تحليل النمط الظاهري شبه الآلي لثقافات الخلايا الكروية 3D الوظيفية
Summary
نقدم بروتوكولا لزراعة الكرويات عالية التكرار وتوصيفها الظاهري باستخدام التقاط الصور والبروتينات.
Abstract
نقدم بروتوكولا يصف خصائص ومزايا استخدام حاضنة clinostat مستقلة لزراعة ومعالجة ومراقبة ثقافات الخلايا 3D. يحاكي clinostat بيئة يمكن أن تتجمع فيها الخلايا ككرويات قابلة للتكاثر بدرجة عالية مع قوى قص منخفضة وانتشار نشط للمغذيات. لقد أثبتنا أن كلا من خلايا الكبد السرطانية وغير السرطانية (خطوط خلايا HepG2 / C3A و THLE-3) تتطلب 3 أسابيع من النمو قبل تحقيق وظائف مماثلة لخلايا الكبد. يسلط هذا البروتوكول الضوء على راحة استخدام الحاضنات لخلايا 3D مع كاميرات تراقب نمو الخلايا ، حيث يمكن التقاط لقطات لحساب وقياس الأجسام الكروية عند العلاج. وصفنا المقارنة بين خطوط خلايا THLE-3 و HepG2 / C3A ، مما يوضح كيف يمكن زراعة خطوط الخلايا غير السرطانية وكذلك الخلايا السرطانية الخالدة. نوضح ونوضح كيف يمكن إجراء تجارب البروتينات من عدد قليل من الأجسام الكروية ، والتي يمكن جمعها دون إزعاج إشارات الخلية ، أي لا يلزم التربسين. لقد أوضحنا أنه يمكن استخدام تحليل البروتينات لمراقبة النمط الظاهري النموذجي للكبد لعملية التمثيل الغذائي للسلسلة التنفسية وإنتاج البروتينات المشاركة في إزالة السموم المعدنية ووصف نظام شبه آلي لحساب وقياس منطقة الكرة الأرضية. إجمالا ، يقدم البروتوكول صندوق أدوات يشتمل على توصيف النمط الظاهري عبر التقاط الصور وخط أنابيب البروتينات لتجربة نماذج زراعة الخلايا 3D.
Introduction
لقد ثبت أن مزارع الخلايا في المختبر ضرورية ولا تقدر بثمن في إنشاء المعرفة الأساسية في علم الأحياء. الكثير من الفهم العلمي في علم الأحياء والسرطان على وجه التحديد جاء من نظام ثقافة 2D الذي هو خلايا تنمو في طبقة واحدة. على الرغم من أن ثقافة 2D كانت نظام زراعة الخلايا المهيمن ، إلا أن لها العديد من العيوب التي يمكن أن تخنق المزيد من التقدم البيولوجي. على سبيل المثال ، تفتقر الثقافات ثنائية الأبعاد إلى تفاعلات الخلايا الخلوية المهمة لإشارات الخلية وانتشارها1. حتى الآن ، ثبت أن أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد تعمل على تحسين تمايز النماذج ، والاستجابة للأدوية ، وغزو الورم ، والبيولوجيا2،3،4،5. النمذجة 3D من السرطانات الخبيثة أمر حيوي بشكل خاص بسبب ارتفاع عدد السكان المسنين ووفيات السرطان. سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو أحد الأسباب الرئيسية للوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم وكثيرا ما يكون له تشخيص سيئللغاية 6. من المعروف أن سرطان الكبد لديه معدل شفاء منخفض ، واستجابة ضعيفة للأدوية ، ومعدل تكرار مرتفع6،7،8. تم تطوير العديد من نماذج 3D للكبد الطبيعي وسرطان الكبد التي تحاكي فسيولوجيا أنسجة الكبد الطبيعية والخبيثة في الجسم الحي 9,10.
تتضمن بعض أنظمة 3D الحالية تراكبات سائلة ومفاعلات حيوية وهيدروجيل وسقالات وهياكل مطبوعة ثلاثية الأبعاد. توفر الأجسام الكروية المتولدة في المفاعلات الحيوية مزايا فريدة على وجه التحديد لأنها تحاكي توزيع الورم للتعرض للمغذيات وتبادل الغازات وتكاثر الخلايا / السكون11. المفاعلات الحيوية مناسبة بشكل خاص لنماذج السرطان نظرا لسهولة استخدامها ، وقابلية التوسع الكبيرة ، ونشر المغذيات ، وإمكانية الوصولإليها 11. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تسمح المفاعلات الحيوية بإجراء تجارب عالية الإنتاجية ، وقابلية أكبر للتكاثر ، وتقليل الخطأ البشري. المفاعل الحيوي المستخدم في هذه الدراسة فريد من نوعه لأنه يحاكي نظاما منخفض الجاذبية ، مما يقلل من قوى القص التخريبية المطبقة في المفاعلات الحيوية النموذجية مما يسمح باستنساخ أفضل12. تسمح الجاذبية متعددة الاتجاهات وتقليل قوى القص للخلايا بالتطور بطريقة فسيولوجية أكثر. كدليل على ذلك ، تقوم خلايا HepG2 / C3A التي تنمو وفقا لهذه المنهجية بتطوير عضيات كروية تنتج في الجسم الحي مستويات ATP وأدينيلات كيناز واليوريا والكوليسترول13,14. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العلاجات الدوائية في نظام 3D هذا أكثر تقدما وآلية مقارنة بثقافات 2D. في الثقافات 2D ، يجب أن يكون للعلاجات الدوائية في كثير من الأحيان دورة زمنية قصيرة بسبب الحاجة إلى التربسين والحفاظ على صحة الخلايا. ومع ذلك ، في حالتنا ، يمكننا إجراء علاجات دوائية طويلة الأمد للكرويات دون الحاجة إلى تعطيل بنية الخلايا وفسيولوجيتها. لذلك ، فإن التحول من ثقافات 2D إلى 3D ضروري لنمذجة أفضل للظواهر البيولوجية في الجسم الحي والمزيد من التطور العلمي.
تقدم هذه الورقة منهجية لزراعة كرويات عالية التكاثر (الشكل 1 والشكل 2) وتظهر نظاما شبه آلي لتوصيف الهياكل ثلاثية الأبعاد ظاهريا (الشكل 3). على مستوى الصورة ، نقدم معلومات حول عد وقياس مساحة الأجسام الكروية (الشكل 3). باستخدام طرق قياس الطيف الكتلي ، نوضح كيف يمكن استخدام البروتينات لتقييم وظائف بيولوجية محددة (الشكل 4). من خلال جمع وتحليل هذه البيانات ، نأمل في تحسين فهم البيولوجيا وراء أنظمة زراعة الخلايا 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن فهم البيولوجيا وراء الهياكل الخلوية ثلاثية الأبعاد (3D) مهم للغاية للحصول على معرفة أكثر شمولا بوظائفها. هناك اهتمام متزايد باستخدام نماذج 3D لدراسة البيولوجيا المعقدة وإجراء فحص السمية. عند زراعة الخلايا في 3D ، يجب مراعاة العديد من العوامل ، بما في ذلك تقييم النمط الظاهري للنظام النموذجي. يعرف النمط الظاهري بأنه مجموعة من الخصائص التي يمكن ملاحظتها لكائن حي معين ، مثل التشكل والسلوك والخصائص الفسيولوجية والكيميائية الحيوية20.
في هذا البروتوكول ، نوضح كيف يمكن إجراء تجارب البروتينات من عدد قليل من الكائنات الكروية ويمكن استخدامها لمراقبة النمط الظاهري النموذجي للكبد. أصبح قياس الطيف الكتلي طريقة مطبقة على نطاق واسع لتوصيف الخلايا ثلاثية الأبعاد ، مما يسمح بالتحقيق في مجموعة متنوعة من الأسئلة البيولوجية 12،16،21،22. لإجراء تحليل شامل للبروتين ، يوصى باستخدام 20 ميكروغرام على الأقل من مادة بدء البروتين ، والتي يتم حقن 1 ميكروغرام منها في مطياف الكتلة. من المهم الإشارة إلى أن إضافة عينة أقل قد يؤدي إلى فقدان الحساسية ، وإضافة المزيد من شأنه أن يؤدي تدريجيا إلى تدهور جودة اللوني ويؤدي في النهاية إلى سد العمود. في هذه الدراسة ، أظهرنا أن الأجسام الكروية HepG2 / C3A و THLE-3 غنية ببروتينات مهمة من تحلل السكر ودورة TCA ، وهي مسارات كبدية محددة وضرورية للحفاظ على مستويات الجلوكوز في الدم ولإنتاج الطاقة23,24. في الواقع ، لا يوفر تحليل قياس الطيف الكتلي معلومات على مستوى البروتين فحسب ، بل يسمح أيضا بالتحقيق في تعديلات البروتين بعد الترجمة ، كما هو موضح سابقا من قبل مجموعتنا16.
جانب آخر يجب مراعاته في دراسات النمط الظاهري 3D هو عدد وحجم الأجسام الكروية. إلى جانب جعل التجارب أكثر قابلية للتكرار ، فإن حساب عدد الأجسام الكروية وتحديد حجمها أمر ضروري لتحديد وقت تقسيم الثقافة إلى مفاعلات حيوية متعددة ، حيث أن عدد هياكل 3D داخل الوعاء يمكن أن يؤثر على حجم الكائنات الكروية ومستويات النشاط الأيضي. ومع ذلك ، من المهم تسليط الضوء على أن عدد وحجم الأجسام الكروية يعتمدان على خط الخلية ، وعدد الخلايا الأولية ، وعملية الانقسام ، ووقت التجميع. تم توفير تفاصيل الثقافة الكروية HepG2 / C3A ، مثل عدد الخلايا لكل كروية ، ومحتوى البروتين ، والحجم كدالة للعمر ، بواسطة Fey و Korzeniowska و Wrzesinski25. للحصول على تحليل دقيق وناجح باستخدام الطريقة شبه الآلية الموضحة هنا ، فإن الخطوة الأكثر أهمية هي صورة كروية جيدة. من أجل البساطة ، يمكن التقاط الصورة بهاتف أو جهاز لوحي ، ولكن يجب أن تظل دقتها عالية قدر الإمكان. نظرا لسرعة الحصول على الصور ، فإنها تسمح لتجارب الفحص واسعة النطاق بتصور ميزات النمط الظاهري المحددة أو التحقيق في الاستجابات للعلاج بالعقاقير. لذلك ، نظرا للعدد المتزايد من المقايسات القائمة على الخلايا ، تم تطوير عدد من البرامج مفتوحة المصدر على مدى السنوات ال 10 الماضية لتحليل الصور26. في هذا البروتوكول ، نصف نظاما شبه آلي يستخدم برنامج FIJI18 لحساب وقياس حجم الأجسام الكروية. قدمنا نصوصا (أوامر برمجة بسيطة) لتحديد سلسلة من العمليات الخوارزمية التي يمكن تطبيقها على مجموعة الصور ، مما يجعل التحليل عملية سهلة وسريعة. ومع ذلك ، اعتمادا على خاصية كروية ، ينبغي استخدام القياس اليدوي. على سبيل المثال ، إذا كانت الأجسام الكروية شفافة للغاية ، فسيكون نص فيجي غير دقيق. بالمناسبة ، أحد أهم معايير هذه الطريقة للعمل هو انضغاط الأجسام الكروية. ستساهم هذه الخاصية في تباين ألوان أكثر تعزيزا بين الكرويات والخلفية ، وهو أمر ضروري لكي تكون الطريقة دقيقة.
باختصار ، إلى جانب تقديم منهجية لزراعة الكرات عالية التكاثر ، تم أيضا وصف نظام شبه آلي مقترن بتوصيف النمط الظاهري عبر التقاط الصور والبروتينات. نتوقع أن تصبح مجموعة الأدوات هذه لتحليل خلايا 3D أكثر قوة مع برنامج تحليل الصور الآلي الكامل ومقاييس الطيف الكتلي من الجيل التالي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف مختبر Sidoli بامتنان بمؤسسة أبحاث اللوكيميا (منحة أبحاث الباحث الجديد Hollis Brownstein) ، AFAR (جائزة Sagol Network GerOmics) ، Deerfield (جائزة Xseed) ، Relay Therapeutics ، Merck ، ومكتب مدير المعاهد الوطنية للصحة (1S10OD030286-01).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1481754 | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 1000 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222703 | |
| 200 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222730 | |
| 96-well Orochem filter plate | Orochem | OF1100 | |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C | |
| 96-well vacuum manifold | Millipore | MAVM0960R | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-25G | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM) | Lonza | CC-3170 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | N/A | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar incubator | CelVivo | N/A | CO2 incubator for 3D cell culture |
| DTT | Sigma | D0632-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT17205CV | |
| Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells | Corning | 4441 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35010CV | |
| Formic acid | Thermo | 28905 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | MT21022CV | |
| hEGF | Corning | 354052 | |
| HERAcell vios 160i | Thermo | 51033557 | CO2 incubator for 2D cell culture |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452-1 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25015CI | |
| Non-essential amino acids | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| Oasis HLB Resin 30 µm | Waters | 186007549 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| PAULA microscope | Leica | ||
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | MT3002CI | |
| PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader | PerkinElmer | ||
| pH paper | Hydrion | 93 | |
| Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
| Phosphoric acid | Fisher Scientific | A260-500 | |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Milipore Sigma) | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 μM bead size |
| SDS | Bio-Rad | 1610301 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V511A | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates) | Thermo | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo | 1375 | |
| Sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 1367549 | |
| S-trap | Protifi | C02-micro-80 | |
| Syringe needle (18 G) | Fisher Scientific | 14817100 | 3" length, 0.05" diameter |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Vortex | Sigma | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 |
References
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Nirmalanandhan, V. S., Duren, A., Hendricks, P., Vielhauer, G., Sittampalam, G. S. Activity of anticancer agents in a three-dimensional cell culture model. Assay and Drug Development Technologies. 8 (5), 581-590 (2010).
- Erickson, I. E., Huang, A. H., Chung, C., Li, R. T., Burdick, J. A., Mauck, R. L. Differential maturation and structure-function relationships in mesenchymal stem cell- and chondrocyte-seeded hydrogels. Tissue Engineering Part A. 15 (5), 1041-1052 (2009).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10 (29), (2012).
- Liu, J., Abate, W., Xu, J., Corry, D., Kaul, B., Jackson, S. K. Three-dimensional spheroid cultures of A549 and HepG2 cells exhibit different lipopolysaccharide (LPS) receptor expression and LPS-induced cytokine response compared with monolayer cultures. Innate Immunity. 17 (3), 245-255 (2011).
- Khafaga, A. F., Mousa, S. A., Aleya, L., Abdel-Daim, M. M. Three-dimensional (3D) cell culture: a valuable step in advancing treatments for human hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 22 (1), 243 (2022).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. The Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Sia, D., Llovet, J. M. Liver cancer: Translating ‘-omics’ results into precision medicine for hepatocellular carcinoma. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (10), 571-572 (2017).
- Tang, J., et al. A three-dimensional cell biology model of human hepatocellular carcinoma in vitro. Tumour Biology. 32 (3), 469-479 (2011).
- van Zijl, F., Mikulits, W. Hepatospheres: Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver. World Journal of Hepatology. 2 (1), 1-7 (2010).
- Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering(Basel, Switzerland). 5 (1), 22 (2018).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).
- Wrzesinski, K., Frandsen, H. S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S. J. Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids. Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021).
- Joseph-Chowdhury, J. N., et al. Global level quantification of histone post-translational modifications in a 3D cell culture model of hepatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 183, 63606 (2022).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver. Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bindea, G., et al. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).
- Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: The next challenge. Nature Reviews. Genetics. 11 (12), 855-866 (2010).
- Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. Phenotypic analysis of organoids by proteomics. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Avelino, T. M., et al. Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids. SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).
- Chiang, J., McManus, L. M., MitchellIn, R. N. . Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease. , 1770-1782 (2014).
- Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver. Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).
- Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity. Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).
- Smith, K., et al. Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays. Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).
