在大鼠模型中使用低强度聚焦超声破坏血脊髓屏障

所有动物研究均根据约翰霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会（IACUC RA20M223）的批准和进行。本研究仅使用成年Sprague-Dawley雌性大鼠（平均体重：250g;年龄：11周）。 1. 低强度聚焦超声组装和设置 获得一个聚焦的超声换能器系统，其规格足以在大鼠中实现BSCB开放。文献中建议的参数包括 0.25-4 MHz 之间的中心频率和产生 0.2-2.1 MPa 10、14、15、16、17 之间峰值压力的能力。确保系统包括驱动/控制设备，其中至少包括波/信号发生器、射频 （RF） 驱动器/功率放大器和匹配网络（图 2A）。注意：此处描述的设置使用市售的多元件换能器，中心频率为 250 kHz，直径为 64 mm（图 2B）。 将3D打印的探头支架和水锥固定在换能器上（图2C）。确保锥体和换能器之间的防水密封。注意：本实验中使用的换能器随附一个定制的锥体和探头支架。锥体和探头支架用螺钉固定在传感器上，螺钉也提供。 对 50 μm 厚的透声聚酯膜进行消毒，并使用橡皮筋固定在水锥底部。 使用进水管和出水管用脱气和去离子水填充水锥。注意避免锥体内有气泡，因为它们会破坏换能器和目标之间的声耦合。聚酯膜应略微膨胀。注意： 要去除锥体中的气泡，请将气泡引导到出口阀，同时通过进水阀向锥体注水。如果存在许多小气泡，请关闭所有阀门并旋转锥体，直到留下一个大气泡。将此气泡引导至出口阀并继续填充锥体。 将驱动设备（包括波发生器和射频驱动放大器）连接到换能器。换能器电缆将连接到匹配网络的输出侧，信号发生器/功率放大器将连接到匹配网络的输入侧。电缆应连接到相应的通道号（图 2D-G）。注：在本研究中使用的商业系统中，波发生器和射频驱动放大器是换能器功率输出（TPO）的组成部分（图2D）。 将探头支架连接到立体定向臂上。将立体定向臂固定在固定板组件上。这将允许在超声处理过程中将换能器精确定位在啮齿动物上方。 2. 动物准备和手术椎板切除术 在连接到木炭过滤罐的诱导室中用异氟醚和医用空气的混合物麻醉大鼠。将气体流速设置为 400 mL/min，将异氟烷汽化器设置为 1.5%-2.5% 之间进行麻醉诱导。在完全镇静之前在腔室中花费的时间是可变的，尽管通常在 3-6 分钟之间。 记录镇静大鼠的体重并进行脚趾捏试验。如果观察到对捏合做出反应的抽搐或运动，则将大鼠放回诱导室内再放置1分钟，并重复脚趾捏合试验。必要时重复以确保大鼠处于并保持完全麻醉状态。 将加热垫和无菌吸收垫放在固定板上。将大鼠放在吸收垫上，涂抹眼药膏，并放置直肠温度计以监测体温。注意：在手术过程中，应监测大鼠的体温和心率（理想情况下，心率应在 330-480 bpm 之间，温度应在 35.9-37.5 °C 之间）18,19。相应地调整异氟烷或加热垫，以防止过早死亡。加热垫的温度可以设置为37°C左右，应根据需要打开和关闭，以保持最佳体温。 触诊大鼠的最后一根肋骨，该肋骨附着在第13胸 椎（T13）的脊柱上。使用电动剃须刀剃掉最后一根肋骨和颈部之间背部表面的毛发。用蘸有10%碘泊酮的纱布擦拭裸露的皮肤。 使用虹膜剪刀创建一个中线切口，并解剖筋膜，直到暴露棘突和椎板。用偏置骨钳和倾斜的刀片虹膜剪刀去除骨头，直到脊髓暴露20.椎板切除术和切口的长度根据要超声处理的不同靶标的数量而变化。在这项研究中，使用 3 cm 切口进行了三节段椎板切除术。注意： 移除骨头时避免触摸脊髓或对脊髓施加压力，以防止受伤。如果大鼠的后肢在椎板切除术期间抽搐，则对脊髓或神经根施加了过多的力。 通过夹紧与椎板切除术相邻的棘突将大鼠固定在固定板上。在锁定夹子之前，轻轻拉紧脊柱以尽量减少曲率。 3. 使用激光制导进行目标定位 用立体定向臂调整换能器的位置，直到它位于椎板切除术的正上方（图3A）。该框架允许在 x、y 和 z 轴上移动，以及在垂直平面上旋转 180°，在水平面上旋转 360°。 将激光设备固定在水锥底部并降低，直到看到激光点。调整换能器的横向位置，直到激光点高于BSCB破坏目标的位置（图3B，C）。注意：激光设备的计算机辅助设计 （CAD） 文件包含在补充部分（补充图 1）中。 移除激光装置并用脱气超声凝胶填充锥体和脊髓之间的空间（图3D）。为了获得最大的偶联性，请确保凝胶中不存在气泡。注意：在这项研究中，将带有固定水锥的换能器降低，直到位于绳索上方 1 厘米处。由于水锥的长度为 30 mm，因此从换能器到绳索的总距离为 40 mm。将水锥放置在距离脊髓 1 厘米处，因为切口两侧的大鼠皮肤、筋膜和肌肉组织阻止了锥体尖端和脊髓之间的直接接触。使用立体定向臂 y 轴上的数字可能有助于跟踪锥体与绳索距离 1 cm 的垂直距离，特别是因为凝胶会使视锥体与绳索的距离难以视觉确认。 在 TPO 上设置超声处理参数。一系列值可用于实现成功的 BSCB 中断。为了获得最大功率，将超声处理频率设置在靠近换能器中心频率的位置。本研究中使用的值列于 表1中。注：此处列出的参数改编自 LIFU 之前的工作，中心频率为 500 kHz，音突发持续时间为 500 μs，占空比为 50%，超声处理时间为 5 或 10 分钟，以安全地神经调节啮齿动物脊髓21。根据成功实现 BSCB 破坏的研究，可以使用的其他参数包括 500 kHz-1 MHz 之间的中心频率、0.2-2.1 MPa 的压力、10-25 ms 的突发长度和 2-5 分钟的超声处理时间6、10、11、22。 参数 价值 频率 （kHz） 250 焦距 （mm） 40 声峰值压力（MPa） 0.47 占空比 40% 突发长度 （ms） 400 周期 （s） 1 超声处理时间（分钟） 5 表 1：用于 BSCB 破坏的超声处理参数。 4. 微泡管理 按照制造商提供的说明准备 MB 溶液。避免将空气引入溶液中。注意：MB是脆弱的，如果静止几分钟，会在小瓶/注射器顶部附近聚集在一起。定期摇晃小瓶和注射器，以防止MB的不均匀分散。查看制造商指南以确定到期时间。 插入 22 G 尾静脉导管并用 0.2 mL 肝素盐水 （500 IU/mL）冲洗23。为了增加尾静脉导管插入术成功的机会，请将尾巴浸入温水中，并在尾巴底部放置止血带以扩大静脉直径。注意：尾静脉导管插入术可以在动物椎板切除术、定位和靶向之前进行，以节省研究时间。 将 1 mL/kg 的 3% EBD 注射到导管中。用 0.2 mL 肝素盐水冲洗。老鼠的四肢和眼睛会变成蓝色。通过检查大鼠脊髓背静脉中的蓝色变化来确认尾静脉导管插入术是否成功（图4）。注意：EBD 可以在 MB 注射之前注射，并且不会影响超声处理。此外，由于美国食品和药物管理局（FDA）目前尚未批准使用系统中已有的药物进行超声处理，因此也可以在超声处理后进行EBD。这将导致染料吸收减少，但可能更具临床相关性。 将 0.2 mL 推注 MB 注射到导管中，并用 0.2 mL 肝素盐水冲洗。注射MB后1-2分钟开始超声处理。此处使用的设置不收集实时超声反馈。注：BSCB破坏的研究通常使用比诊断成像指示更高的MB浓度。在大鼠模型中用于BBB和BSCB破坏的常见MB品牌的一些浓度包括0.02-0.2mL / kg和200μL推注10,15,24,25。 5. 脊髓摘除和组织处理 超声处理完成后，用100mL冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）经心灌注大鼠，直至血液完全清除。由于染料，肝脏呈浓郁的蓝色，应褪色为浅棕蓝色26。注意：灌注的目的是从脊髓脉管系统中去除多余的血液。由于 EBD 与白蛋白结合，这也去除了多余的 EBD。这确保了在脊髓中通过视觉或荧光显微镜检测到的任何EBD都是由于染料外渗到脊髓实质中。 经心灌注 100 mL 冷的 4% 多聚甲醛 （PFA）。如果彻底完成，老鼠的四肢会在这种固定过程中抽搐。这种与PFA的灌注使大鼠安乐死。 取出脊髓并将其置于4°C的4%PFA中过夜。第二天用 PBS 替换 PFA。 6. BSCB中断的可视化 使用剃须刀片在超声处理位置周围隔离 2 厘米的部分。使用切片机将切片机沿中线向下切片切开，切片切成10μm厚的切片。对于明场可视化，用苏木精-伊红 （H&E） 染色染色。注：本研究中显示的 H&E 脊髓样本用苏木精染色 3 分钟，用伊红染色 1 分钟27。 对于荧光显微镜，用溶解在封固剂（0.5μg/ mL）中的25μL4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对含有脊髓切片的载玻片进行脱蜡。在4°C孵育至少10分钟。避光放置，防止漂白。注意：脱蜡可以通过使用低温恒温器来获得冷冻切片来代替。 使用荧光显微镜对所有载玻片进行成像。EBD自发荧光（激发：470 nm和540 nm;发射：680 nm）在红色通道中可见，而DAPI存在于蓝色通道中。使用光学显微镜对H&E载玻片进行成像。注意：尽管该协议描述了非存活程序，但它也是使用存活手术技术进行的。对于生存手术，切口前用 3 次交替施用碘聚维酮对皮肤进行消毒，并在手术前皮下注射丁丙诺啡 （0.05 mg/kg）。术后至少3天，每12小时继续皮下注射丁丙诺啡，如果大鼠表现出疼痛迹象，则增加几天。如果发生脊髓损伤，大鼠可能会表现出尿潴留或步态异常。这将表现为后肢或可触及的膀胱扩张的拖曳或延迟运动。如果发生这种情况，用营养强化的水凝胶喂养大鼠以提供食物和水合作用，并每天两次手动挤出膀胱，直到反射性排尿恢复。如果后肢完全瘫痪或顽固性疼痛，则对大鼠实施安乐死。