Представлен протокол выращивания высоковоспроизводимых сфероидов и их фенотипическая характеристика с использованием захвата изображений и протеомики.
Представлен протокол, описывающий свойства и преимущества использования автономного клиностат-инкубатора для выращивания, обработки и мониторинга 3D-клеточных культур. Клиностат имитирует среду, в которой клетки могут собираться в высоковоспроизводимые сфероиды с низкими силами сдвига и активной диффузией питательных веществ. Мы демонстрируем, что как раковым, так и нераковым гепатоцитам (клеточным линиям HepG2/C3A и THLE-3) требуется 3 недели роста, прежде чем они достигнут функциональности, сопоставимой с клетками печени. Этот протокол подчеркивает удобство использования инкубаторов для 3D-клеток с камерами, отслеживающими рост клеток, поскольку снимки могут быть сделаны для подсчета и измерения сфероидов после обработки. Мы описываем сравнение клеточных линий THLE-3 и HepG2/C3A, показывая, как можно выращивать нераковые клеточные линии, а также иммортализировать раковые клетки. Мы демонстрируем и иллюстрируем, как эксперименты по протеомике могут быть проведены из нескольких сфероидов, которые могут быть собраны без нарушения клеточной сигнализации, т.е. без трипсинизации. Показано, что протеомный анализ может быть использован для мониторинга типичного для печени фенотипа метаболизма дыхательной цепи и продукции белков, участвующих в детоксикации металлов, и описана полуавтоматическая система для подсчета и измерения площади сфероида. В целом, протокол представляет собой набор инструментов, который включает в себя фенотипическую характеристику с помощью захвата изображений и конвейер протеомики для экспериментов на 3D-моделях клеточных культур.
Было доказано, что культуры клеток in vitro необходимы и бесценны для создания фундаментальных знаний в биологии. Большая часть научных знаний в биологии и, в частности, в раке пришла из двухмерной системы культивирования, которая представляет собой клетки, растущие в монослое. Несмотря на то, что двухмерная культура является доминирующей системой культивирования клеток, она имеет много недостатков, которые потенциально могут задушить дальнейший биологический прогресс. Например, в 2D-культурах отсутствуют межклеточные взаимодействия, важные для клеточной сигнализации и пролиферации1. На сегодняшний день было показано, что 3D-системы культивирования лучше моделируют дифференцировку, реакцию на лекарственные препараты, опухолевую инвазию и биологию 2,3,4,5. 3D-моделирование злокачественных опухолей особенно актуально в связи со старением населения и смертностью от рака. Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является одной из ведущих причин смертности, связанной с раком, во всем мире и часто имеет ужасный прогноз6. Известно, что ГЦК имеет низкую частоту излечения, плохую реакцию на лекарственные препараты и высокую частоту рецидивов 6,7,8. Было разработано несколько 3D-моделей нормальной печени и ГЦК, которые имитируют физиологию in vivo нормальной и злокачественной ткани печени 9,10.
Некоторые из современных 3D-систем включают в себя жидкие накладки, биореакторы, гидрогель, каркасы и 3D-печатные конструкции. Сфероиды, генерируемые в биореакторах, обладают уникальными преимуществами, поскольку они имитируют распределение питательных веществ в опухоли, газообмен и пролиферацию/покой клеток11. Биореакторы особенно подходят для моделей рака из-за их простоты использования, большой масштабируемости, диффузии питательных веществ и доступности11. Кроме того, биореакторы позволяют проводить эксперименты с высокой пропускной способностью, большей воспроизводимостью и меньшим количеством человеческих ошибок. Биореактор, использованный в этом исследовании, уникален тем, что он имитирует систему пониженной гравитации, которая сводит к минимуму разрушительные силы сдвига, применяемые в типичных биореакторах, что обеспечивает лучшую воспроизводимость12. Всенаправленная гравитация и уменьшение сил сдвига позволяют клеткам развиваться более физиологическим образом. В качестве доказательства можно привести то, что клетки HepG2/C3A, выращенные по этой методике, развивают сферические органеллы, которые продуцируют in vivo уровни АТФ, аденилаткиназы, мочевины и холестерина13,14. Кроме того, медикаментозное лечение в этой 3D-системе является более продвинутым и автоматизированным по сравнению с 2D-культурами. В 2D-культурах медикаментозное лечение часто должно иметь короткий временной курс из-за необходимости трипсинизации и поддержания здоровья клеток. Тем не менее, в нашем случае мы можем проводить длительную медикаментозную обработку сфероидов без необходимости нарушать структуру и физиологию клеток. Таким образом, переход от 2D к 3D культурам необходим для лучшего моделирования биологических явлений in vivo и дальнейшего научного развития.
В данной работе представлена методология выращивания высоковоспроизводимых сфероидов (рис. 1 и рис. 2) и показана полуавтоматическая система фенотипической характеристики 3D-структур (рис. 3). На уровне изображения приведена информация о подсчете и измерении площади сфероидов (рис. 3). Используя методы масс-спектрометрии, мы показываем, как протеомика может быть использована для оценки конкретных биологических функций (рис. 4). Собирая и анализируя эти данные, мы надеемся улучшить понимание биологии, лежащей в основе 3D-систем клеточных культур.
Понимание биологии, лежащей в основе трехмерных (3D) клеточных структур, чрезвычайно важно для более полного понимания их функциональных возможностей. Растет интерес к использованию 3D-моделей для изучения сложной биологии и проведения скрининга токсичности. При культивировании клеток в 3D необходимо учитывать множество факторов, в том числе фенотипическую оценку модельной системы. Фенотип определяется как группа наблюдаемых характеристик конкретного организма, таких как морфология, поведение, физиологические и биохимические свойства20.
В этом протоколе мы демонстрируем, как эксперименты по протеомике могут быть проведены на нескольких сфероидах и могут быть использованы для мониторинга типичного фенотипа печени. Масс-спектрометрия стала широко применяемым методом для 3D-характеризации клеток, позволяющим исследовать различные биологические вопросы 12,16,21,22. Для комплексного анализа протеома рекомендуется использовать не менее 20 мкг белкового исходного материала, из которого 1 мкг вводят в масс-спектрометр. Важно отметить, что добавление меньшего количества образца может привести к потере чувствительности, а добавление большего количества постепенно ухудшит качество хроматографии и в конечном итоге приведет к блокировке колонки. В этом исследовании мы показали, что сфероиды HepG2/C3A и THLE-3 обогащены важными белками гликолиза и цикла TCA, которые являются специфическими путями печени и имеют решающее значение для поддержания уровня глюкозы в крови и для производства энергии23,24. На самом деле, масс-спектрометрический анализ дает не только информацию на белковом уровне, но и позволяет исследовать посттрансляционные модификации белков, как это было показано ранее нашей группой16.
Еще одним аспектом, который следует учитывать в 3D-фенотипических исследованиях, является количество и размер сфероидов. Помимо повышения воспроизводимости экспериментов, подсчет количества сфероидов и определение их размера имеют важное значение для определения того, когда следует разделить культуру на несколько биореакторов, поскольку количество трехмерных структур в сосуде может повлиять на размер сфероидов и уровень метаболической активности. Однако важно подчеркнуть, что количество и размер сфероидов зависят от клеточной линии, начального количества клеток, процесса расщепления и времени сбора. Подробная информация о культуре сфероидов HepG2/C3A, такая как количество клеток в сфероидах, содержание белка и размер в зависимости от возраста, была предоставлена Феем, Коженевской и Вжесински25. Для точного и успешного анализа с использованием полуавтоматического метода, описанного здесь, наиболее важным шагом является получение хорошей картинки сфероидов. Для простоты снимок можно сделать с помощью телефона или планшета, но его разрешение должно быть максимально высоким. Поскольку изображения быстро получаются, они позволяют проводить крупномасштабные скрининговые эксперименты для визуализации конкретных фенотипических особенностей или изучения реакции на медикаментозное лечение. В связи с увеличением числа клеточных анализов за последние 10 лет был разработан ряд программного обеспечения с открытым исходным кодом для анализа изображений26. В этом протоколе мы описываем полуавтоматическую систему, использующую программное обеспечение FIJI18 для подсчета и измерения размеров сфероидов. Мы представили скрипты (простые команды программирования) для определения последовательности алгоритмических операций, которые могут быть применены к коллекции изображений, что делает анализ простым и быстрым процессом. Однако, в зависимости от характеристики сфероида, следует использовать ручное измерение. Например, если сфероиды слишком полупрозрачные, шрифт FIJI будет неточным. Кстати, одним из важнейших критериев для работы этого метода является компактность сфероидов. Эта характеристика будет способствовать более усиленному цветовому контрасту между сфероидами и фоном, что необходимо для точности метода.
Таким образом, помимо представления методологии выращивания высоковоспроизводимых сфероидов, была также описана полуавтоматическая система в сочетании с фенотипической характеристикой с помощью захвата изображений и протеомики. Мы ожидаем, что этот набор инструментов для анализа 3D-клеток станет более надежным благодаря полностью автоматизированному программному обеспечению для анализа изображений и масс-спектрометрам следующего поколения.
The authors have nothing to disclose.
Лаборатория Sidoli выражает благодарность Фонду исследования лейкемии (грант Холлиса Браунштейна для новых исследователей), AFAR (премия Sagol Network GerOmics), Deerfield (премия Xseed), Relay Therapeutics, Merck и офису директора NIH (1S10OD030286-01).
1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
10 mL syringe | Fisher Scientific | 1481754 | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
1000 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222703 | |
200 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222730 | |
96-well Orochem filter plate | Orochem | OF1100 | |
96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C | |
96-well vacuum manifold | Millipore | MAVM0960R | |
Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-25G | |
Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM) | Lonza | CC-3170 | |
Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
ClinoReactor | CelVivo | N/A | Bioreactor for 3D cell culture |
ClinoStar incubator | CelVivo | N/A | CO2 incubator for 3D cell culture |
DTT | Sigma | D0632-5G | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT17205CV | |
Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells | Corning | 4441 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35010CV | |
Formic acid | Thermo | 28905 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | MT21022CV | |
hEGF | Corning | 354052 | |
HERAcell vios 160i | Thermo | 51033557 | CO2 incubator for 2D cell culture |
HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452-1 | |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
L-glutamine | Fisher Scientific | MT25015CI | |
Non-essential amino acids | Fisher Scientific | MT25025CI | |
Oasis HLB Resin 30 µm | Waters | 186007549 | |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
PAULA microscope | Leica | ||
Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | MT3002CI | |
PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader | PerkinElmer | ||
pH paper | Hydrion | 93 | |
Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
Phosphoric acid | Fisher Scientific | A260-500 | |
Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Milipore Sigma) | |
Refrigerated centrifuge | Thermo | 75-217-420 | |
Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 μM bead size |
SDS | Bio-Rad | 1610301 | |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | V511A | |
SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates) | Thermo | 15308325 | Savant SPD1010 |
Sterile hood | Thermo | 1375 | |
Sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 1367549 | |
S-trap | Protifi | C02-micro-80 | |
Syringe needle (18 G) | Fisher Scientific | 14817100 | 3" length, 0.05" diameter |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
Vortex | Sigma | Z258415 | |
Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 |