Sonodynamische Therapie zur Behandlung des Glioblastoma multiforme im Mausmodell unter Verwendung eines tragbaren fokussierten Ultraschallsystems

Alle Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Johns Hopkins University genehmigt und durchgeführt. Athyme nackte weibliche Mäuse (Alter: 10 Wochen) wurden aus kommerziellen Quellen bezogen (siehe Materialtabelle). Alle Vorschriften der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) wurden eingehalten, einschließlich der Verwendung von Masken, Handschuhen und Kitteln. 1. Tumorimplantationen und Biolumineszenz-Bildgebung In der Anfangsphase der Studie ist eine intrakranielle Tumorimplantation durchzuführen, die einem zuvor veröffentlichten Berichtfolgt 6.HINWEIS: In dieser Studie wurden 100.000 menschliche M59-GBM-Xenotransplantatzellen in 4 μl Zellsuspension für die Implantation in einer Tiefe von 3,0 mm in den Schädel verwendet. Quantifizieren Sie vor der Behandlung die Tumorgröße in jeder Maus nichtinvasiv mit einem In-vivo-Lumineszenz-Bildgebungssystem (siehe Materialtabelle) gemäß einem zuvor veröffentlichten Bericht7.HINWEIS: Dies geschah am Tag der Behandlung, 7 Tage nach der ersten Tumorimplantation. Mit Hilfe der bildgebenden Quantifizierung werden die Mäuse für die Behandlung in vergleichbare Untergruppen eingeteilt.ANMERKUNG: In dieser Studie wurden zwei Untergruppen eingeschlossen: (1) unbehandelte tumortragende Mäuse (n = 4) und (2) tumortragende Mäuse, die sich einer SDT unterzogen (n = 4). Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied in der Tumorgröße vor der Behandlung zwischen den beiden Gruppen beobachtet (p > 0,05). 2. Einrichtung des Behandlungstages 5-ALA-Hydrochlorid (siehe Materialtabelle) aus dem Gefrierschrank nehmen und 200 mg/kg Mausgewicht 5-ALA abwiegen (z. B. für eine 25 g Maus 5 mg abwiegen). Tun Sie dies nur bei Umgebungslicht.HINWEIS: Sterilisieren Sie alle Geräte vor dem Gebrauch. Die Gesamtmenge an 5-ALA wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst, so dass jedem Tier eine 60 mg/ml-Lösung von 5-ALA mit der richtigen Gewichtsdosis verabreicht wird (z. B. für eine 25-g-Maus 5 mg 5-ALA in 83,33 μl PBS auflösen). Für jedes Tier in der SDT-Testgruppe wird die richtige Menge der Lösung von 5-ALA intraperitoneal in das Tier injiziert (berechnet in den Schritten 2.1 und 2.2). Lassen Sie die Tiere 3 Stunden in ihren Käfigen, um das 5-ALA zu verstoffwechseln. 3. Vorbereitung der Voraussetzungen für Versuche Füllen Sie einen Behälter mit deionisiertem Wasser (DI).HINWEIS: Die benötigte Wassermenge basiert auf der Anzahl der Mäuse, die in der Studie verwendet wurden. Befestigen Sie die Flow-In- und Flow-Out-Rohre am Ultraschall-Entgaser (siehe Materialtabelle) und schließen Sie den Entgaser an die Stromversorgung an (1 = ON, 0 = OFF). Stecken Sie das andere Ende der Flow-In – und Flow-Out-Schläuche in den DI-Wasserbehälter. Schalten Sie den Entgaser ein und lassen Sie ihn 45 Minuten lang laufen. Füllen Sie das frisch entgaste Wasser bis zum Oberteil eines luftdichten, verschlossenen Behälters, der während der Studie verwendet werden soll. Gießen Sie Ultraschallgel (siehe Materialtabelle) in ein konisches Röhrchen, geben Sie es dann in eine Zentrifuge und schleudern Sie es 5 Minuten lang bei 160 x g , um dem Gel Luft zu entziehen.HINWEIS: Es wird genügend Gel benötigt, um einen Klecks Gel auf dem Kopf jedes Tieres zu bilden. 4. Einrichtung des MRgFUS-Systems Schließen Sie das MRgFUS-System (siehe Materialtabelle) anhand des Schaltplans an, wie in Abbildung 1 (untere Tafel) zu sehen ist.Schließen Sie alle notwendigen Komponenten (Desktop-Computer, Monitor, MRgFUS-Plattform, Oszilloskop, Verstärker) an die Stromversorgung an. Schließen Sie alle Kabel an die richtigen Stellen an. Verbinden Sie den gewünschten Wandler über die BNC- und Koaxialkabel mit der MRgFUS-Plattform und verbinden Sie dann die entsprechende Impedanzanpassungsbox mit den richtigen Drähten.ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie wurde ein 515-kHz-Wandler verwendet. Schalten Sie alle Geräte ein. Öffnen Sie auf dem Betriebssystem des Desktop-Computers die AUREUS-Anwendung, die bereits in die FUS-Systemsoftware integriert ist. Wählen Sie Alle Hardware verbinden aus, um die Hardware mit dem System zu verbinden und sicherzustellen, dass die Komponenten mit der Software kommunizieren. Wählen Sie den verwendeten Wandler aus, indem Sie das Dropdown-Menü auswählen und den gewünschten Wandler auswählen. 5. Initialisierung Lösen Sie die untere Schraube vom Phantom und füllen Sie den Hohlraum mit deionisiertem und entgastem Wasser, bis es überläuft, und setzen Sie dann die Schraube wieder ein. Setzen Sie das Phantom in die entsprechende Position des MRT-Bettes ein (siehe Abbildung 2) und legen Sie das MRT-Bett dann in die MRT-Halterung im entsprechenden Schlitz. Platzieren Sie die MRT-Halterung an der entsprechenden Stelle im MRT-Scanner (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Halterung so ein, dass das Phantom-MRT-Bett ohne Hindernisse in die MRT-Bohrung gleiten kann, um ein qualitativ hochwertiges Bild des Phantoms zu erhalten. Markieren Sie diesen Speicherort, damit er in Zukunft leicht repliziert werden kann.HINWEIS: Sobald diese Stelle gefunden wurde, wird sie für den Rest der Behandlung nicht mehr geändert. Stellen Sie daher sicher, dass es sich um einen geeigneten Ort für die MRT-Platzierung des Tieres handelt, da sonst die gesamte Registrierung wiederholt werden muss. Nehmen Sie einen MRT-Scan des Phantoms mit den Einstellungen in Tabelle 1 vor. Entfernen Sie die Halterung aus der Magnetbohrung, aber lassen Sie sie auf dem Scanner. Nehmen Sie das MRT-Bett mit dem Phantom aus der Halterung und stellen Sie das Bett mit dem Phantom auf das MRgFUS-System, indem Sie den Stift an der Unterseite in den richtigen Schlitz schieben. Setzen Sie die Registrierungsspitze so auf die magnetischen Schlitze am Wandlerarm, dass sie nach unten in Richtung des Phantoms zeigt (siehe Abbildung 2). Wählen Sie in der Software “Neue Ausgangsposition auswählen” und dann “Jog-Modus ein “, um mit der geführten fokussierten Suche zu beginnen. Nachdem der Jog-Modus umgeschaltet wurde, verwenden Sie die Tasten links, rechts, oben, unten, Bild auf und Bild-ab, um den Wandlerarm manuell in die Richtung links, rechts, vorwärts, rückwärts, oben und unten zu bewegen. Stellen Sie den Zeiger manuell in allen drei Dimensionen ein, bis die Spitze des Zeigers die Mitte des Kreuzmusters berührt, das auf der Oberseite des Phantoms liegt (siehe Abbildung 2). Laden Sie die Phantom-MRT-Bilder auf den Computer herunter und legen Sie sie in einem Ordner im ausgewählten Verzeichnis ab, und laden Sie dann die MRT-Bilder in die Software, indem Sie Phantombilder laden auswählen. Die axialen Phantomschichten bevölkern dann den Bildschirm auf der rechten Seite. Scrollen Sie mit der Bildlaufleiste der Maus durch diese Slices. Passen Sie die Helligkeit an, indem Sie auf das Bild klicken und es gedrückt halten und dann die Maus nach oben oder unten bewegen.HINWEIS: Wenn es sich bei einer der Dateien im Ordner nicht um unkomprimierte DICOM-Dateien handelt, kann die Software sie nicht lesen und importieren, also entfernen Sie alle anderen Dateien aus diesem Ordner. Scrolle zu einem beliebigen Bild des Phantoms, in dem sich ein klarer Kreis mit jeweils drei dunklen Löchern befindet. Klicken Sie auf die Mitte des Phantoms, und es erscheint ein roter Kreis. Klicken Sie auf den Kreis, und ziehen Sie ihn, bis er den gleichen Durchmesser hat und mit dem Umfang des Phantoms übereinstimmt (siehe Abbildung 2). Die Koordinaten dieser Position werden als “Ausgangsposition” bezeichnet. Speichern Sie diese, indem Sie auf Set L/R, A/P und S/I klicken. Klicken Sie auf Jog-Modus aus, entfernen Sie die Registrierungsspitze vom Schallkopfarm und wählen Sie dann Fokussuche beenden. Bestätigen Sie die Ausgangsposition, um die Initialisierungssequenz abzuschließen. 6. Vorbereitung von Tieren auf SDT Betäubung der Maus mit einem Isofluran-O2-Gasgemisch in einer Induktionskammer. Stellen Sie die Gasdurchflussrate auf 1,0 ml/min und den Verdampfer auf 2,0 % für die Anästhesieeinleitung ein, was in der Regel 3-5 Minuten in der Kammer erfordert (siehe Materialtabelle). Beurteilen Sie das Tier auf eine ausreichende Sedierung, indem Sie in den Zeh kneifen. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit der Hornhaut zu vermeiden.HINWEIS: Überwachen Sie die Anästhesietiefe während des gesamten Eingriffs. Injizieren Sie der Maus 40 μl Gadolinium-Kontrastmittel durch die Schwanzvene (siehe Materialtabelle). Entfernen Sie alle Haare, die die Kopfhaut oberhalb des Schädels behindern, mit einer Haarentfernungscreme und einem elektronischen Rasierer. Befestigen Sie das Tier mit den folgenden Schritten am MRT-Bett (siehe Abbildung 3).Schließen Sie das Einlassrohr des MRT-Bettes (Abbildung 3A) für die Anästhesie an eine Isofluranquelle an und stellen Sie die Gasflussrate auf 1,0 ml/min und den Verdampfer auf 2,0 % für die Anästhesieeinleitung ein. Schließen Sie das Auslassrohr an einen Aktivkohlefilterbehälter an, um die Anästhesie zu absorbieren. Setzen Sie das Nasenkonusstück in seinen Schlitz ein, wie in Abbildung 3B gezeigt. Schieben Sie die Beißstange durch die Beißstangenlöcher sowohl im Nasenkonus als auch am Ende des Bettes, wie gezeigt, wobei das Ende des Beißschutzes über der offenen Vertiefung im MRT-Bett schwebt. Legen Sie das Tier auf das MRT-Bett, wobei die Ohren mit den stereotaktischen Ohrbügellöchern ausgerichtet sind, und stecken Sie seine Zähne durch den Beißschutz, um ihn an Ort und Stelle zu halten. Schieben Sie den Nasenkonus nach vorne, so dass er sich über der Schnauze des Tieres befindet, um einen gleichmäßigen Anästhesiestrahl zu gewährleisten. Schieben Sie die Ohrbügel durch die Löcher auf beiden Seiten des MRT-Bettes und heben Sie den Kopf des Tieres an, bis beide Ohrstangen in die Gehörgänge der Maus passen.HINWEIS: Drücken Sie nicht zu weit, da dies das Trommelfell des Tieres beschädigen kann. Stellen Sie sicher, dass sich das Tier in einer bequemen Position befindet. Schrauben Sie dann mit einem Schlitzschraubendreher die MRT-kompatiblen Schrauben ein, um beide Ohrstangen, den Nasenkonus und die Beißstange zu verriegeln. Dadurch wird das Tier fixiert und jede Kopfbewegung verhindert, bis das Tier aus dem Bett genommen wird.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Positionierung des Tieres auf dem MRT-Bett nach diesem Schritt nicht gestört wird. Wenn sich das Tier bewegt, muss die gesamte Einrichtung (Schritt 6.5) wiederholt werden, unabhängig davon, wie weit das Protokoll fortgeschritten ist. Während das Tier wartet, legen Sie das MRT-Bett auf ein warmes Wärmekissen, um die Körpertemperatur zu halten.HINWEIS: Überwachen und halten Sie die Körpertemperatur während des gesamten Eingriffs. Isofluran wird dem Tier während der gesamten Behandlung kontinuierlich über Schläuche zugeführt, die an den Nasenkegeln befestigt sind, wenn das Tierbett mit den auf der Plattform vorgesehenen Halterungen auf dem FUS-System befestigt ist. 7. MRT-Verfahren Nehmen Sie das MRT-Bett mit dem stereotaktisch fixierten Tier und legen Sie es in die MRT-Halterung, die zuvor mit dem MRT-Scanner verbunden war (siehe Materialtabelle), indem Sie das MRT-Bettloch an seinem Ende an den Stift der MRT-Halterung stecken, wie in Abbildung 3 gezeigt. Befestigen Sie die Ein- und Auslass-Anästhesieschläuche an den entsprechenden Schläuchen im MRT-Gerät. Schieben Sie die MRT-Halterung mit dem Tier in die MRT-Bohrung und achten Sie darauf, dass Sie die gleiche Position beibehalten, in der das Phantom platziert wurde. Führen Sie einen Lokalisierer durch, um die Position des Tiergehirns zu sehen, und führen Sie dann einen T1-gewichteten MRT-Scan nach dem Kontrast durch, der das gesamte Gehirn mit den MRT-Einstellungen aus Tabelle 2 abdeckt. Exportieren Sie den MRT-Scan als einen Satz unkomprimierter DICOM-Dateien, eine für jede Schicht. 8. Fokussierte Ultraschallbehandlung (Abbildung 4) Nehmen Sie das Tier nach Abschluss des Scans aus der MRT-Halterung und legen Sie es auf die Plattform, indem Sie die Vorderseite des Bettes in den entsprechenden Stift an der Rückseite der Plattform stecken und die Rückseite des Bettes in den entsprechenden Stift stecken. Schließen Sie das Einlassrohr des MRT-Bettes für die Anästhesie an eine Isofluranquelle an und stellen Sie die Gasflussrate auf 1,0 ml/min und den Verdampfer auf 2,0 % ein, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Schließen Sie das Auslassrohr an einen Aktivkohlefilterbehälter an, um die Anästhesie zu absorbieren. Übertragen Sie die DICOM-Dateien auf den Computer und legen Sie sie in einem Ordner im Hauptarbeitsverzeichnis der aktuellen Studie ab.HINWEIS: Informationen zu den Dateianforderungen finden Sie in Schritt 5.9. Gehen Sie in der Software auf die Hauptinitialisierungsseite und aktivieren Sie den Jog-Modus , indem Sie auf Guided Focus Finding und dann auf Jog Mode On klicken. Geben Sie einen Klecks zentrifugiertes Ultraschallgel auf den Kopf des Tieres, mit genügend Gel, um die gesamte Kopfhaut über dem Schädel zu bedecken. Gießen Sie DI und entgastes Wasser bis zu 80 % in das Wasserbad und setzen Sie das Wasserbad dann auf die entsprechenden Säulen auf der Plattform. Senken Sie das mit DI-Wasser gefüllte Wasserbad ab, bis die untere Membran das Ultraschallgel auf dem Kopf des Tieres berührt und eine Kopplungsfläche zwischen Wasser und Gel bildet. Achten Sie darauf, dass das Ultraschallgel den gesamten Kopf des Tieres bis zum Wasserbad bedeckt und dass sich keine Luftblasen im Ultraschallgel zwischen dem Wasserbad und der Kopfhaut der Maus befinden. Tauchen Sie den Ultraschallwandler in das Wasserbad ein und stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen auf der Oberfläche des Schallkopfes bilden. Senken Sie den Wandlerarm mit dem Jog-Modus nach unten in Richtung des teilweise untergetauchten Wandlers und koppeln Sie ihn mit dem Wandler, indem Sie die magnetischen Schlitze zueinander ausrichten, während die Wandleroberfläche untergetaucht bleibt. Deaktivieren Sie den Jog-Modus und dann die Option “Fokussierte Suche beenden”, wie Sie es während des Initialisierungsschritts getan haben. Stellen Sie sicher, dass Sie die Ausgangsposition wie zuvor bestätigen. Wechseln Sie zur Registerkarte “Behandlung” und laden Sie dann die T1-gewichteten MRT-Dateien nach dem Kontrast hoch, indem Sie auf das Ordnersymbol oben in der Mitte des Bildschirms klicken. Wählen Sie den Ordner mit den DICOM-Dateien aus, die zuvor auf den Computer hochgeladen wurden, und öffnen Sie sie. In diesem Schritt sollten automatisch alle DICOM-Dateien im oberen rechten Bereich geladen werden. Wählen Sie als Nächstes auf der Registerkarte Beschallungsmodus den richtigen Behandlungsmodus aus, indem Sie entweder Burst oder Continuous Wave auswählen. Wenn Sie sich im Burst-Modus befinden, geben Sie auf der Registerkarte Beschallungseinstellungen die Burst-Länge, die Burst-Periode und die Anzahl der Perioden ein. Diese Parameter entsprechen jedem Beschallungsort. Wenn Sie sich im Dauerstrichmodus befinden, geben Sie nur die Beschallungsdauer ein.HINWEIS: In dieser Studie wurde der Dauerstrichmodus für eine Dauer von 120 s verwendet. Klicken Sie auf das Zielsymbol oben in der Mitte der Seite und wählen Sie die richtigen Stellen auf der richtigen MRT-Schicht aus, an denen die FUS-Fokusregion anvisiert werden soll. An der angeklickten Stelle wird ein hellrotes Quadrat mit einem roten Kreis angezeigt. Es kann mehr als eine Auswahl ausgewählt werden. Links neben dem MRT-Bild befindet sich eine Tabelle, die mit den 3D-Koordinaten der ausgewählten Fokusregionen gefüllt wird. Geben Sie in der letzten Spalte der Tabelle die zu beschallende Leistung an jedem Brennfleck ein, die für jeden verwendeten Schallkopf separat berechnet werden kann, um die gewünschten Druck- oder Intensitätsstufen zu erhalten. Klicken Sie zur Bestätigung auf jeden Fokuspunkt in der Tabelle, was dazu führt, dass die Koordinaten hervorgehoben werden und der entsprechende Fokusbereich auf dem Bild blau wird.HINWEIS: Lesen Sie das Datenblatt des Messumformers, um zu bestimmen, wie der in der Tabelle eingegebene Leistungspegel in Druck oder Intensität umgerechnet wird, da diese Werte aufnehmerspezifisch sind. Wenn Sie mit allen Fokusbereichen zufrieden sind, wählen Sie Bewegungstest. Dadurch wird die Software aufgefordert, den Schallkopf zu allen Brennpunkten zu bewegen, um sicherzustellen, dass die Bewegungen möglich sind. Nach der Bestätigung zeigt die Software ” Bewegungstest abgeschlossen” an. Wenn ein Fehler auftritt, stellen Sie die Fokusbereiche so ein, dass sie in die 3D-Achsen der Wandlermotoren passen. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie Beschallung beginnen, um das Beschallungsprotokoll zu starten, indem Sie den Schallkopf bewegen und die richtigen FUS-Parameter auf jede ausgewählte Fokusregion anwenden. Sobald das Beschallungsprotokoll abgeschlossen ist, entkoppeln Sie den Schallkopf vom Schallkopfarm, entfernen Sie das Wasserbad von der Plattform und wischen Sie das Ultraschallgel von der Kopfhaut des Tieres ab. Schrauben Sie die Gebiss- und Ohrstangen ab, nehmen Sie das Tier aus dem MRT-Bett und legen Sie es dann auf eine warme Unterlage, bis das Tier aus der Narkose erwacht. An dieser Stelle bringst du das Tier wieder in seinen Käfig zurück. Bei den nachfolgenden Tieren ist das gleiche Protokoll ab Abschnitt 6 zu wiederholen. Sobald die gewünschten Tiere behandelt sind, reinigen Sie alle Oberflächen, die von Tieren berührt werden, mit 70%igem Ethanol (siehe Materialtabelle). Beenden Sie die Software, und fahren Sie dann jedes Gerät herunter und schalten Sie es aus. 9. Schritte nach der Behandlung Wiederholen Sie das In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS)-Protokoll aus Abschnitt 1 für Biolumineszenzmessung 24 Stunden nach der Behandlung. Um die Wirksamkeit der Behandlung zu analysieren, vergleichen Sie die Biolumineszenzaufzeichnungen vor und nach der Behandlung, um die Wachstumsrate sowohl für behandelte als auch für unbehandelte Gruppen zu bestimmen. Führen Sie MRT-Folgeuntersuchungen mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 6.4 durch. Vergleichen Sie mit kontrastmittelverstärkten Scans die mittlere Graustufenintensität der Tumorregion oder berechnen Sie das Gesamtvolumen, das mit dem Kontrastmittel abgedeckt wird, um Unterschiede im Tumorvolumen vor und nach der Behandlung zu ermitteln.