달걀 노른자 항체를 기반으로 한 세포 측정 비드 분석의 표준화
Summary
이 프로토콜은 항원 검출을 위해 IgY 항체를 사용하여 분석용 라텍스 비드를 제조하는 방법론을 설명합니다.
Abstract
면역 측정법은 수많은 분자 표적의 검출을위한 중요한 검사입니다. 현재 사용 가능한 방법 중에서 세포 측정 비드 분석은 최근 수십 년 동안 두각을 나타내고 있습니다. 장비에서 판독하는 각 마이크로스피어는 테스트 중인 분자 간의 상호 작용 용량에 대한 분석 이벤트를 나타냅니다. 이러한 수천 개의 이벤트가 단일 분석에서 판독되므로 높은 분석 정확도와 재현성이 보장됩니다. 이 방법론은 질병 진단을 위한 IgY 항체와 같은 새로운 투입물의 검증에도 사용할 수 있습니다. 이 항체는 관심 항원으로 닭을 면역시킨 다음 동물 알의 노른자에서 면역 글로불린을 추출하여 얻습니다. 따라서 이것은 항체를 얻기위한 고통이없고 매우 생산적인 방법입니다. 이 분석법의 항체 인식 능력에 대한 고정밀 검증을 위한 방법론 외에도 이 논문은 이러한 항체를 추출하고, 항체와 라텍스 비드에 대한 최상의 결합 조건을 결정하고, 검사의 민감도를 결정하는 방법을 제시합니다.
Introduction
질병 진단을 목표로 하는 면역분석 기법 중에서, 세포측정 비드 분석법은 단일 분석법으로 수천 개의 입자를 분석할 수 있기 때문에 매우 민감하고 신뢰할 수 있는 접근법으로 부상하고 있다1. 이 기술은 생산성이 높고 소량의 샘플을 사용할 수있을뿐만 아니라 사이토 카인, 접착 분자, 항체 이소 타입 및 단백질 2,3과 같은 여러 분자를 검출 할 수 있기 때문에 유연성이 뛰어납니다.
이러한 분석법의 개발에는 다양한 입자가 사용되며, 그 중 라텍스 비드는 효과적이고 저렴한 투입물입니다. 이들은 특정 분자의 공유 또는 비공유 결합을 허용하는 작용기 또는 단백질의 존재와 같은 표면에 변형을 나타낼 수 있습니다 3,4,5.
이러한 면역검정은 항원 및 항체와 같은 성분을 사용하여 질병 마커의 검출을 수행하며 일반적으로 생쥐, 토끼 및 염소와 같은 포유류의 항체를 필요로 합니다. 이것은 포유류의 예방 접종이 일반적으로 많은 동물들이 좋은 수확량을 얻을뿐만 아니라 동물의 고통을 초래하는 절차의 빈번한 수행을 요구하기 때문에 윤리적 문제와 관련된 문제를 야기한다 6,7. 이에 대한 대안은 접종 된 항원에 대한 고농도의 특정 항체가 노른자에서 발견 될 수 있기 때문에 면역 화 된 닭의 난황에서 분리 된 IgY 항체를 사용하는 것입니다. 닭의 생산은 6,7 년 동안 4.3 마리의 토끼를 생산하는 것과 같습니다.
따라서, 이 프로토콜의 목적은 라텍스 비드를 이용한 유세포 분석을 사용하여 닭고기 달걀 노른자로부터 수득된 IgY 항체를 평가하는 방법을 제공하는 것이다. 이를 위해 라텍스 비드를 이용한 샌드위치 형태의 세포측정 비드 면역분석법의 표준화 방법을 제안한다. 모델로서 우리는 Plasmodium falciparum 히스티딘이 풍부한 단백질 II 항원(IgY-Pf HRP2)에 대한 IgY 항체를 사용했습니다. 우리는 항체를 추출하는 방법을 설명하고, 라텍스 비드에 대한 이들의 결합 농도를 정의하기 위한 중요한 단계를 논의하고, 항원 검출 한계에 대한 평가를 제시합니다. 유세포 분석의 높은 정확도와 저렴한 라텍스 비드 비용으로 인해 이 기술은 항체 및 항원과 같은 면역분석 도구의 분석에 적용할 수 있습니다. 이 방법은 다양한 표적을 탐지하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
pH 감소에 의한 IgY 항체의 침전 후 카프릴산을 이용한 지질 분리의 방법은 기능성 손실 없이 전체 항체를 분리하는데 효율적이다. 여기에서 제안된 방법은 Redwan et al.11에 의해 보고된 방법보다 간단하고 저렴하며, 산성화 및 카프릴산에 의한 침전도 사용했지만 더 복잡하고 힘든 프로토콜을 사용했습니다. 이 방법은 또한 PEG 침전 12,13, 황산나트륨 14,15 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
장학금을 제공해주신 FIOCRUZ (“Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA”), 생명공학 대학원 프로그램(PPGBIOTEC at the Universidade Federal do Amazonas – UFAM), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) 및 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM)에 장학금을 제공해주신 데 대해 감사드립니다. 그림 2와 그림 4는 biorender.com 로 만들어졌습니다.
Materials
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Caprilic acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Chloride 37% acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Sodium hydroxide | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
| Sodium hypochlorite | Acs Cientifica | R09211000 | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R |
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