Isolating Bronchial Epithelial Cells from Resected Lung Tissue for Biobanking and Establishing Well-Differentiated Air-Liquid Interface Cultures

Dennis K. Ninaber; Anne M. van der Does; Pieter S. Hiemstra

doi:10.3791/65102

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Immunology and Infection

Выделение эпителиальных клеток бронхов из резецированной легочной ткани для биобанкирования и создания хорошо дифференцированных культур раздела воздух-жидкость

Published: May 26, 2023

doi:

10.3791/65102

Dennis K. Ninaber¹, Anne M. van der Does¹, Pieter S. Hiemstra¹

¹PulmoScience Laboratory, Department of Pulmonology,Leiden University Medical Center

Summary

Здесь представлен воспроизводимый, доступный и надежный метод выделения и расширения первичных эпителиальных клеток бронхов для долгосрочного биобанкирования и получения дифференцированных эпителиальных клеток путем культивирования на границе раздела воздух-жидкость.

Abstract

Слой эпителиальных клеток дыхательных путей образует первый барьер между легочной тканью и внешней средой и, таким образом, постоянно подвергается воздействию вдыхаемых веществ, включая инфекционные агенты и загрязнители воздуха. Эпителиальный слой дыхательных путей играет центральную роль при большом разнообразии острых и хронических заболеваний легких, и различные методы лечения, нацеленные на этот эпителий, проводятся ингаляционно. Понимание роли эпителия в патогенезе и того, как он может быть нацелен на терапию, требует надежных и репрезентативных моделей. Модели эпителиальных культур in vitro все чаще используются и предлагают преимущество проведения экспериментов в контролируемой среде, подвергая клетки воздействию различных видов раздражителей, токсикантов или инфекционных агентов. Использование первичных клеток вместо иммортализированных или опухолевых клеточных линий имеет то преимущество, что эти клетки дифференцируются в культуре в псевдостратифицированный поляризованный эпителиальный клеточный слой с лучшим представлением эпителия по сравнению с клеточными линиями.

Здесь представлен надежный протокол, который был оптимизирован за последние десятилетия для выделения и культивирования эпителиальных клеток дыхательных путей из легочной ткани. Эта процедура позволяет успешно выделять, расширять, культивировать и мукоцилиарную дифференцировку первичных эпителиальных клеток бронхов (PBEC) путем культивирования на границе раздела воздух-жидкость (ALI) и включает протокол биобанкинга. Кроме того, описана характеристика этих культур с использованием клеточно-специфических маркерных генов. Эти культуры ALI-PBEC могут быть использованы для целого ряда применений, включая воздействие цельного сигаретного дыма или медиаторов воспаления, а также совместное культурирование/заражение вирусами или бактериями.

Ожидается, что протокол, представленный в этой рукописи, иллюстрирующий процедуру шаг за шагом, послужит основой и/или справочным материалом для тех, кто заинтересован во внедрении или адаптации таких систем культивирования в своей лаборатории.

Introduction

Роль эпителия дыхательных путей при различных острых и хронических заболеваниях легких была описана в различных обзорах 1,2,3,4,5,6,7. Хорошо дифференцированные культуры эпителиальных клеток дыхательных путей являются важным инструментом для разгадки роли эпителия дыхательных путей. Культура эпителиальных клеток дыхательных путей на границе воздух-жидкость (ALI) широко применяется для содействия дифференцировке базальных эпителиальных клеток дыхательных путей и, таким образом, надежного изучения эпителия дыхательных путей in vitro ^8,9. В последние годы использование таких моделей еще больше возросло в результате новых исследовательских инициатив, связанных с пандемией COVID-19 и всемирным переходом к исследованиям без животных. Таким образом, более широкое использование этой модельной клеточной линии подчеркивает необходимость обмена процедурами и опытом для получения надежных результатов. Это также позволит сравнивать результаты между исследовательскими группами. Надежность процедуры является ключевой характеристикой и поэтому должна подвергаться контролю качества. Несколько лабораторий инвестировали в разработку протоколов культивирования первичных эпителиальных клеток дыхательных путей в ALI. Время, усилия и требуемый бюджет могут быть сокращены, если эти процедуры будут подробно рассмотрены. Эти детали включают, например, выбор пластмасс и сред для клеточных культур, предоставляемых различными производителями, поскольку было обнаружено, что это влияет на характеристики полученных культур^10,11,12. Это подчеркивает важность обмена опытом и подробностями процедур культивирования, поскольку в отсутствие такого понимания это может повлиять на результаты и/или усилия по валидации в различных лабораториях могут быть затруднены.

Эпителий легких человека состоит из различных типов клеток, включая основные типы, такие как базальные клетки, реснитчатые клетки, бокаловидные клетки и клубные клетки. Чтобы надежно имитировать эпителиальный клеточный слой в дыхательных путях in vitro, эти типы клеток должны быть представлены в культуральных моделях, а их поляризация и функция поддерживаются^13,14,15,16. Не менее важно осознание того, что характеристики донора (включая болезненное состояние) и анатомическое происхождение клеток (т.е. носа, трахеи, больших и малых дыхательных путей) могут влиять на клеточный состав и функциональные реакции клеточной культуры. Соответствующие знания и практика являются предпосылкой для успешного культивирования первичных эпителиальных клеток дыхательных путей и оценки качества культуры как интуитивно (путем визуального осмотра во время культивирования), так и количественно. Цель этого вклада состоит в том, чтобы обеспечить экономически эффективный и эффективный по времени метод выделения и культивирования первичных эпителиальных клеток бронхов человека (PBEC), который также может быть применен к культуре эпителиальных клеток трахеи и мелких дыхательных путей. В дополнение к описанию способа выделения таких клеток из резецированной легочной ткани, представлен и обсужден способ расширения и биобанкирования и, наконец, для создания и характеристики хорошо дифференцированной ALI-культуры в разумные сроки и в разумные сроки и в разумные сроки.

Protocol

Клетки были выделены из макроскопически нормальной легочной ткани, полученной от пациентов, перенесших операцию по резекции рака легких в Медицинском центре Лейденского университета, Нидерланды. Пациенты, из которых была получена эта легочная ткань, были зачислены в биобанк через систему без возражений для закодированного анонимного дальнейшего использования такой ткани (www.coreon.org). Однако с 01.09.2022 г. пациенты были зачислены в биобанк с использованием активного информированного согласия в соответствии с локальными нормативными актами биобанка LUMC с одобрения институционального комитета по медицинской этике (B20.042/Ab/ab и B20.042/Kb/kb). ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры выполняются в шкафу биологической безопасности в соответствии с местными правилами биологической безопасности и в стерильных условиях труда в хирургических перчатках и лабораторном халате, если не указано иное. Обо всех средах, реагентах и других растворах, используемых в протоколе, см. Таблицу материалов и дополнительную таблицу 1. Подробные шаги протокола см. на рисунке 1 1. Выделение эпителиальных клеток бронхов из легочной ткани человека ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить оптимальную вероятность успеха выделения эпителиальных клеток бронхов, иссеченное бронхиальное кольцо следует держать погруженным при 4 ° C в течение максимум 24 часов в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) с добавлением примоцина. Подготовка к началу процедурыПриготовьте раствор для покрытия в PBS, как описано в Дополнительной таблице 1, и покройте соответствующее количество 6-луночных планшетов 1,5 мл раствора покрытия на лунку. Инкубировать в течение 2 ч в инкубаторе клеточных культур при 37 °C и 5%CO2.ПРИМЕЧАНИЕ: Количество лунок, подлежащих покрытию, зависит от размера иссеченной ткани. В качестве приблизительного ориентира четыре 6-луночные пластины покрываются, когда иссеченное бронхиальное кольцо составляет 10 мм в диаметре и 4 мм в ширину. Подготовьте полную среду, свободную от кератиноцитов (c-KSFM), как описано в дополнительной таблице 1; используйте 2 мл среды на лунку 6-луночной пластины.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот c-KSFM можно хранить при температуре 4 °C в течение 7 дней. c-KSFM представляет собой среду с низким содержанием кальция, используемую для расширения эпителиальных клеток дыхательных путей при одновременном ингибировании роста загрязняющих фибробластов. Очистите бронхиальное кольцо, осторожно промыв кольцо в 10 мл стерильного PBS в 10-сантиметровой чашке Петри. Используйте пинцет, чтобы осторожно удерживать кольцо (прикасайтесь только снаружи), и маленькие ножницы, чтобы удалить лишнюю соединительную ткань и остатки крови. Для дальнейшей обработки разрежьте кольцо на две части.ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструменты, используемые в процессе, должны быть стерилизованы перед использованием. Погрузите две половины бронхиального кольца в 10 мл предварительно подогретого раствора протеазы XIV (1,8 мг / мл) в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS), включая примоцин, в закрытом стерильном контейнере и инкубируйте ровно 2 часа при 37 ° C в инкубаторе клеточных культур.ПРИМЕЧАНИЕ: HBSS используется в качестве разбавителя для протеазы XIV для отделения клеток от ткани в течение 2-часового инкубационного периода. HBSS – это сбалансированный изотонический раствор, который позволяет поддерживать жизнеспособность клеток во время краткосрочных инкубаций. После инкубации перенесите кусочки ткани в чашку Петри с 10 мл теплого PBS и соскребите внутреннюю часть кольца с помощью согнутого пинцета для получения клеточного раствора.ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань выглядит более мягкой и несколько расширенной. Выбросьте кольцо, перенесите клеточный раствор в пробирку объемом 50 мл и добавьте теплый PBS, чтобы получить конечный объем 50 мл. Центрифуга в течение 7 мин при 230 x g и при комнатной температуре (RT). Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 10 мл теплого PBS. Далее восполните объем до 50 мл теплым PBS. Центрифуга в течение 7 мин при 230 x g при RT. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в соответствующем количестве теплого c-KSFM, содержащего примоцин.ПРИМЕЧАНИЕ: Примоцин используется в течение как минимум 7 дней для уничтожения любых бактерий, грибков или (что важно) микоплазмы, которые могли присутствовать в ткани; Через 7 дней достаточно добавить в среду только пенициллин/стрептомицин. Аспирируйте раствор покрытия из 6-луночных планшетов и добавьте 2 мл клеточной суспензии на лунку. Дайте клеткам расти до тех пор, пока не будет достигнуто слияние от 80% до 90%, и меняйте среду три раза в неделю (например, каждый понедельник, среду и пятницу). Желаемая степень слияния обычно достигается между 7 и 14 днями; Если время, необходимое для достижения желаемого слияния, превышает 14 дней, откажитесь от клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: В первые несколько дней только небольшое количество клеток начинает размножаться; Группы клеток заметны уже через несколько дней. 2. Криоконсервация первичных эпителиальных клеток бронхов человека (ПБЭК) ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с температурами -80 °C и -196 °C для защиты используются криоперчатки, а для переноса замороженных флаконов – пинцет. При работе с жидким азотом для индивидуальной защиты используются криоперчатки и лицевой щиток. Аспирируйте среду и промойте лунки один раз 2 мл теплого PBS на лунку. Трипсинизируют клетки, добавляя 0,5 мл мягкого трипсина на лунку (см. Дополнительную таблицу 1 для состава раствора мягкого трипсина). Инкубируйте клетки в течение 5-10 минут при 37 ° C. Взболтайте раствор трипсина в пластине и освободите клетки, осторожно постукивая по пластине. Перенесите отделившиеся клетки в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую 1,1 мг/мл ингибитора трипсина сои (SBTI; для ингибирования активности трипсина), растворенного в KSFM с пенициллином/стрептомицином. Объем SBTI должен быть в два раза больше общего объема мягкого трипсина (т.е. 1 мл на лунку).ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте SBTI непосредственно в лунки, так как ячейки снова присоединятся в течение нескольких минут. Центрифугируйте пробирку в течение 7 мин при 230 x g при RT. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулированные клетки в 10 мл RT KSFM, содержащего пенициллин/стрептомицин, но без других добавок. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Выполните подсчет живых/мертвых клеток, добавив трипановый синий в соотношении 1:1, или используйте альтернативную процедуру подсчета живых/мертвых клеток. Криоконсервируют клетки в концентрации 400 000 клеток на мл замораживающей среды (см. Дополнительную таблицу 1 для состава) и добавляют 1 мл этой суспензии на криовальную смесь. Переложите криовиалы в контейнер с холодильной камерой и поместите его при температуре -80 °C. Через 24 ч флаконы перевести в жидкий азот -196 °С для длительного хранения.ПРИМЕЧАНИЕ: Возможны два варианта переноса ячеек в морозильную среду, оба из которых хорошо работают: 1) Снова гранулируйте ячейки центрифугированием и ресуспендируйте в холодной морозильной среде при требуемой концентрации клеток; или 2) добавить холодную морозильную среду и отрегулировать концентрацию криоконсерванта (диметилсульфоксида [ДМСО]) в зависимости от объема KSFM, в котором присутствуют клетки. 3. Размораживание криоконсервированных ПБЭК и выращивание их для культивирования на вкладышах Покройте колбу для культивирования клеток T75 на ночь 10 мл раствора покрытия в PBS с плотно закрытыми крышками. Инкубируют колбу в инкубаторе клеточных культур при 37 °C и 5%CO2. Перед размораживанием криоконсервированных ПБЭК извлеките раствор покрытия из колбы и залейте его 10 мл к-КСФМ. Дайте ему нагреться до 37 °C в инкубаторе клеточных культур со слегка открытыми крышками, чтобы впустить воздух в инкубатор. Быстро разморозьте клетки в водяной или бусинной бане с температурой 37 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Ванна с шариками предпочтительнее водяной бани из-за меньшего риска загрязнения и меньшего потребления энергии. Добавьте полное содержимое криовиала в предварительно разогретую колбу T75 со средой (шаг 3.2) и равномерно распределите ячейки.ПРИМЕЧАНИЕ: Не центрифугируйте клетки на этом этапе, так как они не выдержат этап центрифугирования. Примерно через 4 часа убедитесь, что клетки достаточно прикреплены. Замените среду 10 мл свежего, теплого c-KSFM.ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, ДМСО удаляется из замораживающей среды. Этот этап должен быть выполнен между 4 и 24 часами после посева клеток в колбу. Выращивайте клетки до тех пор, пока не будет достигнуто слияние от 80% до 90%, меняя среду каждый понедельник, среду и пятницу. 4. Создание культуры раздела воздух-жидкость с первичными эпителиальными клетками бронхов (ALI-PBEC) ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура предназначена для культивирования PBEC на вкладышах внутреннего диаметра 11,9 мм. Покройте соответствующее количество вставок для клеточных культур 0,4 мл раствора покрытия на вкладыш. Инкубировать в течение ночи при 37 °C в инкубаторе клеточных культур. Подготовьте полную среду BD (среду cBD), как описано в дополнительной таблице 1.ПРИМЕЧАНИЕ: среда cBD представляет собой композитную среду (см. Дополнительную таблицу 1), разработанную для поддержки роста эпителиальных клеток бронхов в течение более длительных периодов времени, обеспечивая при этом их дифференцировку после увеличения концентрации ретиноевой кислоты (РА) (или аналога РА, используемого в настоящем протоколе) и культивирования в ALI, как описано на шаге 4.10. Трипсинизируйте PBEC в колбе T75, используя 2 мл мягкого трипсина на колбу. Инкубируйте клетки в течение 5-10 минут, чтобы позволить клеткам отсоединиться (на основе визуального осмотра). После 5 минут инкубации облегчите отслоение клеток, закрутив трипсин в колбе и осторожно постучав по колбе (при необходимости повторить). Добавьте 4 мл SBTI в колбу и непосредственно перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 25 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки снова прикрепляются в течение нескольких минут. Следовательно, при работе с более чем одной колбой клеточную суспензию, полученную на этапе 4.4, необходимо непосредственно перенести в центрифужную пробирку перед добавлением SBTI во вторую колбу. Во время процедуры одновременно обрабатывается не более пяти колб. Центрифугируйте пробирки в течение 7 мин при 230 x g при RT. Ресуспендируют клетки в 6 мл среды cBD и подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Выполните подсчет живых/мертвых клеток, например, добавив трипановый синий в соотношении 1:1 или используя другую процедуру подсчета живых/мертвых клеток. Удалите раствор покрытия из вкладышей для культивирования клеток. Разбавляют клеточную суспензию, полученную на этапе 4.6, средой cBD, дополненной 1 нМ EC 23 до концентрации 80 000 клеток на мл, и добавляют 0,5 мл на верхнюю часть мембраны во вставке. Добавьте 1,5 мл среды cBD с добавлением 1 нМ EC 23 в лунку под вкладышем. Меняйте среду средой cBD с добавлением 1 нМ EC 23 три раза в неделю, пока культуры не будут готовы к воздействию на воздухе (т.е. через 2 дня после достижения 100% слияния). Каждый раз 0,5 мл среды добавляется внутрь вкладыша (на ячейки) и 1,5 мл добавляется в нижний отсек (лунку).ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, клеточный слой достигает 100% слияния примерно через 5 дней после посева PBEC на вкладышах. На основании визуального осмотра слияния клеток принимается решение о переводе клеток в стадию ОПЗ через 2 дня. Когда клетки будут готовы к переносу в ALI (т.е. через 2 дня после достижения 100% слияния), удалите среду из вкладышей и лунки, не добавляйте новую среду внутрь вставки и добавляйте новую среду (1 мл среды cBD с добавлением 50 нМ EC 23) только в лунку. Меняйте среду в лунках трижды в неделю. Чтобы удалить избыток слизи и клеточного мусора, осторожно добавьте 200 мкл теплого PBS на апикальную сторону клеточного слоя внутри вкладыша (предпочтительно через боковую сторону вкладыша, а не путем прямого пипетирования на клетки) и инкубируйте в течение 10 мин в инкубаторе клеточных культур при 37 ° C. Затем аспирируйте PBS, чтобы удалить излишки слизи и клеточного мусора.ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого момента (начало культивирования ALI), перед сменой среды нижнего компартмента, каждый раз промывайте апикальную сторону клеток PBS. Культивируйте клетки в ALI в течение как минимум 2 недель, чтобы убедиться, что представлены все основные типы клеток. 5. Создание культуры ALI-PBEC из смешанной донорской популяции Используйте клетки до пяти отдельных доноров для создания культур PBEC из смешанной популяции. Смешайте равное количество клеток на одного донора, используя клетки, сгенерированные на шаге 4.7, чтобы получить в общей сложности 150 000 клеток на вставку (т.е. 30 000 клеток на донора при использовании пяти доноров). Это гарантирует, что пролиферация во вставке будет сведена к минимуму и в культуре будет присутствовать равное количество клеток от отдельных доноров. Продолжите культуру ALI-PBEC, как описано в шагах 4.9-4.12. 6. Контроль качества культуры ALI-PBEC Мониторинг трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) во время культивирования клетокПРИМЕЧАНИЕ: Измерение электрического сопротивления, основанное на использовании вольтомметра, может быть выполнено в любой момент времени во время культивирования ALI-PBEC и выполняется каждый раз в соответствии с одним и тем же протоколом в одних и тех же условиях, поскольку на измерение электрического сопротивления влияют различные переменные, включая положение электрода, температуру, среду и обращение. TEER можно рассчитать с использованием измеренного электрического сопротивления, применив следующую формулу, основанную на законе Ома: , где Rm – измеренное электрическое сопротивление, Rb – базовое электрическое сопротивление вставки без покрытия и ячеек, а SA – площадь поверхности мембраны вставки17.Аккуратно добавьте 200 мкл теплого PBS на апикальную сторону клеточного слоя, чтобы удалить слизь и мусор на клетках. Инкубируйте вкладыш в течение 10 минут в инкубаторе клеточных культур при температуре 37 °C и снова удалите PBS. Аккуратно добавьте 700 мкл теплого PBS к апикальной стороне клеточного слоя и инкубируйте вставку в течение 10 минут при RT, чтобы обеспечить стабилизацию температуры для измерений. Откалибруйте вольтомметр с помощью испытательного резистора 1,000 Ω, настройте вольтомметр на измерение Ом и с помощью отвертки отрегулируйте калибровочный винт «R ADJ» до тех пор, пока он не будет установлен на 1,000 Ω. Промойте электрод, перемещая его вверх и вниз несколько раз в стерильной воде (RT), а затем в стерильной PBS (RT). Измерьте электрическое сопротивление слоя ячейки во вставках. С этой целью поместите электрод в вертикальное положение в лунку так, чтобы длинный рычаг электрода касался дна пластины. Таким образом, короткое плечо находится над клеточным слоем внутри вставки. Считывание значения, отображаемого на вольтомметре.ПРИМЕЧАНИЕ: Отображаемое значение не будет полностью стабилизировано; Считывание значения в тот момент, когда значение является прерывистым. Между измерениями очищайте электрод, перемещая его вверх и вниз несколько раз в стерильном PBS (RT). После завершения измерений очистите электрод, несколько раз переместив его вверх и вниз в стерильной воде (RT), стерильном PBS (RT) и 70% этаноле (RT). Храните электрод в сухом месте. Выполните базовое измерение вставки (без покрытия) и ячеек, добавив 700 мкл теплого PBS внутрь вставки и 1 мл теплого PBS в лунку и измерив электрическое сопротивление вместе с другими вставками. Оценка клеточного состава культуры ALI-PBECВо время стадии ОПЛ проверьте дифференциацию, визуально оценив бьющиеся реснички. Их можно наблюдать с помощью стандартной светлопольной микроскопии уже через 9 дней после воздействия воздуха на апикальную сторону клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Бьющиеся реснички лучше всего видны непосредственно после мытья верхушечной поверхности. Бокаловидные клетки вырабатывают слизь, и поэтому наличие слизи, наблюдаемое при промывании верхушечной поверхности, является признаком того, что бокаловидные клетки образуются. Тем не менее, уровень бокаловидных клеток и количество вырабатываемой слизи сильно зависят от донора. Наличие слизи можно увидеть при аспирации PBS после промывки апикальной поверхности клеточного слоя во вставке; в этом случае аспирированный PBS более вязкий, и при аспирации могут наблюдаться слизистые нити. Оценка клеточного состава с использованием иммуноокрашивания и флуоресцентной микроскопии или флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS) или анализа экспрессии генов с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-кПЦР) дает важную информацию о состоянии дифференцировки культуры, но ее описание выходит за рамки этого вклада. Рисунок 1: Схематический обзор процедуры выделения, расширения и культивирования первичных эпителиальных клеток бронхов . (A) Легочная ткань получается во время операции по резекции рака, и патологоанатом иссекает ткань бронхиального кольца, которая является макроскопически нормальной и не содержит опухолей. (B) Бронхиальное кольцо очищают и подвергают ферментативной обработке для отделения и диссоциации клеточного слоя. (C) Извлеченную клеточную суспензию промывают и распределяют ячейки в лунки 6-луночной пластины для расширения. (D) При достаточном расширении изолированных клеток в c-KSFM с примоцином клеточные слои диссоциируют трипсинизацией, и клетки ресуспендируют в замораживающей среде для криоконсервации. При необходимости криоконсервированные клетки размораживают и снова расширяют с помощью c-KSFM с пенициллином/стрептомицином в колбах для клеточных культур. После экспансии их высевают в среду cBD на вставки для клеточных культур; (Эа) Культивирование ALI-PBEC происходит в два основных этапа: погруженная стадия в среду cBD с добавлением 1 нМ EC 23 до тех пор, пока клетки не достигнут полного слияния, с последующим удалением апикальной среды и культивированием в ALI для обеспечения дифференцировки; в этой фазе ALI клетки культивируют в среде cBD с добавлением 50 нМ EC 23. (Эб) Графическое представление базальных клеток, которые покрывают вставку во время погруженного культивирования. (ЕС) Графическое представление дифференцированного слоя эпителиальных клеток, полученное после культивирования на ОПЗ в присутствии повышенных концентраций ЕС-23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Representative Results

Экспансия с использованием погруженной культурыИспользуя представленный здесь метод, можно получить в среднем восемь криовалов с 400 000 клеток/криовиал из одной 6-луночной пластины для длительного хранения в жидком азоте (рис. 2А). Для достижения этой цели изолированные PBEC культивируют в 6-луночных планшетах в течение минимум 7 дней и максимум 14 дней (рис. 2B) в присутствии Primocin, чтобы исключить микробное (особенно микоплазменное) загрязнение. На рисунке 2A,B показано количество полученных клеток и требуемое время культивирования среди различных выделений от различных доноров. Перед сбором клеток трипсинизацией для хранения в жидком азоте слияние должно быть более 80%. Если это не будет достигнуто в течение 14 дней, клетки не следует криоконсервировать. Важно отметить, что при сборе урожая для хранения и пассирования слияние клеточного слоя не должно превышать ~ 95% (рис. 2C). После хранения в жидком азоте клетки можно размораживать и культивировать для расширения до тех пор, пока не будет получено достаточное количество клеток для культур ALI. Средой, используемой для размножения клеток на этой стадии, является c-KSFM, аналогично тому, как и во время начального культивирования после сбора урожая из бронхиального кольца18. Однако на данном этапе нет необходимости в Примоцине, потому что риск дополнительного микробного загрязнения, происходящего из легочной ткани, отсутствует, и поэтому Примоцин может быть заменен на пенициллин / стрептомицин. Эта среда благоприятствует эпителиальным клеткам по сравнению с фибробластами и, следовательно, предотвращает возможный чрезмерный рост культуры за счет более быстрой пролиферации фибробластов 19,20,21. При использовании среды c-KSFM клетки разложены в колбе и не соединяются друг с другом, что заметно отличается от морфологии культивируемых клеток, погруженных на этой стадии в среду cBD (рис. 2D,E). После 5 или 6 дней культивирования размороженных клеток в колбе T75 клеточный слой должен быть на 80-95% сливающимся, что соответствует примерно 3 x 106 клеткам в общей сложности (рис. 2F). Из этого можно создать примерно 75 вставок (размером с 12-луночную пластину) для культуры ALI. Способ выделения и посева, описанный в этом вкладе, также может быть адаптирован для использования с биопсией бронхов или бронхиальными щетками в качестве исходного материала. Рисунок 2: Расширение базальных клеток до и после криоконсервации. Клетки выделяли по описанному протоколу и культивировали с помощью c-KSFM. Контролировалось количество клеток, генерируемых на одного донора, подсчет живых клеток проводили с помощью автоматизированного счетчика клеток (A) при сборе клеток прохода 0 (P0) из 6-луночных планшетов (шаг 2 протокола), n = 123 донора, количество клеток было представлено как количество клеток, собранных в лунке; Каждая точка представляет одного донора, а медиана обозначена горизонтальной чертой. (B) В рамках контроля качества время, необходимое клеткам P0 для достижения слияния от 80% до 90% в 6-луночных планшетах, контролировалось и показывалось как дни после запуска погруженной культуры в c-KSFM (n = 127 различных доноров). Каждый отдельный донор обозначается точкой, все точки, относящиеся к 1 дню, сливаются в линию; чем шире линия, тем больше доноров она отстаивает; Среднее количество дней, в течение которых клетки находятся в культуре, обозначается более тонкой горизонтальной полосой. (C) Репрезентативное светлопольное изображение P0-клеток, выращенных под погружением в c-KSFM в момент сбора клеток для долгосрочной криоконсервации. (D) Репрезентативное изображение светлого поля клеток P1, выращенных под погружением в c-KSFM в момент сбора и переноса клеток на вставки, и (E) клеток P1, выращенных под погружением в среду cBD. (F) количество живых клеток, полученных на одного донора, контролировалось с помощью автоматического счетчика клеток при сборе клеток P1 из колбы T75 (раздел 4 протокола), n = 63 различных доноров; количество клеток представлено в виде количества клеток в колбе T75, каждый донор обозначен точкой, а медианное количество клеток обозначено горизонтальной чертой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Культура интерфейса воздух-жидкость (ALI)Через 7 дней после начала культивирования ALI измеряется электрическое сопротивление клеточного слоя и должно составлять более 300 Ω (рис. 3А); Если этого не достигается, культура расценивается как провалившаяся из-за возможного отсутствия образования плотного соединения. Рекомендуется исключить возможность получения низких значений TEER, вызванных повреждением эпителиального слоя в отдельных вставках, например, в результате повреждения клеточного слоя во время промывки и аспирации. Это можно проверить с помощью визуального микроскопического осмотра культуральных вставок. По нашему опыту, междонорная изменчивость электрического сопротивления может быть значительной (рис. 3B), о чем также сообщается в литературе14, и, как это наблюдается, также заметно зависит от происхождения используемой модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) (рис. 3C). Рисунок 3: Трансэпителиальное электрическое сопротивление как контроль качества культур ALI-PBEC. Были выделены и расширены PBEC, и были созданы хорошо дифференцированные культуры ALI-PBEC. В несколько моментов времени во время культивирования измерялось электрическое сопротивление, а затем рассчитывался TEER (Ω·см2). (A) Электрическое сопротивление измерялось в течение 14 дней после ALI. n = 4 разных донора. Данные отображаются в виде среднего значения ± стандартного отклонения (SD). (B) В рамках контроля качества клеточных культур ALI-PBEC электрическое сопротивление измерялось на 7-й день (n = 50) и на 14-й день после ALI (n = 25); каждая точка представляет одного донора, а медиана TEER (Ω·см2) обозначена горизонтальной чертой. Данные были проверены на значимость с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни, и существенной разницы обнаружено не было. (C) Для оценки влияния на формирование TEER были протестированы носители от трех различных поставщиков DMEM. n = 4 разных донора; средние значения изображены ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. При создании хорошо дифференцированной культуры ALI-PBEC с начала воздействия на воздух концентрация РА увеличивается22. Таким образом, клетки переключаются с пролиферации на мукоцилиарную дифференцировку, которая видна уже через 9 дней (в зависимости от донора) после воздействия воздуха с помощью светлопольной микроскопии. Движение первых ресничек видно в этот момент и несколько раньше, когда основано на экспрессии генов маркеров дифференцированных люминальных клеток23 (рис. 4). Как описано в протоколе, выработка слизи также может наблюдаться при промывании апикальной поверхности во время смены среды. РА очень чувствителен к свету, что приводит к сильно варьирующейся активности при одной и той же концентрации запасов. По этой причине РА заменяется синтетическим аналогом РА EC 23 и используется в той же концентрации с аналогичными результатами, что и экспериментально. По этой причине и во избежание изменения процедуры выбранная концентрация EC 23 была сохранена равной концентрации RA (т.е. 50 нМ), ранее использовавшейся24,25 (рис. 5). На рисунке 5А показаны значения TEER, достигнутые при использовании различных концентраций EC 23, с максимальным TEER при 50 нМ в этом диапазоне испытанных концентраций. Результаты, показанные на рисунке 5B, подтверждают, что экспрессия генов маркеров реснитчатых и бокаловидных клеток одинакова при использовании 50 нМ EC 23 или RA. EC 23 также требуется во время культивирования на стадии погружения (хотя и в гораздо более низкой концентрации), поскольку его исключение на этой стадии погружения и добавление его только на стадии ALI приводит к культуре, которая никогда не достигает полного слияния. Время, необходимое для создания хорошо дифференцированной культуры ALI-PBEC с видимой активностью биения ресничек и продуцированием слизи, составляет около 14 дней, и поэтому большинство экспериментов начинается между 14-21-дневными культурами ALI (рис. 4). Все основные различные типы клеток (базальные, реснитчатые, бокаловидные и клубные клетки) наблюдаются через 14 дней культивирования ALI, хотя уровни экспрессии сильно зависят от донора. Это демонстрируется оценкой экспрессии генов TP63, FOXJ1, MUC5AC и SCGB1A1 с помощью ОТ-кПЦР или экспрессии белка с использованием антител, направленных против p63, α-тубулина, Muc5AC и CC-16 с помощью окрашивания иммунной флуоресценции (IF), для обнаружения маркеров базальных, реснитчатых, бокаловидных и клубных клеток соответственно25,26. Однако, в то время как 14-21 день можно рассматривать как эмпирическое правило для большинства экспериментов, для отдельных экспериментов можно рассмотреть более длительную продолжительность дифференцировки, как это было обнаружено для метаболизма ксенобиотиков, инфекции SARS-CoV-2 и оценки мукоцилиарного клиренса27,28,29. Рисунок 4: Культура интерфейса воздух-жидкость (ALI). Были выделены и расширены PBEC, и были созданы хорошо дифференцированные культуры ALI-PBEC. Посевы ALI-PBEC контролировались в течение 14 дней после ALI. Клеточные культуры лизировали для выделения РНК на 0, 7 и 14 дни после ALI. Показаны данные от двух разных доноров, каждая точка представляет одного отдельного донора, контролируемого с течением времени, а медиана обозначена горизонтальной чертой. Экспрессию генов базальных, реснитчатых, бокаловидных и клубных клеточных маркеров (TP63, FOXJ1, MUC5B и SCGB1A1 соответственно) измеряли с помощью кПЦР и нормализовали экспрессию генов RPL13A и ATP5B (подробнее см. ссылку 23). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Сравнение ретиноевой кислоты (РА) и ее синтетического аналога EC 23. Были выделены и расширены PBEC, и были созданы хорошо дифференцированные культуры ALI-PBEC. С началом воздействия на воздух культур ТЭС РА (50 нМ) был заменен различными концентрациями ЕС 23. (A ) Электрическое сопротивление измеряли на 14-й день после ALI, а затем рассчитывали TEER (Ω · см 2), n =2 донора, столбцы отображают среднее значение ± SD. ( B) На 14-й день после ALI клеточные культуры лизировали для выделения РНК и последующего анализа экспрессии генов клеточных маркеров соответственно для реснитчатых и бокаловидных клеток (FOXJ1, MUC5AC) с использованием кПЦР, и нормализован для RPL13A (n = 3 донора). Показано кратное увеличение по сравнению с ALI-PBEC, культивируемым с 50 нМ RA, и показано как среднее значение ± SD. (Подробнее см. ссылку 23 ) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. За последние годы были изучены характеристики альтернативных продуктов в системе культуры, таких как средства массовой информации и культурные пластики. Для таких оценок были разные причины, в том числе изменения в составе среды производителями, внедрение новых носителей, а также дефицит продукции во время пандемии COVID-19 (2020-2022 гг.). Было сделано наблюдение, что аналогичные продукты от разных поставщиков приводят к дифференцированным культурам эпителиальных клеток на основе оценки маркеров типов эпителиальных клеток, хотя конечный клеточный состав может существенно различаться (рис. 6А), тогда как различия в TEER были менее выражены (рис. 6Б). С другой стороны, среда от разных поставщиков приводила к существенным различиям в клеточном составе; при использовании вкладышей разных марок такие отличия были ограничены (рис. 6В). В частности, при использовании среды для культивирования эпителиальных клеток дыхательных путей PneumaCult от STEMCELL Technologies наблюдалась другая морфология и более быстрое формирование видимой цилиарной активности. Помимо этих наблюдений, также была отмечена разница в значениях TEER и разница в клеточном составе ALI-PBEC по сравнению со средой cBD (рис. 6D). Рисунок 6: Сравнение различных поставщиков среды эпителиальных клеток и вставок для клеточных культур. Были выделены ПБЭС, расширены и установлены хорошо дифференцированные культуры ALI-PBEC. (A) ALI-PBEC культивировали в течение 14 дней, а затем клеточные слои лизировали для выделения РНК. Экспрессию генов базальных, реснитчатых, бокаловидных и клубных клеточных маркеров (TP63, FOXJ1, MUC5AC и SCGB1A1 соответственно) измеряли с помощью кПЦР и нормализовали для RPL13A и ATP5B. n = 2 донора; столбцы показывают среднее значение ± SD. (B) В течение 9 дней после ALI измерялось электрическое сопротивление, а затем рассчитывался TEER (Ω·cm2). n = 3 разных донора; средние значения изображены ± SD. (C) ALI-PBEC культивировали в течение 14 дней с использованием вставок для клеточных культур, приобретенных у трех разных поставщиков, а затем клеточные слои лизировали для выделения РНК. Экспрессию генов реснитчатых, бокаловидных и клубных клеточных маркеров (FOXJ1, MUC5AC и SCGB1A1 соответственно) измеряли методом кПЦР и нормализовали для RPL13A. n = 18 различных доноров, столбцы отображают среднее значение ± SD. Данные были проверены на значимость с использованием одностороннего непараметрического критерия Крускала-Уоллиса ANOVA, и существенной разницы обнаружено не было. (D) ALI-PBEC культивировали либо в среде cBD, либо в среде PneumaCult (технологии STEMMCELL) в течение 14 дней после ALI, а затем клеточные слои лизировали для выделения РНК. Экспрессию генов базальных, реснитчатых, бокаловидных и клубных клеточных маркеров (TP63, FOXJ1, MUC5B и SCGB1A1 соответственно) измеряли с помощью кПЦР и нормализовали для RPL13A (столбцы показывают среднее значение ± SD), а электрическое сопротивление измеряли на 5-й и 12-й дни после ALI и использовали для расчета TEER (Ω·cm2). n = 2; среднее значение изображено ± SD (подробнее см. ссылку 23). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительная таблица 1: Состав растворов и сред, используемых в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Представленный здесь протокол описывает выделение эпителиальных клеток бронхов человека из резецированной легочной ткани, способ оптимального расширения клеток без потери потенциала дифференцировки, процедуру криоконсервации и процедуру получения хорошо дифференцированных культур ALI-PBEC. Кроме того, приводится описание контроля качества, а также инструкции по мониторингу и оценке дифференцированных ALI-PBEC.

Описанный протокол начинается с макроскопически нормального, безопухолевого бронхиального кольца, которое резецируется из доли легкого у пациентов, перенесших операцию, связанную с диагнозом рака легких. Поэтому необходимо отметить, что эти кольца строго не могут рассматриваться как здоровая ткань, что, следовательно, может влиять на характеристики клеточных культур. Альтернативные источники получения эпителиальных клеток бронхов включают использование биопсии бронхов, чистки бронхов или ткани от донора трансплантата или легких реципиента. Независимо от источника, при использовании легочной ткани следует учитывать риск микробного загрязнения, и поэтому антибиотики используются в различных питательных средах для снижения риска микробного загрязнения клеточной культуры. В частности, микоплазма представляет собой высокий и распространенный риск в клеточных культурах из-за ее широкого разнообразия воздействия на клеточную культуру, устойчивости к антибиотикам, обычно используемым в клеточных культурах, и того факта, что загрязнение микоплазмой может быть подтверждено только анализами обнаружения микоплазмы. Поэтому на начальном этапе культивирования клеток после выделения клеток из легочной ткани используют антимикробный препарат широкого спектра действия Примоцин, а в процессе культивирования случайно отобранные образцы проверяют на наличие микоплазмы.

Процедура выделения, начинающаяся с бронхиального кольца, обеспечивает достаточный исходный материал, чтобы обеспечить степень расширения этих первичных клеток, необходимую для начала культур в ALI, без ущерба для дифференцировочной способности. Однако начало экспансии изолированных эпителиальных клеток с ограниченным числом клеток может создать проблемы с получением достаточного количества вставок с достаточным количеством клеток, которые могут быть засеяны для культуры ALI. Расширенное культивирование и повторное пассажирование первичных клеток может привести к репликативному старению. Для преодоления этого ограничения были предложены различные решения. Horani et al. показали, что ингибитор Rho киназы (ROCK) Y-27632 увеличивает пролиферацию базальных клеток³⁰, Mou et al. использовали двойное ингибирование Smad для расширения базальных стволовых клеток при сохранении характеристик дифференцированного эпителиального клеточного слоя 31, а Sachs et al. разработали органоидную систему дыхательных путей, которая может быть использована для расширения эпителиальных клеток дыхательных путей и поддержания их потенциала дифференцировки в течение нескольких проходов³². Последний метод также использовался для экстракции клеток из источников с очень низким количеством клеток, таких как трахейные аспираты (ТА) недоношенных детей (<возраст беременности 28 недель) и жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), перед переносом в культуру ОПЛ, как описано здесь³³. Было обнаружено, что клетки, выделенные из BAL и TA, показали способность к дифференцировке, которая была аналогична клеткам, полученным из бронхиальной ткани, хотя различия наблюдались, когда дифференцировка была смещена в сторону более реснитчатых или более бокаловидных культур, содержащих клетки, с использованием ингибирования передачи сигналов Notch или цитокина Th2 IL-13³³. Поэтому рекомендуется, если ALI-PBEC культивируются из исходного материала с низким числом эпителиальных клеток с использованием аналогичных подходов, всегда проверять культуры на соответствие основным критериям качества, как описано в разделе 6 протокола. Важно отметить, что использование фидерных клеток может также помочь в получении большего количества клеток, что имеет важное значение в условиях трансплантируемых каркасов, где время и количество клеток имеют важное значение. Это иллюстрируется исследованием, в котором аутологичные эпителиальные клетки культивировались из биопсий, полученных от пациента с заболеванием трахеи, и клетки быстро расширялись в присутствии мышиного эмбрионального питательного слоя (митотически инактивированных фибробластов 3T3-J2) и вышеупомянутого ингибитора пути Rho/ROCK (Y-27632)³⁴. Было обнаружено, что полученная клеточная культура полезна для репопуляции каркасов трахеи, и, таким образом, это можно рассматривать как подходящий протокол для модели трансплантации.

При использовании протокола, описанного в этой статье, а также при использовании других протоколов культуры неизбежно возникает предвзятость отбора. Важно понимать, что различия в деталях протокола, таких как происхождение клеток, используемых для инициирования культур, состав среды и другие детали протокола, могут привести к изменениям в клеточном составе культур и, следовательно, к изменениям в ответе культуры ALI^33,35. Кроме того, различия в свойствах клеток также наблюдались при сравнении различных сред для дифференцировки клеток дыхательных путей^10,11. При сравнении среды PneumaCult и cBD наблюдались различия в маркерах мРНК бокаловидных клеток и клубных клеток, значениях TEER и толщине клеточного слоя. На основании этих наблюдений, несмотря на отсутствие статистического обоснования, из-за небольшого количества используемых доноров, состава среды неизвестен клиентам и более высокой стоимости среды PneumaCult, в нашей лаборатории было принято решение использовать среду cBD.

Как уже говорилось, клетки могут быть первоначально расширены с использованием органоидной культуры, а затем перенесены в систему вставок 2D ALI. Это важно, поскольку органоиды эпителия дыхательных путей не подходят для воздействия переносимых по воздуху веществ, тогда как использование системы ALI 2D позволяет оценить воздействие переносимых по воздуху веществ, таких как сигаретный дым^23,36, на культивируемые эпителиальные клетки дыхательных путей. Другой подход к созданию культур эпителиальных клеток дыхательных путей ALI заключается в создании эпителиальных клеток дыхательных путей путем дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSCs)³⁷. В таких протоколах на заключительном этапе протокола дифференцировки после дифференцировки на проксимальные предшественники дыхательных путей клетки могут быть дифференцированы путем культивирования до ALI с использованием процедур, аналогичных описанным здесь.

В действующем протоколе среда cBD используется для культивирования в ALI. Среда cBD представляет собой среду без сыворотки, которая готовится путем добавления смеси различных добавок, вдохновленных Fulcher et ^al.38 , а также другими исследованиями. Раствор добавки содержит 52 мкг/мл экстракта бычьего гипофиза (BPE), 0,5 мкг/мл гидрокортизона, 0,5 нг/мл человеческого EGF, 0,5 мкг/мл адреналина, 10 мкг/мл трансферрина, 5 мкг/мл инсулина, 6,5 нг/мл трийодтиронина и 0,1 нг/мл RA³⁹. Поскольку BPE представляет собой тканевый экстракт и подвергается периодическим изменениям, среда не может рассматриваться как полностью определенная среда и не свободна от животных. Среда для культивирования клеток, которая полностью определена, предпочтительна для минимизации различий между партиями. В связи с переходом к исследованиям, свободным от животных, важно, чтобы были предприняты усилия для производства определенных сред, которые не содержат продуктов животного происхождения и которые доступны для научного сообщества.

На основе модели ALI могут быть использованы различные экспериментальные установки, в зависимости от вопроса исследования. Например, чтобы исследовать влияние соединений, которые могут влиять на процесс дифференцировки, это может быть решено путем добавления соединений в культуру на различных стадиях погруженной культуры, во время дифференцировки или на хорошо дифференцированной стадии. На клеточный состав культуры ALI-PBEC можно влиять путем добавления специфических соединений; например, дифференцировка ALI-PBEC в присутствии IL-13 генерирует культуру с большим количеством бокаловидных клеток и меньшим количеством реснитчатых клеток, в то время как лечение ингибитором γ-секретазы DAPT (используемым для блокирования передачи сигналов Notch) во время дифференцировки приводит к культуре с большим количеством реснитчатых клеток за счет бокаловидных клеток 23,40,41,42.

Кроме того, агенты для стимуляции клеток или блокирования определенных процессов могут быть нанесены либо на базальный компартмент, либо (в очень малом объеме) на апикальный компартмент культуры. Клетки также могут подвергаться воздействию переносимых по воздуху веществ с апикальной стороны. Такие конструкции воздействия использовались для изучения влияния выхлопных газов дизельных двигателей или целого сигаретного дыма на PBEC 23,43,44. Среду можно собирать каждый раз, когда среда меняется для мониторинга секретируемых белков на базальной стороне; то же самое относится и к апикальной стороне клеток, которая промывается PBS при обновлении базальной среды. Собирают так называемую апикальную промывку и добавляют дополнительный дитиоэритрит (DTE) для более эффективной диссоциации слизи, вырабатываемой бокаловидными клетками. Клеточные лизаты могут быть получены для выделения общего белка, РНК, хромосомной и митохондриальной ДНК. Клетки могут быть дополнительно изучены с использованием антител к специфическим маркерам, путем разрезания полиэтилентерефталатной (ПЭТ) мембраны от пластиковой вставки и дальнейшего разрезания этой мембраны на более мелкие кусочки для многократного иммунофлуоресцентного окрашивания⁴⁵. Кроме того, проточная цитометрия или FACS также может быть использована после трипсинизации клеток во вставках. На стадии ALI развитие клеточного барьера можно контролировать, измеряя электрическое сопротивление и впоследствии вычисляя TEER, где электрическое сопротивление обратно пропорционально площади поверхности мембранной вставки. Расчет основан на законе Ома по следующей формуле: , где R_m — измеренное электрическое сопротивление, R_b — базовое электрическое сопротивление вставки без покрытия и ячеек, а SA — площадь поверхности мембраны вставки. Измерение электрического сопротивления с помощью электродов EVOM2 и STX / палочки для еды является простым, но сильно зависит от процедур обращения при введении его в скважину. Кроме того, было высказано предположение, что форма электрода влияет на измерение барьерной функции относительно большой площади^{поверхности 17}.

Дальнейшее совершенствование системы культивирования клеток ALI, направленное на повышение точного представления тканей, включает совместное культивирование дополнительных типов клеток, таких как лейкоциты, фибробласты или эндотелиальные клетки^46,47,48. Было замечено, что совместное культивирование ALI-PBEC с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) или M-CSF-дифференцированными макрофагами заметно влияет на врожденные эпителиальные реакции и репарацию⁴⁸. Важно отметить, что в таких моделях кокультуры средняя совместимость может быть проблемой. Поскольку среда, используемая для культивирования эпителиальных клеток дыхательных путей, разработана специально для PBEC и не может оптимально подходить для других типов клеток, необходима оптимизация. Другим типом достижений, наблюдаемых в области биологии дыхательных путей, для которых могут использоваться изолированные PBEC, является использование технологии «Органы-на-чипах» (OoC)^49,50. Используя эту технологию, можно изучить влияние механических сил дыхания и кровотока, таких как растяжение, воздушный и средний поток ²⁹.

Междонорская вариабельность может быть значительной при использовании PBEC от различных доноров, и поэтому важно рассмотреть возможность использования клеток от нескольких доноров для учета этой вариабельности в исследованиях эпителиальных клеточных культур. Поскольку культивирование ALI-PBEC занимает много времени и связано со значительными затратами, рассматривается возможность создания культур ALI-PBEC путем смешивания клеток от разных доноров в одном вкладыше для клеточной культуры. Таким образом, пилотные эксперименты могут быть легко выполнены с использованием первичных клеток, прежде чем анализировать ответы культур, полученных от различных отдельных доноров . Кроме того, доноры с разными характеристиками (например, разной возрастной категорией или полом) могут быть сгруппированы для поисковых исследований. При использовании донорских смесей важно убедиться, что присутствует равное количество клеток разных доноров, чтобы предотвратить возможность того, что один донор будет доминировать в результатах в результате более высокой скорости пролиферации. Таким образом, клетки от отдельных доноров расширяются отдельно и высеваются с более высокой плотностью во вставке по сравнению с посевными клетками от отдельного донора, чтобы свести к минимуму пролиферацию во вставке перед переходом на ALI. Ответы донорских смесей и соответствующих индивидуальных доноров сравнивали путем изучения кинетики инфекции SARS-CoV-2. Используя ОТ-кПЦР и иммунофлуоресцентное окрашивание, было замечено, что донорская смесь обеспечивает хорошее представление о различных отдельных донорах, демонстрируя одинаковое количество продуцируемых вирусных частиц и одинаковое количество инфицированных клеток²⁸.

Чтобы стать приемлемой альтернативой для животных моделей, редактирование генов культивируемых эпителиальных клеток бронхов должно быть^{осуществимым 51}. Исследуется технология РНК-интерференции с использованием малых интерферирующих РНК (миРНК) в ALI-PBEC, однако, поскольку клетки должны быть трансфицированы миРНК во время погруженной фазы культивирования, нокдаун недостаточно поддерживается во время культивирования ALI из-за длительной продолжительности культивирования, если трансфекция миРНК часто не повторяется во время культивирования⁵². Тем не менее, миРНК могут быть успешно использованы для модификации экспрессии генов в погруженных базальных клетках. Другие успешно использовали технологию CRISPR/Cas9 для редактирования генов в первичных культурах эпителиальных клеток дыхательных путей ALI с доставкой рибонуклеопротеина (RNP) ⁵³. При использовании таких методов важно, чтобы клетки сохраняли свою полную способность к дифференцировке. Поскольку первичные культуры клеток дыхательных путей не могут передаваться бесконечно, клональная экспансия генно-отредактированных клеток непроста, а добавление среды для отбора трансфицированных клеток является громоздким. Поэтому трудно добиться желаемого нокдауна во всех культивируемых клетках. Альтернативой для создания нокаутных клонов является использование стратегий нокаута в hiPSCs⁵⁴ и использование этих клеток для генерации эпителиальных клеток дыхательных путей. Другой, хотя и неоптимальной, альтернативой является создание иммортализированной линии PBEC для клонального расширения генно-отредактированных клеток⁵⁵.

Представленный здесь протокол является одним из способов создания хорошо дифференцированного псевдостратифицированного ALI-PBEC, но было обнаружено, что другие протоколы также устанавливают такую культуру с меньшими и большими различиями по сравнению с представленным протоколом. По нашему мнению, лабораторная валидация методов культивирования и строгий контроль качества необходимы для того, чтобы система ALI-PBEC и аналогичные системы культивирования эпителиальных клеток дыхательных путей стали действительной альтернативой для экспериментов на животных.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследования с использованием модели, описанной в этом материале, были поддержаны различными финансирующими организациями, включая Фонд легких Нидерландов, Нидерландскую организацию исследований и разработок в области здравоохранения (ZonMw, грант COVID-19 MKMD), Голландское общество по замене испытаний на животных (Stichting Proefdiervrij, грант #114025007), а также исследовательские гранты от таких компаний, как Boehringer Ingelheim и Galapagos. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.

Materials

1,000 ohm test resistor	World Precision Instruments	N/A	Used to calibrate the EVOM2 Epithelial Voltohmmeter
4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoic acid (EC 23)	Tocris	4011	Used in cBD medium
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning	3506	Used in the first step to grow the cells isolated form the bronchial ring
Airway Epithelial Cell Growth Medium Kit	PromoCell	C-21160	Used to compare to cBD medium
Bead Bath 20 Liter	Lab Armor	74220-720	Used to pre-warm cell culture solutions
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKit	LONZA	CC-3170	Used to compare to cBD medium
Bovine albumin fraction V (BSA)	Thermo Fisher Scientific	15260037	Used in coating solution
Bovine pituitary extract (BPE)	Thermo Fisher Scientific	37000-015	Used in c-KSFM
Bronchial epithelial cell growth supplement (BEpiCGS)	ScienCell Research Laboratories	3262	Used in cBD medium
Bronchial epithelial cell medium-basal (BEpiCM-b)	ScienCell Research Laboratories	SCC3211-b	Used in cBD medium
Cell culture inserts; 12 mm Transwell with 0.4 µm pore polyester membrane insert	Corning	3460	Cell culture inserts used in the protocol
Cell culture inserts; 12-well inserts, 0.4 µm PET clear	CellQART made by SABEU	9310412	Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts
Cell culture inserts; 12-well ThinCert Tissue culture Inserts	Greiner Bio-One	82050-032	Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts
CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm²	Greiner Bio-One	658170	Used to expand the number cells
CFX Maestro 1.0	Bio-Rad	N/A	Software program for analyzing qPCR data generated with the CFX384 System
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855484	qPCR detection system
Chopstick electrode set	World Precision Instruments	STX2	Used to measure electrical resistance in ALI-PBEC
CO₂-Incubator	PHCbi	MCO-170AICUV-PE	Cell culture incubator used for mycplasma free cell cultures
CO₂-Incubator	Hereaus	Heracell 150	Cell culture incubator used for possibly mycplasma infected cell cultures
Coolcell Container	Corning	432006	Used to cryopreserve cells at -80 °C before transfer to liquid N2
Countess 3 Automated cell counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX2000	Used to count cells and determine the cell concentration
Cryovials	Nalgene	479-3224	Used to cryopreserve cells in
D-Glucose	Avantor VWR BDH CHEMICALS	101174Y	Used in soft trypsin
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Avantor VWR	0231	Used in cell freeze medium
dNTP (10 mM)	Promega	U1515	Used in the synthesis of cDNA
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose	STEMCELL Technologies	36250	Used in cBD medium
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4.5 g/l glucose with l-glutamine	LONZA	LOBE12-604F	Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	41966029	Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers
Epidermal growth factor (EGF)	Thermo Fisher Scientific	37000-015	Used in c-KSFM
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Avantor VWR BDH CHEMICALS	443885J	Used in soft trypsin
EVOM2 Epithelial Voltohmmeter	World Precision Instruments	91799	Used with the chopstick electrode set to measure electrical resistance in ALI-PBEC
Fibronectin solution, Human	PromoCell	C-43060	Used in coating solution
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	Used in cBD medium
Hanks balanced salt solution (HBSS)	ScienCell Research Laboratories	SCC0313	Used to dissolve protease XIV
IQ SYBR Green Super mix	Bio-Rad	170887	qPCR reagent
Isoproterenol hydrochloride, (-)-	Sigma-Aldrich	I-6504	Used in c-KSFM
Keratinocyte-SFM (KSFM)	Thermo Fisher Scientific	17005-034	Used in c-KSFM
Maxwell RSC Instrument	Promega	AS4500	Automated RNA isolation system
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit	Promega	AS1340	Used to isolate total RNA with the Maxwell RSC Instrument
M-MLV Reverse transcriptase	Promega	M5301	Used in the synthesis of cDNA
M-MLV Reverse transcriptase 5X reaction buffer	Promega	M531A	Used in the synthesis of cDNA
MycoStrip	InvivoGen	rep-mys-10	Used to detect the presence of mycoplasma in cell culture samples
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)	Thermo Fisher Scientific	15630056	Used in cBD medium
Oligo(dT)₁₅	Qiagen	79237	Used in the synthesis of cDNA
Penicillin/Streptomycin solution (Pen/Strep)	ScienCell Research Laboratories	SCC0513	Used as antibiotic in c-KSFM and cBD medium
Phosphate buffered saline (PBS)	LUMC pharmacy	N/A	Used in different steps of the protocol
Pneumacult-ALI Medium	STEMCELL Technologies	05002	Used to grow cells in the differentiation stage to compare to cBD medium
Pneumacult-Ex Plus Medium	STEMCELL Technologies	05040	Used to grow cells in the submerged stage to compare to cBD medium
Primer, ATP5B, forward	Integrated DNA Technologies	N/A	Nucleotide sequence: TCACCCAGGCTGGTTCAGA
Primer, ATP5B, reverse	Integrated DNA Technologies	N/A	Nucleotide sequence: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT
Primer, FOXJ1, forward	Integrated DNA Technologies	N/A	Nucleotide sequence: GGAGGGGACGTAAATCCCTA
Primer, FOXJ1, reverse	Integrated DNA Technologies	N/A	Nucleotide sequence: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC
Primer, MUC5AC, forward	Integrated DNA Technologies	N/A	Nucleotide sequence: CCTTCGACGGACAGAGCTAC
Primer, MUC5AC, reverse	Integrated DNA Technologies	N/A	Nucleotide sequence: TCTCGGTGACAACACGAAAG
Primer, MUC5B, forward	Integrated DNA Technologies	N/A	Nucleotide sequence: GGGCTTTGACAAGAGAGT
Primer, MUC5B, reverse	Integrated DNA Technologies	N/A	Nucleotide sequence: AGGATGGTCGTGTTGATGCG
Primer, RPL13A, forward	Integrated DNA Technologies	N/A	Nucleotide sequence: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG
Primer, RPL13A, reverse	Integrated DNA Technologies	N/A	Nucleotide sequence: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC
Primer, SCGB1A1, forward	Integrated DNA Technologies	N/A	Nucleotide sequence: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC
Primer, SCGB1A1, reverse	Integrated DNA Technologies	N/A	Nucleotide sequence: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA
Primer, TP63, forward	Integrated DNA Technologies	N/A	Nucleotide sequence: CCACCTGGACGTATTCCACTG
Primer, TP63, reverse	Integrated DNA Technologies	N/A	Nucleotide sequence: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	Used as antimicrobial agent against bacteria, mycoplasma, and fungi in c-KSFM medium
Protease XIV	Sigma-Aldrich	P5147	Used for the enzymatic treatment of the bronchial ring
RNAsin Recombinant Ribonuclease inhibitor	Promega	N2515	Used in the synthesis of cDNA
Soybean trypsin inhibitor (SBTI)	Sigma-Aldrich	T9128	Used to inhibit the action of soft trypsin
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096	Used in the synthesis of cDNA
TissueSAFE plus	MILESTONE MEDICAL	N/A	Vacuum transfer system for biological specimens
Trypan blue solution	Thermo Fisher Scientific	15250061	Used to count live- and dead cells
Trypsin 1:250	Thermo Fisher Scientific	27250-018	Used in soft trypsin
Type I collagen solution (PureCol)	Advanced BioMatrix	5005-B	Used in coating solution
Universal container, PP, with PE screw cap	Avantor VWR	216-2053	Used in the protocol for the Protease XIV treatment of the bronchial ring

References

Aghapour, M., et al. Role of air pollutants in airway epithelial barrier dysfunction in asthma and COPD. European Respiratory Review. 31 (163), 210112 (2022).
de Waal, A. M., Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
Duchesne, M., Okoye, I., Lacy, P. Epithelial cell alarmin cytokines: Frontline mediators of the asthma inflammatory response. Frontiers in Immunology. 13, 975914 (2022).
Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
Ruysseveldt, E., Martens, K., Steelant, B. Airway basal cells, protectors of epithelial walls in health and respiratory diseases. Frontiers in Allergy. 2, 787128 (2021).
Alysandratos, K. D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration. Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).
Hammad, H., Lambrecht, B. N. Barrier epithelial cells and the control of type 2 immunity. Immunity. 43 (1), 29-40 (2015).
Hynds, R. E., Bonfanti, P., Janes, S. M. Regenerating human epithelia with cultured stem cells: feeder cells, organoids and beyond. EMBO Molecular Medicine. 10 (2), 139-150 (2018).
Hiemstra, P. S., Tetley, T. D., Janes, S. M. Airway and alveolar epithelial cells in culture. The European Respiratory Journal. 54 (5), 1900742 (2019).
Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
Leung, C., Wadsworth, S. J., Yang, S. J., Dorscheid, D. R. Structural and functional variations in human bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface using different growth media. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1063-L1073 (2020).
Morgan, R., et al. A medium composition containing normal resting glucose that supports differentiation of primary human airway cells. Scientific Reports. 12 (1), 1540 (2022).
Ghosh, B., et al. Strong correlation between air-liquid interface cultures and in vivo transcriptomics of nasal brush biopsy. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1056-L1062 (2020).
Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 300 (1), L25-L31 (2011).
Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air-liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 465-473 (2011).
Legebeke, J., et al. Temporal whole-transcriptomic analysis of characterized in vitro and ex vivo primary nasal epithelia. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 907511 (2022).
Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
van Wetering, S., et al. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. Journal of Investigative Medicine. 48 (5), 359-366 (2000).
Balk, S. D. Calcium as a regulator of the proliferation of normal, but not of transformed, chicken fibroblasts in a plasma-containing medium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 68 (2), 271-275 (1971).
Gail, M. H., Boone, C. W., Thompson, C. S. A calcium requirement for fibroblast motility and prolifertion. Experimental Cell Research. 79 (2), 386-390 (1973).
Dulbecco, R., Elkington, J. Induction of growth in resting fibroblastic cell cultures by Ca. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72 (4), 1584-1588 (1975).
van Wetering, S., et al. Epithelial differentiation is a determinant in the production of eotaxin-2 and -3 by bronchial epithelial cells in response to IL-4 and IL-13. Molecular Immunology. 44 (5), 803-811 (2007).
Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. The European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 239-245 (2010).
Schrumpf, J. A., Ninaber, D. K., vander Does, A. M., Hiemstra, P. S. TGF-β1 impairs vitamin D-induced and constitutive airway epithelial host defense mechanisms. Journal of Innate Immunity. 12 (1), 74-89 (2020).
Schrumpf, J. A., et al. Proinflammatory cytokines impair vitamin D-induced host defense in cultured airway epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (6), 749-761 (2017).
Boei, J. J. W. A., et al. Xenobiotic metabolism in differentiated human bronchial epithelial cells. Archives of Toxicology. 91 (5), 2093-2105 (2017).
Wang, Y., et al. Impact of human airway epithelial cellular composition on SARS-CoV-2 infection biology. bioRxiv. , (2021).
Nawroth, J. C., et al. Breathing on Chip: Dynamic flow and stretch tune cellular composition and accelerate mucociliary maturation of airway epithelium in vitro. bioRxiv. , (2022).
Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
Eenjes, E., et al. Disease modeling following organoid-based expansion of airway epithelial cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (4), L775-L786 (2021).
Butler, C. R., et al. Rapid expansion of human epithelial stem cells suitable for airway tissue engineering. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (2), 156-168 (2016).
Amatngalim, G. D., et al. Antibacterial defense of human airway epithelial cells from chronic obstructive pulmonary disease patients induced by acute exposure to nontypeable Haemophilus influenzae: modulation by cigarette smoke. Journal of Innate Immunity. 9 (4), 359-374 (2017).
Plebani, R., et al. 3D lung tissue models for studies on SARS-CoV-2 pathophysiology and therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 10071 (2022).
Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature Biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 107, 183-206 (2005).
Cao, J., Wong, C. K., Yin, Y., Lam, C. W. K. Activation of human bronchial epithelial cells by inflammatory cytokines IL-27 and TNF-alpha: implications for immunopathophysiology of airway inflammation. The Journal of Cellular Physiology. 223 (3), 788-797 (2010).
Tsao, P. N., et al. Notch signaling controls the balance of ciliated and secretory cell fates in developing airways. Development. 136 (13), 2297-2307 (2009).
Laoukili, J., et al. IL-13 alters mucociliary differentiation and ciliary beating of human respiratory epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 108 (12), 1817-1824 (2001).
Mertens, T. C. J., et al. Cigarette smoke differentially affects IL-13-induced gene expression in human airway epithelial cells. Physiological Reports. 5 (13), e13347 (2017).
Zarcone, M. C., et al. Effect of diesel exhaust generated by a city bus engine on stress responses and innate immunity in primary bronchial epithelial cell cultures. Toxicology in Vitro. 48, 221-231 (2018).
vander Does, A. M., et al. Early transcriptional responses of bronchial epithelial cells to whole cigarette smoke mirror those of in-vivo exposed human bronchial mucosa. Respiratory Research. 23 (1), 227 (2022).
Wang, Y., Ninaber, D. K., van Schadewijk, A., Hiemstra, P. S. Tiotropium and fluticasone inhibit rhinovirus-induced mucin production via multiple mechanisms in differentiated airway epithelial cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 278 (2020).
Ronaghan, N. J., et al. M1-like, but not M0- or M2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion. PLoS One. 17 (10), 0276013 (2022).
Gindele, J. A., et al. Opposing effects of in vitro differentiated macrophages sub-type on epithelial wound healing. PLoS One. 12 (9), e0184386 (2017).
van Riet, S., et al. Modulation of airway epithelial innate immunity and wound repair by M(GM-CSF) and M(M-CSF) macrophages. Journal of Innate Immunity. 12 (5), 410-421 (2020).
Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
Stucki, A. O., et al. A lung-on-a-chip array with an integrated bio-inspired respiration mechanism. Lab on a Chip. 15 (5), 1302-1310 (2015).
Peters-Hall, J. R., et al. Long-term culture and cloning of primary human bronchial basal cells that maintain multipotent differentiation capacity and CFTR channel function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (2), L313-L327 (2018).
Bartman, C. M., Stelzig, K. E., Linden, D. R., Prakash, Y. S., Chiarella, S. E. Passive siRNA transfection method for gene knockdown in air-liquid interface airway epithelial cell cultures. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), L280-L286 (2021).
Koh, K. D., et al. Efficient RNP-directed human gene targeting reveals SPDEF is required for IL-13-induced mucostasis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (3), 373-381 (2020).
Bhargava, N., et al. Development of an efficient single-cell cloning and expansion strategy for genome edited induced pluripotent stem cells. Molecular Biology Reports. 49 (8), 7887-7898 (2022).
Angelopoulou, A., Papaspyropoulos, A., Papantonis, A., Gorgoulis, V. G. CRISPR-Cas9-mediated induction of large chromosomal inversions in human bronchial epithelial cells. STAR Protocols. 3 (2), 101257 (2022).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Ninaber, D. K., van der Does, A. M., Hiemstra, P. S. Isolating Bronchial Epithelial Cells from Resected Lung Tissue for Biobanking and Establishing Well-Differentiated Air-Liquid Interface Cultures. J. Vis. Exp. (195), e65102, doi:10.3791/65102 (2023).