعدلة للتوبولين أو حذفها ، مثل التيروزيناز التوبولين ، لإنشاء مجموعة أكثر تجانسا من الأنابيب الدقيقة. يمكن أن يفيد ذلك زخرفة وتوحيد عينة cryo-EM وسيفيد في النهاية سهولة وجودة خرائط كثافة cryo-EM والهياكل الجزيئية المشتقة من هذه العينة.
The authors have nothing to disclose.
نشكر جميع أعضاء مجموعات Sixma و Brummelkamp و Perrakis على مناقشاتهم العلمية المثمرة وعلى توفير بيئة عمل ممتعة ، وعلى وجه التحديد ، نشكر Jan Sakoltchik (“الشخص 2”) للمساعدة في تحديد تركيز البروتين الموضح في الشكل 3C. نود أيضا أن نشكر مرفق NKI cryo-EM والمركز الهولندي للتنظير الإلكتروني النانوي (NeCEN) في جامعة ليدن على دعمهم. تم دعم هذا العمل من خلال منحة NWO Vici 016.Vici.170.033 الممنوحة ل T.R.B.. A.P. و T.R.B. هما محققان في Oncode ويتلقيان تمويلا من NWO ENW (OCENW. M20.324). تلقت L.L. تمويلا من صندوق العلوم النمساوي (FWF JB4448-B). تم دعم هذا البحث بمنحة مؤسسية من جمعية السرطان الهولندية ووزارة الصحة والرعاية الاجتماعية والرياضة الهولندية.
Material | |||
0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Cell culture |
10 cm plate | Falcon | 353003 | Cell culture |
15 cm plate | Thermo FisherScientific | 168381 | Cell culture |
50 mL tubes | Sarstedt | 62.547255 | Cell culture |
300 mesh quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3 | Quantifoil Micro Tools | N1-C14nCu30-01 | Cryo-EM grid preparation |
Cell scrapers | Falcon | 353085 | Cell culture |
DMEM | Gibco | 41966-029 | Cell culture |
EDTA | Merck | 108418 | Cell culture |
EGTA | Sigma Aldrich | E3899 | Microtubule extraction |
Ethane gas | Cryo-EM grid preparation | ||
FCS | Serana | s-FBS-EU-015 | Cell culture |
Glycerol | VWR | 24.397.296 | Microtubule extraction |
GTP | Fisher Scientific | G8877-1G | Microtubule extraction |
HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO cells | self made | Wild type HCT116 cells RRID: CVCL_0291 | Cell culture |
KOH | Merck | 1.05033 | Microtubule extraction |
MgCl2 | Merck | 105833 | Microtubule extraction |
Microtubule binding protein | self made | Cryo-EM grid preparation | |
Needle | BD microlance | 300600 | Microtubule extraction |
Paclitaxel | Santa Cruz Biotechnology | sc-212517 | caution toxic, microtubule extraction |
PBS | Fisher Scientific | BP399 | Cell culture |
Penicillin and streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | Cell culture |
PIPES | Merck | P8203 | Microtubule extraction |
PMSF (in EtOH) | Roche | 16837091001 | Microtubule extraction |
SDS sample buffer | self made | Quality assessment | |
Syringe | BD plastipak | 309658 | Microtubule extraction |
Ultra protease tables mini | Fisher Scientific | NC0975224 | Microtubule extraction |
Whatman blotting paper | Whatman | 47000-100 | Cryo-EM grid preparation |
Equipment | |||
Flow hood | cell culture | ||
GloQube | Quorum | Cryo-EM grid preparation | |
Grid storage box | SWISSCI | 41018 | Cryo-EM grid storage |
Heating block, electric or metal | to warm the buffers | ||
Incubator, cell culture | NUAIR | cell culture | |
LN2 dewar | Cryo-EM grid storage | ||
Plunge-tweezers | Electron Microscopy Sciences | 0508-L5-PS | Cryo-EM grid preparation, hole drilled in top to fit the vitrobot |
Polystyrene box | to keep the buffers warm | ||
Sonicator | Qsonica | Q700 | Microtubule extraction |
Standard light microscope | Olympus | CKX 41 | Quality assessment |
TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
Tubes for TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | 326819 | Microtubule extraction |
Tubes for TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | 347356 | Microtubule extraction |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Microtubule extraction |
Vitrobot | FEI, ThermoFischer Scientific | mark IV | Cryo-EM grid preparation |
Vitrobot polystyrene container assembly with metal ethane cup | ThermoFisher Scientific | 200703 | Cryo-EM grid preparation |
Water bath | cell culture |