機能的3Dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語)

1. バッファーおよび試薬 HepG2/C3A細胞用細胞増殖培地:10%ウシ胎児血清(FBS)、非必須アミノ酸(1%v/v)、L-グルタミン(1%v/v)およびペニシリン/ストレプトマイシン(0.5%v/v)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、4.5g/Lグルコース)を調製します。増殖培地を4°Cで保存します。 THLE-3細胞用細胞増殖培地:そのサプリメント(ウシ下垂体抽出物[BPE]、ヒドロコルチゾン、ヒト上皮成長因子[hEGF]、エピネフリン、トランスフェリン、インスリン、レチノイン酸、トリヨードチロニン、硫酸ゲンタマイシン-アムホテリシン[GA])、および10S、5 ng/mL hEGF、70 ng/mLホスホエタノールアミンを含む気管支上皮細胞増殖培地[BEGM]を調製します。 500 mM DL-ジチオスレイトール(DTT):10 mL を調製するには、0.771 g の DTT を 10 mL の HPLC グレードの水に再懸濁します。100 μLのアリコートを-20°Cで保存します。 200 mM ヨードアセトアミド:1 mL を調製するには、36 mg のヨードアセトアミドを 50 mM 重炭酸アンモニウム 1 mL に再懸濁します。再懸濁したヨードアセトアミドは保管しないでください。 5% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS):50 mL を調製するには、2.5 g の SDS を 50 mL の 50 mM 重炭酸アンモニウムに再懸濁します。4°Cで保存してください。 12%リン酸:100 mLを調製するには、14.1 mLの85%リン酸を85.9 mLのHPLCグレードの水で希釈します。ガラス瓶に入れて室温(RT)で保管してください。 結合バッファー:1 L を調製するには、900 mL の濃メタノールを 100 mL の 10 mM 重炭酸アンモニウムまたは TEAB に加えます。 0.1% トリフルオロ酢酸(TFA)溶液:999 mL の HPLC グレードの水に濃縮 TFA 1 mL を加えます。4°Cで保存してください。 60% アセトニトリル/0.1% TFA 溶液:HPLC グレードの水 399 mL に HPLC グレードのアセトニトリル(60% v/v)600 mL を加えます。次に、この溶液に1 mLの濃縮TFAを加え、4°Cで保存します。 移動相 A(MPA) – 0.1% ギ酸:999 mL の HPLC グレードの水に濃ギ酸 1 mL を加え、よく混合します。 移動相 B(MPB) – 80% HPLC グレードアセトニトリル + 0.1% ギ酸:HPLC グレード水 199 mL に HPLC グレードのアセトニトリル 800 mL を加えます。次に、この溶液に1mLの濃ギ酸を加えて混合します。 2. スフェロイドの調製 注: 図1A は、細胞株から3Dスフェロイドを調製および培養するための最初のステップを示しています。 凍結したHepG2/C3AおよびTHLE-3細胞を融解し、組織培養フラスコまたはディッシュ内で標準的な増殖培地を使用して、約80%のコンフルエントに達するまで単層として増殖させます。注:細胞がコンフルエントに達したら、顕微鏡を使用して一般的な細胞形態と増殖パターンを確認します。継代数の多い細胞を使用することは推奨されません。 Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS、T75 cm 2フラスコまたは10 cmディッシュに5 mLを使用)で細胞を2 回洗浄します。 HBSSで希釈した0.05%トリプシン-EDTAを5 mL添加し(1:2希釈)、5% CO2で37°Cで5分間インキュベートします。顕微鏡を使用して細胞剥離を評価し、3 mLのFBSまたは増殖培地(10Sを含む)を添加してトリプシン反応を中和します。 細胞懸濁液を15 mLチューブに移します。室温で270 x g で5分間スピンダウンします。 上清を吸引し、細胞を5 mLの完全増殖培地に再懸濁します。注:細胞が多すぎる場合は、細胞懸濁液を希釈してからカウントしてください。 細胞数を数え、細胞懸濁液を完全増殖培地で希釈して、最大容量1.5mLで1 x 106 を得ます。 マイクロウェルを含む超低アタッチメントの24ウェル丸底板を平衡化します。ウェルを0.5 mLの成長培地で洗浄します。 プレートを3,000 x g で5分間遠心分離します(これにより、ウェルの表面から気泡が除去されます)。 細胞懸濁液(ステップ1.4で調製)をプレートに移し、120 x gで3分間遠心分離します。注:細胞懸濁液の量は細胞数によって異なる場合がありますが、1.5 mLに制限することが重要です。 プレートを 37 °C で 5% CO2 で 24 時間インキュベートし、スフェロイドの形成を開始します。 3. バイオリアクターへのスフェロイド培養 (図2) 注:回転楕円体の構造を保持するには、3D球を取り扱うときに幅の広いボアチップを使用してください。 スフェロイドをバイオリアクターに移す前に、湿度チャンバーに25 mLの滅菌水を、細胞チャンバーに9 mLの増殖培地を24時間充填して、バイオリアクターを平衡化します(図2A)。湿度チャンバーや細胞チャンバーを充填するときは、必ず10 mLのシリンジを長い針につないで使用してください。 バイオリアクターを3Dインキュベーター(図2D、F)で回転(15rpm)し、37°Cで5%CO2で24時間インキュベートします。 1 mL幅のボアチップを使用して、ピペットを静かに上下に動かし、超低接着プレートからスフェロイドを剥離し、スフェロイドを組織培養皿に移します。 超低温付着プレートを0.5 mLの予熱した増殖培地で洗浄し、残ったスフェロイドを捕捉し、ステップ3.3の同じディッシュに移します。 スフェロイドのサイズ、コンパクトさ、真円度を光学顕微鏡(倍率4倍)で評価し、十分に形成されているものを選択します。注意: セルはコンパクトで、取り扱い中にバラバラにならないと十分に形成されます。また、回転楕円体が単一のユニットであり、凝集していないことも重要です。100〜200μmのスフェロイドサイズは、バイオリアクターに移す場合に好ましい。 スフェロイドを、5 mLの新鮮増殖培地で満たされた平衡バイオリアクターに移します。スフェロイドを移し替えた後、バイオリアクターを新鮮な増殖培地で完全に満たし、バイオリアクターに培地を充填するときは、バイオリアクターに気泡を加えないようにしてください。 バイオリアクターを3Dインキュベーターに置き、コントロールユニットを使用して回転速度を調整します(図2C)。HepG2 / C3Aスフェロイドの場合、回転速度を10〜11rpmに設定します。THLE-3スフェロイドの場合は、11〜12rpmに設定します。注:回転速度は、スフェロイドがバイオリアクターの中心に均等に分布し、その壁に触れていない場合に正しく設定されます。 図2Eは、回転するバイオリアクターを示す。 2〜3日ごとに、10 mLの古い培地を取り除き、10 mLの新しい培地と交換して、増殖培地を交換します。培地を交換するときは、スフェロイドを取り除かないように注意してください(図2B)。メモ: メディア交換のルーチン(たとえば、48 時間/48 時間/72 時間)を用意し、詳細な記録を保持することをお勧めします。 用紙を交換するたびに回転速度を調整します。回転楕円体のサイズと数が大きくなるにつれて速度を上げます。 培養で 15 日後、スフェロイドを 2 つの新しいバイオリアクターに分割します。注:細胞株と増殖速度によって、時間は異なる場合があり、個別に最適化する必要があります。 20日後、回転楕円体は採取の準備が整います。 4. スフェロイドの画像取得と計数 注:スフェロイド数の簡略化されたパイプラインを 図 3A に示します。回転楕円体の数と面積の決定(セクション5)では、3D構造のコンパクトさを評価することが重要です。これにより、分析法が正確であるために必要な色のコントラストがより強調されます。 タブレットにインストールされている3Dアプリを開きます。 バイオリアクターを選択し、スナップショットを撮ります。注意: または、写真を撮ることもできます。次のパラメータを考慮する必要があります。バイオリアクターの後ろに黒い背景を配置します(バイオリアクターボックスには黒いサポートがあります)。 細胞室に光の反射がないことを確認してください。 できるだけバイオリアクターの近くで写真を撮ります。 FIJI (ImageJ) で 1 つの画像を開きます。 分析用の画像を準備します。楕円ツールを選択します。プラグの周囲に円を描きます。 キーボードの [削除 ] をクリックして、円の内側のすべてを黒くします。セルチャンバーの周囲に円を描きます。すべての回転楕円体が円の内側にあることを確認します。 マクロを実行して回転楕円体をカウントします。[ Plugins > Macro > Record] をクリックします。マクロ・テキストを 補足ファイル 1 からレコーダーにコピーします。 [作成]を押すと、新しいウィンドウが開きます。[実行]を押して、開いた画像を分析します。 新しいウィンドウが開き、結果(カウント、総面積、平均サイズ、およびパーセンテージ面積)が表示されます。 画像を閉じ、回転楕円体数が必要な画像ごとに手順 4.4 と 4.5 を繰り返します。より簡単かつ迅速に処理するには、マクロを保存し、[ Plugins > Macro] > [Run ] をクリックして実行し、保存したマクロを選択します。 5. 回転楕円体領域の平面測定 注:回転楕円体面積を決定するための簡略化されたパイプラインを 図3Bに示します。 手順3.5の説明に従って画像を撮影します。 開始する前に、回転楕円体の面積を測定するためのグローバルスケールを設定します。フィジーで、希望の倍率の縮尺記号付きの画像を開きます。線ツールを選択します。縮尺記号の上に描画します (線は縮尺記号と同じ長さにする必要があります)。 [分析] > [スケールの設定] を開きます。 既知の距離を書き込みます(線の長さは、距離(ピクセル単位)に自動的に入力されます。必ず [グローバル] にチェックを入れてください。 OKを押します。これで、分析する画像の縮尺が設定されました。 平面測定を開始するには、マクロ(補足ファイル2)を実行します。「バッチ>マクロ>処理」をクリックします。 分析する画像を含むフォルダーを選択します。このフォルダが入力になります。 手順5.3.1で作成したフォルダを出力として選択します。[プロセス]を押します。 品質チェックとして、測定された回転楕円体領域が元の画像に対応しているかどうかを評価します。注: マクロは、回転楕円体の一部しか測定できないエッジ上の回転楕円体を除外します。 6. スフェロイドの採取 注:スフェロイドは、3D構造を維持するために、ワイドボアチップを使用して収集することを強くお勧めします。回収は、バイオリアクターの前面にあるプラグを使用して行うことができます(図2A)。 回収時のスフェロイドのサイズは、細胞株、開始細胞数、および分裂プロセス(培養日数、バイオリアクターあたりのスフェロイド数、および分裂率)によって異なります。 スフェロイドを回収するには、長い針に結合されたシリンジを使用して、上部ポートからバイオリアクターから 5 mL の培地を除去します。スフェロイドは、必ずバイオリアクターの下部中央(下部ポート付近)に沈ませてください。 フロントポートを開き、1 mL幅のボアチップを使用してスフェロイドを回収します。スフェロイドを微量遠心チューブに入れます。スフェロイドを 500 x g で 5 分間遠心分離し、培地を廃棄します。 スフェロイドを200 μLのHBSSで洗浄し、FBSを除去します。500 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。 回転楕円体ペレットを液体窒素で急速凍結し、処理するまで-80°Cで保存します。 7. スフェロイドの生存率 注:スフェロイドの生存率は、損傷した細胞から放出されるアデニル酸キナーゼ(AK)の活性を測定することによって決定されました(図4A)。拡散勾配により、AK測定はスフェロイドの直径が900 μm未満の場合に効率的です12。スフェロイドが大きくなる場合、または生存率の測定に疑問がある場合は、ATPアッセイを実行できます15。 スフェロイド上清を回収し、20 μL を 96 ウェル白壁プレート(平底透明)に移します。100 μLのアデニル酸キナーゼ検出試薬を各ウェルに添加し、ピペッティングで静かに上下させてホモジナイズします。 室温で速度真空中で2分間遠心分離して気泡を除去し、室温でプレートを20分間インキュベートします。 プレートをルミノメーター(プレートリーダー、ルミネッセンスモード)に置き、プログラムを開始します。キットの製造元の指示に従ってパラメータを設定してください。注:生物発光生存率アッセイでは、直接ルミノメーターの光出力(通常はRLU)を使用して細胞応答を計算できます。アデニル酸キナーゼは、細胞の完全性が損なわれた細胞からのみ漏出するため、溶解試薬を用いることで、アデニル酸キナーゼの完全制御を達成することが可能です。 8. 蛋白質の抽出 注: 図 1B は、スフェロイドの処理とタンパク質抽出のワークフローを示しています。 36日目に回転楕円体(セクション6)を収集します。スフェロイドを 25 μL の 5% SDS に再懸濁し、細胞を溶解します。5% SDSを添加した後、ピペッティングで上下させてペレットを均質化します。スフェロイドの溶解が困難な場合は、小さな乳棒を使用してください。 サンプルを 20 mM DTT で 1 時間インキュベートし、タンパク質を還元します。ピペッティングで上下に混ぜます。 サンプルを 40 mM ヨードアセトアミドで 30 分間インキュベートし、タンパク質をアルキル酸から光から保護します。ピペッティングで上下に混ぜます。 最終濃度1.2%で12%リン酸溶液(10x)をサンプルに添加します。 サンプルを 6 容量の結合バッファーで希釈し、穏やかに混合します。 サンプルをS-Trapフィルタープレートにロードし、500 x g で30秒間スピンダウンします。注:ステップ 8.4 のサンプルの総容量がカラム容量容量を超える場合は、サンプルをバッチでロードし、すべてがカラムを通過するまでステップ 8.6 を繰り返します。 150 μLの結合バッファーでサンプルを2回洗浄します。各洗浄後、500 x g で30秒間スピンダウンし、フロースルーを廃棄します。 50 mM 重炭酸アンモニウムで希釈した 1 μg のシーケンシンググレードトリプシンとサンプルを 37 °C で一晩インキュベートします。注:包括的なプロテオーム解析の出発物質として、少なくとも 20 μg のタンパク質が推奨されます。このため、1μgのトリプシンが効率的な消化に理想的な量です。バッファーとカラムベッドの間の気泡を取り除きます。 ペプチドを 40 μL の 50 mM 重炭酸アンモニウムで溶出し、同じ回収チューブにプールします。 500 x g で30秒間スピンダウンします。40 μL の 0.1% TFA でペプチドを溶出し、同じコレクションチューブにプールします。 500 x g で30秒間スピンダウンします。40 μL の 60% アセトニトリルと 0.1 % TFA でペプチドを溶出し、同じコレクションチューブにプールします。 500 x g で30秒間スピンダウンします。ドライプールされた溶出液は速度真空中で、処理されるまでサンプルを-80°Cで保存します。 9. サンプルのクリーンアップ 注:プロテオミクス分析に進む前に、サンプル中に存在する塩分を除去する必要があります。塩はエレクトロスプレー中にイオン化し、ペプチドからのシグナルを抑制するため、高速液体クロマトグラフィー質量分析(HPLC-MS)分析を妨げる可能性があります。この研究で使用された脱塩のセットアップは、Joseph-Chowdhuryらによって以前に実証されました16。 開始する前に、以下のステップでフロースルーを回収するための清潔な96ウェル回収プレートがあることを確認してください。C18樹脂(50 mg/mL、100%アセトニトリル溶液)をマグネチックスタープレート上で混合します。 96ウェルフィルタープレートのウェルあたり70 μLのC18レジン懸濁液を添加し、C18レジンがピペットの底に溜まらないように素早く添加します。 水しぶきを防ぐために、掃除機を静かにオンにします。96ウェルコレクションプレートに回収されたフロースルーを廃棄します。 レジンを100 μLの0.1% TFAで洗浄します。サンプルの飛沫や混合を防ぐために、バキュームを静かにオンにし、フロースルーを廃棄します。 各サンプルを 100 μL の 0.1% TFA に再懸濁します。pHが2〜3の間であることを確認してください。 各サンプルをフィルタープレートの各ウェルにロードします。サンプルの飛沫や混合を防ぐために、バキュームを静かにオンにし、フロースルーを廃棄します。 100 μL の 0.1% TFA で洗浄します。サンプルの飛沫や混合を防ぐために、バキュームを静かにオンにします。フロースルーを破棄します。 96ウェルの採取プレートを新しい96のウェルプレートに交換して、脱塩したサンプルを回収します。 ウェルあたり60 μLのアセトニトリル/0.1% TFAを添加します。C18樹脂からサンプルを溶出させるには、バキュームを静かにオンにして、飛散を防ぎます。 フロースルーを回収し、室温で速度真空中で乾燥させます。 LC-MS/MS に進むか、サンプルを処理する準備ができるまでプレートを -80 °C で保管します。 10. 液体クロマトグラフィーと質量分析によるプロテオミクス分析 注:本稿のデータ作成には、内径 300 μm x C18 トラップカラムと内径 75 μm x 25 cm C18-AQ(3 μm)分析用ナノカラムを社内充填した 2 カラムシステムセットアップの nLC-MS/MS システムを使用しました。 HPLC で分析する移動相を調製します。移動相 A(MPA):0.1% ギ酸 HPLC グレードの水溶液移動相 B(MPB):0.1% ギ酸含有 HPLC グレードアセトニトリル溶液 HPLCメソッドを次のようにプログラムします:120分間で4%〜34%MPB、5分間で34%〜90%MPB、5分間でアイソクラティック90%MPB。流量:300nL/min。 検出されたペプチドシグナルのMS/MSスペクトルを生成するために、データに依存しない取り込み(DIA)を実行するようにMS取り込みメソッドを設定します。 サンプルを nLC オートサンプラーに入れる前に、1 μg のサンプルを 10 μL の 0.1% TFA に再懸濁します。 標準プロテオミクス取得用にプログラムされたとおりに nLC-MS 分析法を実行します。Orbitrap でフル MS スキャンを 300-1100 m/z に設定し、分解能を 120,000(200 m/z 時)、自動ゲイン制御(AGC)ターゲットを 125 に設定します。 Orbitrap で MS/MS を 50 m/z のシーケンシャル分離ウィンドウ、AGC ターゲット 400、高エネルギー衝突解離(HCD)エネルギー 30 に設定します。 11. データ解析 nLC-MS/MS 生データファイルを、使用する MS プラットホームと互換性のあるピーク検出ソフトウェアにインポートします。 適切なデータベース(ヒト、マウスなど)を選択します。 N末端アセチル化を可変修飾とし、カルバミドメチルシステインを固定修飾とする。 トリプシンを消化酵素として指定し、2回の切断ミスを許容します。 スペクトル取得に使用する質量分析計に応じて質量許容値を設定します。 分析をスプレッドシートとしてエクスポートし、必要に応じてデータをさらに処理します。