バイオバンキングのための切除肺組織からの気管支上皮細胞の単離と高分化気液界面培養の樹立

オランダのライデン大学医療センターで肺癌の切除手術を受けた患者から得られた肉眼的に正常な肺組織から細胞を単離した。この肺組織が由来する患者は、そのような組織のコード化された匿名のさらなる使用のための異議なしシステム を介して バイオバンクに登録されました(www.coreon.org)。ただし、2022年1月9日以降、患者は、施設の医療倫理委員会(B20.042 / Ab / abおよびB20.042 / Kb / kb)の承認を得て、LUMCバイオバンクからの地域の規制に従って、積極的なインフォームドコンセントを使用してバイオバンクに登録されています。 注意: すべての手順は、特に明記されていない限り、地域の生物学的安全規則に従って、生物学的安全キャビネット内で、手術用手袋と白衣を着用した状態で無菌の作業条件下で実行されます。プロトコルで使用されるすべての培地、試薬、およびその他の溶液については、 材料 表および 補足表1を参照してください。プロトコルの詳細な手順については、 図 1 を参照してください 1.ヒト肺組織からの気管支上皮細胞の単離 注:気管支上皮細胞分離の最適な成功率を得るには、切除した気管支リングをプリモシンを添加したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に最大24時間4°Cで沈めておく必要があります。 手順開始前の準備補足表1に記載のようにPBS中でコーティング溶液を調製し、ウェルあたり1.5 mLのコーティング溶液で適切な数の6ウェルプレートをコーティングします。細胞培養インキュベーター内で37°C、5%CO2で2時間インキュベートします。注:コーティングされるウェルの数は、切除された組織のサイズに依存します。大まかな目安として、摘出気管支リングの直径が10mm、幅が4mmの場合、4枚の6ウェルプレートをコーティングします。 補足表1に記載されているように、完全なケラチノサイト無血清培地(c-KSFM)を準備します。6ウェルプレートのウェルあたり2 mLの培地を使用します。注:このc-KSFMは、4°Cで7日間保存できます。c-KSFMは、汚染された線維芽細胞の増殖を抑制しながら気道上皮細胞を増殖させるために使用される低カルシウム培地です。 10 cmのペトリ皿で10 mLの滅菌PBSでリングを穏やかにすすぎ、気管支リングを洗浄します。ピンセットを使用してリングを注意深く保持し(外側にのみ触れます)、小さなはさみを使用して余分な結合組織と血液の残りを取り除きます。さらに処理するには、リングを2つにカットします。注意: プロセスで使用されるすべてのツールは、使用前に滅菌する必要があります。 気管支リングの2つの半分を、密閉滅菌容器内のプリモシンを含むハンクス平衡塩溶液(HBSS)中のプロテアーゼXIV(1.8 mg / mL)の予熱溶液10 mLに浸し、細胞培養インキュベーターで37°Cで正確に2時間インキュベートします。注:HBSSは、2時間のインキュベーション期間中に細胞を組織から剥離するためのプロテアーゼXIVの希釈液として使用されます。HBSSは、短期間のインキュベーション中に細胞生存率を維持することを可能にするバランスの取れた等張溶液です。 インキュベーション後、組織片を10 mLの温かいPBSと共にシャーレに移し、ピンセットを曲げてリングの内側をこすり、細胞溶液を得た。注意: 組織は柔らかく、やや拡張しているように見えます。 リングを廃棄し、細胞溶液を50 mLチューブに移し、温かいPBSを加えて最終容量50 mLを得ます。230 x g 、室温(RT)で7分間遠心分離します。 上清を吸引し、ペレットを10 mLの温かいPBSに再懸濁します。さらに、温かいPBSで50mLまでの容量を補います。RTで230 x g で7分間遠心分離します。 上清を吸引し、細胞ペレットをプリモシンを含む適量の温かいc-KSFMに再懸濁する。注:プリモシンは、組織に存在していた可能性のある細菌、真菌、または(重要な)マイコプラズマを排除するために最低7日間使用されます。7日後、ペニシリン/ストレプトマイシンのみを培地に添加するだけで十分です。 6ウェルプレートからコーティング溶液を吸引し、ウェルあたり2 mLの細胞懸濁液を加えます。 80%から90%のコンフルエントに達するまで細胞を増殖させ、培地を週に3回(例えば、毎週月曜日、水曜日、金曜日)交換する。望ましい程度のコンフルエンシーは通常7〜14日の間に到達します。所望のコンフルエントに達するのに必要な時間が14日を超える場合は、細胞を廃棄する。注:最初の数日間は、少数の細胞だけが増殖し始めます。細胞のグループは数日後に目立ちます。 2. ヒト初代気管支上皮細胞(PBEC)の凍結保存 注意: -80°Cおよび-196°Cの温度で作業する場合、保護にはクライオグローブが使用され、凍結バイアルの移動にはピンセットが使用されます。液体窒素を扱う場合、凍結手袋とフェイスシールドが個人用保護に使用されます。 培地を吸引し、ウェルあたり2 mLの温かいPBSでウェルを1回洗浄します。 ウェルあたり0.5 mLのソフトトリプシンを添加して細胞をトリプシン化します(ソフトトリプシン溶液の組成については 補足表1 を参照)。細胞を37°Cで5〜最大10分間インキュベートします。 プレート内でトリプシン溶液を旋回させ、プレートを軽くたたいて細胞を放出します。 剥離した細胞を、ペニシリン/ストレプトマイシンを含むKSFMに溶解した1.1 mg/mL大豆トリプシン阻害剤(SBTI;トリプシン活性を阻害するため)を含む50 mLの遠沈管に移します。SBTIの容量は、ソフトトリプシンの総容量の2倍でなければなりません(つまり、1ウェルあたり1 mL)。注:細胞は数分以内に再付着するため、SBTIをウェルに直接添加しないでください。 チューブをRTで230 x g で7分間遠心分離します。 上清を廃棄し、ペレット化した細胞をペニシリン/ストレプトマイシンを含むが他の添加物を含まない10 mLのRT KSFMに再懸濁します。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。トリパンブルーを1:1の比率で添加して生細胞/死細胞カウントを実行するか、別の生細胞/死細胞カウント手順を使用します。 凍結培地あたり400,000細胞の濃度で細胞を凍結保存し(組成については 補足表 1を参照)、クライオバイアルあたりこの懸濁液を1 mL加えます。クライオバイアルをクールセル容器に移し、-80°Cに置きます。 24時間後、バイアルを-196°Cの液体窒素に移し、長期保存します。注:細胞を凍結培地に移すには2つの選択肢があり、どちらもうまく機能します:1)遠心分離によって細胞を再度ペレット化し、必要な細胞濃度で低温凍結培地に再懸濁します。または2)低温凍結培地を添加し、細胞が存在するKSFMの量に基づいて凍結保存剤(ジメチルスルホキシド[DMSO])の濃度を調整します。 3. 凍結保存したPBECを解凍し、インサート上で培養するために増殖させる T75細胞培養フラスコに、蓋をしっかりと閉めた状態でPBS中の10 mLのコーティング溶液で一晩コーティングします。フラスコを37°Cおよび5%CO2の細胞培養インキュベーター内でインキュベートする。 凍結保存されたPBECを解凍する前に、フラスコからコーティング溶液を取り出し、10 mLのc-KSFMで満たします。細胞培養インキュベーターで37°Cに温め、蓋を少し開いてインキュベーターに空気を入れます。 細胞を37°Cの水浴またはビーズ浴で素早く解凍します。注:ビーズバスは、汚染のリスクが低く、エネルギー消費が少ないため、ウォーターバスよりも好まれます。 培地を入れた予熱したT75フラスコにクライオバイアルの全内容物を加え(ステップ3.2)、細胞を均等に分配します。注:細胞は遠心分離ステップに耐えられないため、この段階では細胞を遠心分離しないでください。 約4時間後、細胞が十分に付着していることを確認します。培地を10 mLの新鮮で温かいc-KSFMと交換します。注:このようにして、凍結培地からDMSOが除去されます。このステップは、フラスコに細胞を播種してから4時間から24時間の間に行われるべきです。 80%から90%のコンフルエントに達するまで細胞を増殖させ、毎週月曜日、水曜日、金曜日に培地を交換します。 4. 初代気管支上皮細胞(ALI-PBEC)との気液界面培養の確立 注:次の手順は、内径11.9 mmのインサートでPBECを培養するためのものです。 適切な数の細胞培養インサートを、インサートあたり0.4 mLのコーティング溶液でコーティングします。細胞培養インキュベーター内で37°Cで一晩インキュベートします。 補足 表1に記載のとおり、完全なBD培地(cBD培地)を調製する。注:cBD培地は、ステップ4.10で概説されているように、レチノイン酸(RA)(または本プロトコルで使用されるRAの類似体)濃度およびALIでの培養の増加後の分化を可能にしながら、気管支上皮細胞の増殖を長期間サポートするように処方された複合培地( 補足表1を参照)です。 フラスコあたり2 mLのソフトトリプシンを使用して、T75フラスコ内のPBECをトリプシン化します。細胞を5〜10分間インキュベートして、細胞を剥離させます(目視検査に基づく)。5分間のインキュベーション後、フラスコ内のトリプシンを旋回させ、フラスコを軽くたたくことにより、細胞の剥離を促進します(必要に応じて繰り返します)。 4 mLのSBTIをフラスコに加え、細胞懸濁液を25 mLの遠沈管に直接移します。メモ: セルは数分以内に再結合します。したがって、複数のフラスコで作業する場合、ステップ4.4で得られた細胞懸濁液は、SBTIを第2のフラスコに添加する前に、遠沈管に直接移す必要があります。この手順では、最大5つのフラスコが同時に処理されます。 RTで230 x g でチューブを7分間遠心分離します。 細胞を6 mLのcBD培地に再懸濁し、血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。たとえば、トリパンブルーを1:1の比率で添加するか、別の生細胞/死細胞カウント手順を使用して、生細胞/死細胞カウントを実行します。 細胞培養インサートからコーティング溶液を取り除きます。 ステップ4.6で生成した細胞懸濁液を、1 nM EC 23を添加したcBD培地で1 mLあたり80,000細胞の濃度に希釈し、インサートのメンブレンの上部に0.5 mLを加えます。1 nM EC 23を添加した1.5 mLのcBD培地をインサートの下のウェルに追加します。 培養物が空気曝露の準備ができるまで(すなわち、100%コンフルエンシーに達した2日後)、1 nM EC 23を添加したcBD培地を週に3回交換します。毎回、0.5 mLの培地がインサートの内側(細胞上)に添加され、1.5 mLが下部コンパートメント(ウェル)に追加されます。注:一般に、細胞層は、インサートにPBECを播種してから約5日後に100%コンフルエントに達します。細胞のコンフルエンシーの目視検査に基づいて、2日後に細胞をALIステージに移すことを決定する。 細胞をALIに移す準備ができたら(すなわち、100%コンフルエントに達した2日後)、インサートとウェルから培地を取り出し、インサート内に新しい培地を追加せず、新しい培地(50 nM EC 23を添加した1 mLのcBD培地)をウェルにのみ追加します。ウェル内の培地を週に3回交換してください。 余分な粘液や細胞破片を除去するには、インサート内の細胞層の頂端側に200 μLの温かいPBSを穏やかに添加し(できれば、細胞を直接ピペッティングするのではなく、インサートの側面 を介して )、37°Cの細胞培養インキュベーターで10分間インキュベートします。 次に、PBSを吸引して、余分な粘液や細胞の破片を取り除きます。注:この時点(ALI培養の開始)以降、下部コンパートメントの培地を交換する前に、毎回細胞の頂端側をPBSで洗浄します。 ALIで細胞を最低2週間培養して、すべての主要な細胞タイプが表現されていることを確認します。 5. 混合ドナー集団からのALI-PBEC培養の確立 最大5人の個人ドナーの細胞を使用して、混合集団からPBEC培養を開始します。 ステップ4.7で生成した細胞を使用してドナーあたり同数の細胞を混合し、インサートあたり合計150,000細胞(つまり、5人のドナーを使用する場合はドナーあたり30,000細胞)に到達します。これにより、インサート内の増殖が最小限に抑えられ、個々のドナーからの同数の細胞が培養中に存在することが保証されます。 手順 4.9 から 4.12 の説明に従って、ALI-PBEC 培養を続行します。 6. ALI-PBEC文化の品質管理 細胞培養中の経上皮電気抵抗(TEER)のモニタリング注:電圧計の使用に基づく電気抵抗測定は、ALI-PBEC培養中の任意の時点で実行でき、電気抵抗測定は電極位置、温度、媒体、取り扱いなどのさまざまな変数の影響を受けるため、同じプロトコルに従って同じ条件下で毎回実行されます。TEERは、オームの法則に基づいて次の式を適用することにより、測定された電気抵抗を使用して計算できます: ここで、Rmは 測定された電気抵抗であり、Rb はコーティングおよびセルのないインサートのベースライン電気抵抗であり、SAはインサート17の膜の表面積です。200 μLの温かいPBSを細胞層の頂端側に静かに加え、細胞上の粘液や破片を取り除きます。インサートを37°Cの細胞培養インキュベーターで10分間インキュベートし、PBSを再度除去します。 700 μLの温かいPBSを細胞層の頂端側に穏やかに添加し、インサートをRTで10分間インキュベートして、測定の温度を安定させます。 1,000 Ωのテスト抵抗を使用してボルトオーム計を校正し、ボルトオームを測定するようにボルトオーム計を設定し、ドライバーを使用して1,000 Ωに設定されるまで「R ADJ」校正ネジを調整します。 電極を滅菌水(RT)で数回上下に動かしてから、滅菌PBS(RT)で動かしてすすぎます。 インサート内のセル層の電気抵抗を測定します。このために、電極の長いアームがプレートの底に触れた状態で、電極をウェル内の垂直位置に置きます。このように、短いアームはインサート内のセル層の上にあります。ボルトオームメーターに表示されている値を読み取ります。注意: 表示される値は完全には安定しません。値が断続的になった瞬間に値を読み取ります。 測定の合間に、滅菌PBS(RT)で電極を数回上下に動かして洗浄します。 測定が終了したら、滅菌水(RT)、滅菌PBS(RT)、および70%エタノール(RT)で電極を数回上下に動かして電極を洗浄します。電極を乾かして保管してください。 インサート内に700 μLの温かいPBSを、ウェルに1 mLの温かいPBSを加え、他のインサートと一緒に電気抵抗を測定することで、インサート(コーティングなし)と細胞のベースライン測定を実行します。 ALI-PBEC培養物の細胞組成の評価ALI段階では、拍動繊毛を視覚的に評価して鑑別を確認します。これらは、細胞の頂端側の空気曝露後9日という早い 時期に、標準的な 明視野顕微鏡で観察することができます。注:鼓動繊毛は、頂端表面を洗浄した直後に最もよく見えます。ゴブレット細胞は粘液を産生するため、頂端表面の洗浄中に観察される粘液の存在は、杯細胞が形成される兆候です。ただし、杯細胞のレベルと産生される粘液の量は、ドナーに大きく依存します。粘液の存在は、インサート内の細胞層の頂端表面を洗浄した後にPBSを吸引するときに見ることができます。この場合、吸引されたPBSはより粘性があり、吸引中に粘液糸が観察される可能性があります。 免疫染色および蛍光顕微鏡または蛍光活性化セルソーティング(FACS)を用いた細胞組成物の評価、またはリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)による遺伝子発現解析は、培養の分化状態に関する重要な情報を提供するが、その説明はこの貢献の範囲を超えている。 図1:初代気管支上皮細胞の単離、増殖、および培養手順の概略図。 (A)がん切除手術中に肺組織が得られ、病理医は肉眼的に正常で腫瘍のない気管支輪組織を切除します。(B)気管支リングを洗浄し、酵素処理にさらして細胞層を剥離および解離させる。(c)回収した細胞懸濁液を洗浄し、細胞を増殖のために6ウェルプレートのウェルに分配する。(D)プリモシンを含むc-KSFMで単離した細胞を十分に増殖させた後、細胞層をトリプシン処理によって解離させ、細胞を凍結保存用の凍結培地に再懸濁します。必要に応じて、凍結保存された細胞を解凍し、細胞培養フラスコ内のペニシリン/ストレプトマイシンを含むc-KSFMを使用して再度増殖させます。増殖後、それらは細胞培養インサート上のcBD培地に播種されます。(イー)ALI-PBEC培養は、主に2つの段階で行われます:細胞が完全にコンフルエントに達するまで1 nM EC 23を添加したcBD培地に沈めた段階、続いて頂端培地を除去し、ALIで培養して分化を可能にします。このALI期において、細胞は、50nM EC23を添加したcBD培地中で培養される。(エブ)水中培養中にインサートを覆う基底細胞のグラフ表示。(エック)増加した濃度のEC23の存在下でALIでの培養後に得られた分化上皮細胞層のグラフ表示。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。