JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Üç Boyutlu Süspansiyon Biyoreaktöründe İnsan Nörojenin 2-İndüklenebilir Nöronların Üretimi

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/65085
, , , , , , , , ,
1Fraunhofer Project Center for Stem Cell Process Engineering,Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering IBMT, 2Bioneer A/S, 3Fraunhofer UK Research Ltd, Technology and Innovation Centre, 4Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering IBMT, 5Department of Molecular and Cellular Biotechnology,Saarland University, 6Facultad de Ciencias del Mar,Universidad Católica del Norte

Summary

Bu makalede, bir tezgah üstü 3D süspansiyon biyoreaktöründe insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli nöronların üretimi için bir protokol açıklanmaktadır.

Abstract

Nöronal soy hücrelerinin insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC’ler) türetilmesi, beyin araştırmalarında bir kilometre taşı oldu. İlk ortaya çıkışlarından bu yana, protokoller sürekli olarak optimize edilmiştir ve şimdi araştırma ve ilaç geliştirmede yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu geleneksel farklılaşma ve olgunlaşma protokollerinin çok uzun sürmesi ve yüksek kaliteli hiPSC’lere ve bunların nöral türevlerine olan talebin artması, bu protokollerin büyük ölçekli üretime benimsenmesi, optimizasyonu ve standardizasyonu ihtiyacını artırmaktadır. Bu çalışma, genetiği modifiye edilmiş, doksisiklin ile indüklenebilir nörojenin 2 (iNGN2) eksprese eden hiPSC’lerin bir tezgah üstü üç boyutlu (3D) süspansiyon biyoreaktörü kullanılarak nöronlara farklılaştırılması için hızlı ve verimli bir protokol sunmaktadır.

Kısacası, iNGN2-hiPSC’lerin tek hücreli süspansiyonlarının 24 saat içinde agrega oluşturmasına izin verildi ve doksisiklin ilavesiyle nöronal soy bağlılığı indüklendi. Agregalar 2 günlük indüksiyondan sonra ayrıştırıldı ve hücreler ya kriyokorundu ya da terminal olgunlaşma için kaplandı. Üretilen iNGN2 nöronları, klasik nöronal belirteçleri erken dönemde eksprese etti ve kaplamadan sonraki 1 hafta içinde karmaşık nöritik ağlar oluşturdu ve bu da nöronal kültürlerin artan bir olgunluğuna işaret etti. Özetle, 3D ortamda hiPSC türevli nöronların hızlı üretimi için ayrıntılı bir adım adım protokol, hastalık modellemesi, fenotipik yüksek verimli ilaç taramaları ve büyük ölçekli toksisite testi için bir başlangıç noktası olarak büyük bir potansiyele sahiptir.

Introduction

Nörolojik bozukluklar dünya çapında engelliliğin önde gelen nedenidir1. Altı kişiden biri etkilenir ve insidans artmaya devam eder. Toplumlar ve sağlık sistemleri üzerindeki ilgili mali yük çok büyüktür. 2010 yılında 30 Avrupa ülkesinin değerlendirilmesi, zihinsel ve nörolojik bozukluklarla ilgili tahmini yıllık 800 milyar € maliyettir2. Artan sosyoekonomik yük, etkili tedavi stratejileri gerektirmekte ve hastalık patofizyolojisi konusundaki anlayışımız önemli ölçüde artmış olsa da, kliniklere çeviri çoğu zaman yetersiz kalmaktadır. Genel olarak, farmasötiklerin sadece% 12’si klinik çalışmalara girmektedir, bunların% 80’inden fazlası daha sonraki aşamalarda, esas olarak etkisizlik veya öngörülemeyen toksisite nedeniyle başarısız olmaktadır 3,4. Sebepler çeşitlidir, ancak klinik öncesi aşamalardaki hayvan testlerinden insan deneylerine sınırlı aktarılabilirlik giderek daha fazla ön plana çıkmıştır5. İnsan in vitro hücre ve doku modelleri, türler arası translasyon boşluğunu kapatabilir ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) teknolojisindeki ilerlemeler bu konuda büyük bir potansiyele sahiptir. hiPSC’ler temel araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır ve embriyonik kök hücrelerle (hESC’ler) neredeyse sınırsız kendini yenileme kapasitesi ve embriyo yıkımı ile ilişkili etik kaygıları aşarken her üç germkatmanına 6 farklılaşma yeteneği gibi temel özellikleri paylaşır.

Nöronal hücrelerin hESC’lerden ve daha sonra hiPSC’lerden türetilmesi, beyin araştırmalarında bir kilometre taşı oldu. İlk farklılaşma protokolleri, embriyogenez sırasında kritik adımları taklit eden büyüme faktörlerinin uygulanmasına dayanıyorduve bunların çoğu, süspansiyonda veya yapışkan kültürlerde ikili SMAD inhibisyonunu içeriyordu 7,8,9. Olgun nöronlar başarıyla üretilmiştir, ancak bu protokollerin çeşitli dezavantajları, üretilen nöronların düşük verimi ve yüksek partiden partiye değişkenliğinin yanı sıra uzun kültür süreleriyle ilgili kapsamlı iş yükü gibi ilaç geliştirmede yaygın kullanımlarını hala engellemektedir. Nörogenezde kritik rol oynayan transkripsiyon faktörlerinin zorla ekspresyonu ile iyileşmeler sağlanmıştır ve nörojenin (NGN) ailesinin üyeleri, özellikle NGN2, etkili sürücüler olarak tanımlanmıştır10. HiPSC’lerde NGN2’nin lentiviral aracılı ektopik ekspresyonu, nöronal farklılaşmanın erken aşamalarını önemli ölçüde hızlandırdı ve sadece 1 hafta içinde nöronal hücre kaderini indükledi11. Astrositlerle birlikte kültürlerde daha sonraki terminal olgunlaşma, tekrarlanabilir özelliklere sahip yüksek saflıkta ve miktarda fonksiyonel nöronlar verdi. Daha sonra NGN212,13 için stabil ve doksisiklin ile indüklenebilir bir ekspresyon kaseti ile hiPSC hatları oluşturmak için adeno ilişkili virüs entegrasyon bölgesi 1 (AAVS1) güvenli liman lokusunun bölgeye yönelik gen düzenlemesi uygulandı ve böylece lentiviral iletimin istenmeyen yan etkileri en aza indirildi.

Doksisiklin ile indüklenebilir nörojenin 2 (iNGN2) nöronlarının sağlam ve etkili farklılaşması, yüksek verimli fenotipik ilaç taramaları ve toksisite testleri için büyük bir potansiyele sahiptir10,14,15; ve son on yılda ölçeklenebilir bir hücre genişlemesi ve farklılaşması için biyoreaktörlerin uygulanmasında biyoişlemede önemli ilerlemeler kaydedilmiştir16,17,18,19. Bununla birlikte, farklılaşma protokollerinin çoğunluğu bağlı kültürler için optimize edilmiştir ve üç boyutlu (3B) bir ortama çeviri genellikle temel değişiklikler gerektirir. Son zamanlarda, hiPSC’lerin genişlemesi ve hepatositlere, kardiyomiyositlere ve nöronlara tekrarlanabilir farklılaşma için azaltılmış kayma stresi özelliklerine sahip bir tezgah üstü 3D biyoreaktörün başarılı bir şekilde kullanıldığı bildirilmiştir20. Burada, iNGN2 nöronlarının üretimi ve karakterizasyonu için aynı tezgah üstü 3D biyoreaktör kullanılarak ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır.

Protocol

NOT: Tüm hücre manipülasyonları, ayrıca kültür yemekleri ve ortam preparatları steril koşullar altında yapılmalıdır. Laminer akış davlumbazı, kullanımdan önce ve işlendikten sonra tüm yüzeyler etanol ile silinerek iyice temizlenmelidir. Açıklanan protokol, bir CERO 3D İnkübatörü ve Biyoreaktöründeki nöronal farklılaşmalar için optimize edilmiştir (aşağıda tezgah üstü biyoreaktör olarak anılacaktır). Bu tezgah üstü biyoreaktör, her biri maksimum 50 mL kapasiteye sahip özel biyoreaktör tüpleri için dört yuva sunar. Sıcaklık ve CO2 seviyeleri sürekli olarak kontrol edilir ve her tüp için yetiştirme parametreleri (örneğin, dönme hızı ve zamanı) bağımsız olarak düzenlenir. Tüm aspirasyon adımları, aksi belirtilmemişse, bir aspirasyon pipeti ve vakum pompası kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 1. HiPSC’lerin kültürlenmesi ve genişletilmesi NOT: Bu protokolde mühendislik ürünü doksisiklin ile indüklenebilir NGN2 hiPSC hattı BIONi010-C-13 kullanılmıştır. Burada sağlanan genişletme protokolü 6 cm’lik Petri kapları için optimize edilmiştir, ancak tercih edilirse alternatif kültür formatları kullanılabilir. Soğuk Dulbecco’nun modifiye Eagle’s medium (DMEM)/F12 (-/-) ile seyreltilmiş baz membran matrisli 6 cm’lik Petri kaplarını 0,083 mg/mL/10cm2’lik bir nihai konsantrasyonda kaplayın. Kaplanmış bulaşıkları 37 °C’de en az 30 dakika inkübe edin.NOT: Bazal membran matris çözeltisinin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol, üreticinin talimatlarında bulunabilir. hiPSC’ler genişleme için alternatif hücre dışı matrisler üzerinde kültürlenebilir. EBiSC Hücre hattı Kullanıcı Protokolü21’e göre kriyokorunmuş hiPSC’leri besleyicisiz iPSC bakım ortamında + 10 μM ROCK inhibitöründe (Y-27632) çözün. 60 mm’lik çanak başına 1 × 106 canlı hücrenin tohumlama yoğunluğu önerilir. Ertesi gün ortamı ROCK engelleyicisi olmayan besleyicisiz iPSC bakım ortamına değiştirin ve günlük ortam değişiklikleri gerçekleştirin. HiPSC kültürleri% 60 -% 80’lik bir birleşime ulaştığında geçmeye başlayın. Farklılaştırılmış alanları kontrol edin ve alan% 5’i aşarsa kolonileri manuel olarak temizleyin.NOT: Farklılaşmamış hiPSC’ler, belirgin bir nükleolus ve daha az sitoplazmaya sahip yuvarlak hücreler olarak görünür. Düz ve sıkıca paketlenmiş koloniler, çözüldükten veya geçtikten sonra erken oluşur. HiPSC kültürlerinin örnek parlak alan görüntüleri Şekil 1’de gösterilmiştir. Daha fazla bilgi EBiSC Hücre hattı Kullanıcı Protokolü21’de verilmiştir. Geçiş için, bodrum membran matris kaplı tabaklar ve besleyicisiz iPSC bakım ortamı hazırlayın. Ortamı hiPSC kültürlerinden aspire edin ve hücreleri 0.5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile 1x Dulbecco’nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) Ca 2 + ve Mg 2+ olmadan2 kat durulayın (DPS [-/-], bkz. Süpernatantı çıkarın ve 6 cm’lik Petri kaplarına 1x DPBS’de (-/-) 2 mL 0,5 mM EDTA ekleyin. Hücreleri inkübatörde 3 dakika boyunca 37 ° C’de inkübe edin. EDTA çözeltisinin 1.5 mL’sini aspire edin ve 3-5 dakika boyunca inkübasyona devam edin. Hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için bulaşıklara hafifçe dokunun.NOT: Ayırmayı görsel değerlendirme ile kontrol edin. hiPSC kolonileri 5 dakika sonra ayrılmaya başlamalıdır, ancak daha yüksek akışlı hiPSC kültürleri ile daha uzun bir inkübasyon süresi gerekebilir. Koloniler ayrılmazsa, kuluçka süresini 10 dakikaya kadar artırın, ancak bu zaman dilimini aşmayın. 6 cm’lik Petri kaplarına 5 mL besleyicisiz iPSC bakım ortamı ekleyin ve 10 mL serolojik pipetle veya geniş delikli pipet uçları kullanarak kolonileri 2 kat hafifçe askıya alın. Hücreleri 15 mL’lik bir tüpe aktarın.NOT: hiPSC’ler mekanik strese karşı oldukça hassastır; Bu nedenle, birden fazla yeniden askıya alma işleminden kaçınılmalıdır. Son hücre süspansiyonu küçük koloni parçalarından (50-200 μm) oluşmalıdır. Süpernatantı kaplanmış kültür yemeklerinden aspire edin ve 6 cm’lik tabak başına 4 mL besleyicisiz iPSC bakım ortamı hazırlayın. Küçük koloni parçalarını taze hazırlanmış kültür yemeklerine 1:10 ila 1:40 arasında bölünmüş oranlarda aktarın ve günlük medya değişiklikleriyle 37 ° C’de ve% 5 CO2’de yetiştirin.NOT: Küçük koloniler geçişten sonra 1 veya 2 saat içinde bağlanmalıdır. Şekil 1: İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kültürlerinin morfolojisi . (A,B) Homojen morfolojiye ve tanımlanmış kenarlara sahip sıkıştırılmış hiPSC kolonilerini gösteren farklı birleşimlere sahip kaliteli hiPSC kültürleri. (C) koloni kenarları etrafında ortaya çıkan farklılaşmış hücre kümeleri ile hiPSC kültürü (kesikli beyaz çizgi). Ölçek çubuğu = 200 μm. Kısaltma: hiPSC = insan kaynaklı pluripotent kök hücre. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. 2. Tezgah üstü biyoreaktör sisteminde hiPSC’lerin ön ekimi (gün-2) NOT: HiPSC kültürleri ila arasında bir birleşime ulaştığında ön ekime başlayın. Farklılaşmış alanlar için hiPSC kolonilerini kontrol edin. Bu ön ekim aşamasında, hiPSC’ler 2 gün boyunca besleyicisiz iPSC bakım ortamında tutulur. Besleyicisiz iPSC bakım ortamı ve 10 μM ROCK inhibitöründen (Y-27632) oluşan kültür ortamını hazırlayın. Ortamı hiPSC’lerden tamamen aspire edin ve hücreleri iki kez 1x DPBS (-/-) ile nazikçe durulayın. 6 cm’lik Petri kaplarına 2.0 mL önceden ısıtılmış tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve hücreleri inkübatörde 37 ° C’de 3 dakika boyunca inkübe edin. Hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için bulaşıklara hafifçe dokunun veya 1-2 dakika daha inkübe edin. Hücreleri, çanak başına 5 mL besleyicisiz iPSC bakım ortamı + ROCK inhibitöründe yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 15 mL veya 50 mL’lik bir tüpe aktarın ve hücre tekillemesini sağlamak için pipetleme ile hafifçe karıştırın. Daha önce20 açıklandığı gibi otomatik bir hücre sayacı kullanarak 100 μL hücre süspansiyonundaki hücre sayılarını belirleyin. Biyoreaktör tüpü başına 15 × 106 hücre için karşılık gelen hacmi 50 mL’lik bir tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin ve hücreleri 2 mL besleyicisiz iPSC bakım ortamı + ROCK inhibitöründe yeniden askıya alın. Her 50 mL’lik tüpü 18 mL ortamla doldurun (hücre tohumlama yoğunluğu 0,75 × 106 hücre/mL). Hücre süspansiyonunu biyoreaktör tüplerine dağıtın (tüp başına 20 mL). Tüpleri biyoreaktör sistemine yerleştirin. Aşağıdaki yetiştirme parametrelerini ayarlayın: 2 s dönme süresi, 60 rpm dönme hızı, ajitasyon duraklaması yok, 37 °C ve sınırsız bir süre için %5 CO2 20. Biyoreaktör ekranı aracılığıyla yetiştirme programına başlayın. Ertesi gün medyayı değiştirin. Agregaların biyoreaktör tüplerine ~ 5 dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin.NOT: Agregaların 10 dakikadan daha uzun süre yerleşmesine izin vermeyin, çünkü birbirlerine yapışabilir ve heterojen bir agrega süspansiyonu oluşturabilirler. Biyoreaktör tüpünde ~ 5 mL kültür ortamı bırakılması önerilir. Tüp başına ROCK inhibitörü olmadan 15 mL taze besleyicisiz iPSC bakım ortamı ekleyin ve tezgah üstü biyoreaktörde 24 saat boyunca ekime devam edin. 3. HiPSC’lerin erken nöronlara farklılaşması (gün 0) Nörobazal ortam (NBM) hazırlayın: stabilize L-alanil-L-glutamin dipeptid ile% 50 DMEM / F-12,% 50 nörobazal ortam,% 0.5x serumsuz takviye (50x), Bottenstein’ın N-1 formülasyonuna dayanan 0.5x serumsuz takviye (100x), 0.5x stabilize L-alanil-L-glutamin dipeptid, 0.5x MEM esansiyel olmayan amino asit çözeltisi (100x), 500 nM sodyum piruvat (100 mM), 50 nM 2-merkaptoetanol (50 mM),% 0.025 insan insülin çözeltisi ve% 0.025 insan insülin çözeltisi ve 5 U / mL penisilin-streptomisin.NOT: NBM 4 °C’de saklanmalıdır ve 2 haftaya kadar kullanılabilir. HiPSC kültürlerine doksisiklin (DOX) ekleyerek nöronal farklılaşmaya başlayın. Bunun için agregaların biyoreaktör tüplerine yerleşmesine izin verin. Süpernatantı hücrelerden dikkatlice aspire edin, tüpte ~ 5 mL bırakın ve NBM ve 2 μg / mL DOX’tan oluşan 35 mL nöral indüksiyon ortamı (NIM) ekleyin.NOT: DOX ışığa duyarlı olduğundan, çalışırken ışığın kapatılması önerilir. Tüpleri tezgah üstü biyoreaktöre geri yerleştirin ve ekime devam edin. Adım 3.2’de açıklandığı gibi 2 gün boyunca her gün medya değişiklikleri gerçekleştirin.NOT: Süspansiyon kültüründe 4 gün sonra, agregalar ayrıştırılabilir ve erken nöronlar kriyokorunabilir veya terminal olgunlaşma için doğrudan kaplanabilir. 4. Erken nöronların kriyoprezervasyonu (2. gün) NOT: Kriyoprezervasyon gerekli değildir ve farklılaşma süreci için kritik değildir, ancak daha sonraki olgunlaşma ve analizler için büyük miktarda erken nöron stoku üretilebildiği ve depolanabildiği için şiddetle tavsiye edilir. Agregaların biyoreaktör tüpüne yerleşmesine izin verin. Daha önce tarif edildiği gibi süpernatantı aspire edin. Agregaları steril 15 mL veya 50 mL tüpe aktarın ve agregaları 1x DPBS (-/-) ile 2 kat hafifçe durulayın. Agregaları rahatsız etmeden süpernatantı mümkün olduğunca dikkatlice aspire edin. Pelet boyutuna bağlı olarak 2-5 mL önceden ısıtılmış hücre ayrışma enzimi ekleyin ve hücreleri bir su banyosunda 37 ° C’de yaklaşık 10 dakika boyunca inkübe edin. Agregalar ayrışana kadar her 2 dakikada bir tortullanmış agregaları yavaşça askıya alın.NOT: 7-10 dakikalık inkübasyondan sonra neredeyse homojen bir hücre süspansiyonu elde edilmelidir. Önceden ısıtılmış NBM ortamının üçlü hacmini ekleyin ve hücre tekilleşmesini sağlamak için hücreleri dikkatlice yeniden askıya alın. Hücre numaralarını belirleyin ve kriyoprezervasyon için karşılık gelen hacmi 15 mL veya 50 mL’lik bir tüpe aktarın.NOT: 5-10 hücre yoğunluğu × 106 hücre/mL donma ortamı önerilir. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren karşılık gelen dondurma ortamı hacminde yavaşça askıya alın. Hücre süspansiyonunu kriyoprezervasyon için uygun şişelerde (1 mL / flakon) aliquot. Şişeleri derhal 2-propanol ile doldurulmuş, önceden soğutulmuş, yavaş hızlı bir dondurma kabına aktarın ve kabı gece boyunca -80 ° C’ye yerleştirin. Uzun süreli depolama için şişeleri ertesi gün -150 ° C’ye yerleştirin.NOT: Sıvı 2-Propanol oldukça yanıcıdır ve temas halinde göz hasarına neden olabilir. Isıdan uzak tutun ve koruyucu eldivenlerin yanı sıra gözlük de takın. 5. Tek katmanlı kültürlerde hiPSC türevli nöronların olgunlaşması HiPSC türevli nöronların uzun süreli yetiştirilmesi için poli-L-ornitin / laminin kaplı kültür yemekleri hazırlayın.Poli-L-ornitin stok çözeltisini 1x DPBS’de (-/-) %0,001’e kadar seyreltin ve bulaşıkları gece boyunca 4 ° C’de veya 37 ° C’de 4 saat boyunca kaplayın. Poli-L-ornitin çözeltisini aspire edin ve plakaları bir kez 1x DPBS (-/-) ile yıkayın. Laminin çözeltisini 1x DPBS (-/-) içinde 10 μg / mL’lik son bir konsantrasyona kadar seyreltin ve bulaşıkları gece boyunca 4 ° C’de veya 37 ° C’de 4 saat boyunca inkübe edin.NOT: Kaplama prosedürleri içincm2 başına 0,1-0,15 mL, ilgili tüm yıkama adımları içincm2 başına 0,2 mL hacim önerilir. Alternatif kaplama substratları kullanılabilir, ancak hücre bağlanması ve olgunlaşması üzerindeki potansiyel etkiler değerlendirilmelidir. Kriyokorunmuş hücreleri çözün. Bunun için, kriyoviyal bir su banyosuna (37 ° C’ye ayarlanmış) yerleştirin ve küçük bir donmuş hücre süspansiyonu kümesi kalana kadar yaklaşık 1 dakika boyunca döndürün. Hücre süspansiyonunu, 10 mL önceden ısıtılmış NBM ile hazırlanan 15 mL’lik bir tüpe damla damla dikkatlice aktarın. Kriyoviyal 1 mL NBM ile durulayın ve hücre süspansiyonunu aynı 15 mL tüpe aktarın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin ve 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 1-2 mL NIM ekleyin. Hücre peletini dikkatlice askıya alın ve hücre numaralarını belirleyin. Kalan laminin çözeltisini kaplanmış hücre kültürü kaplarından aspire edin ve hücreleri 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş NIM’de 1 × 105 hücre /cm2’lik bir tohumlama yoğunluğunda tohumlayın. 24 saat sonra ortamı ROCK inhibitörü olmadan NIM’e geçirin. 4 gün boyunca günlük ortam değişiklikleri yapın. NGN2 indüksiyonunun bu ilk aşamasından sonra, DOX’u atlayın ve NBM’deki hücreleri kültürleyin, yarım ortam değişiklikleri istenen olgunlaşma aşamasına ulaşana kadar haftada 2 kez değişir.NOT: iNGN2 nöronlarının astrositlerle birlikte kültürlenmesi, hücre sağkalımını, bağlanmasını, olgunluğunu ve elektriksel aktivitesini arttırmak için önerilir13,22. 6. HiPSC türevli nöronların karakterizasyonu NOT: Nöronal türevlere farklılaşma aşağıdaki tekniklerle değerlendirilebilir. İmmünositokimya ve görüntülemeOrtamı hiPSC türevi nöronlardan aspire edin ve hücreleri bir kez Ca 2 + ve Mg2 + (+/+ ) ile 1x DPBS ile yıkayın.NOT: Hücreler yüzeyden çok kolay ayrılabileceğinden, pipeti dikkatli bir şekilde, tercihen kuyu kenarlarında tutun. 1x DPBS (+/+) ile hücrelerin tam olarak kaplanmasını sağlamak için tüm yıkama adımları içincm2 başına 0,2 mL’lik bir hacim önerilir. Nöronal hücreleri, oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca DPBS’de (+/+) %4 paraformaldehit içeren bir fiksasyon çözeltisi kullanarak sabitleyin. cm2 başına 0,1 mL’lik bir hacim önerilir.NOT: DPBS’deki paraformaldehit (%4), akut toksisitesi ve potansiyel kanserojenliği olan tehlikeli ve cildi tahriş edici bir çözümdür. Isıdan uzak tutun, koruyucu eldiven ve gözlük takın, solumaktan kaçının ve solüsyonu yalnızca havalandırılan bir ortamda kullanın. Hücreleri 1x DPBS’de (+/+) 2x nazikçe durulayın ve boyama işlemine devam edin.NOT: Sabit hücreler DPBS’de (+/+) 4 °C’de sonraki işlemlere kadar 1 aya kadar saklanabilir. DPBS’yi (+/+) örneklerden aspire edin. RT’de 60 dakika boyunca %1 BSA ve %0,2 Triton-X-100 içeren 1x DPBS (+/+) ile hücreleri geçirgenleştirin ve spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke edin.NOT:cm2 başına 0,2 mL’lik bir hacim önerilir. Süpernatantı çıkarın ve hücreleri gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin, ilgili birincil antikorlar boyama tamponunda seyreltilir (% 1 BSA içeren 1x DPBS [+/+]) (bkz. Hücrelerin tamamen çözelti ile kaplandığından emin olun.NOT:cm2 başına 0,1-0,15 mL’lik bir hacim önerilir. Boyama tamponunu aspire edin ve hücreleri 1x DPBS’de (+/+) 3 kat durulayın. İlgili ikincil antikorları (bakınız Malzeme Tablosu) boyama tamponunda 1:1.000’lik bir son konsantrasyonda seyreltin. Hücreleri seyreltilmiş antikor çözeltisinde karanlıkta RT’de 1 saat boyunca inkübe edin. Hücrelerin tamamen çözelti ile kaplandığından emin olun.NOT:cm2 başına 0,1-0,15 mL’lik bir hacim önerilir. İkincil antikor çözeltisini aspire edin ve hücreleri 1x DPBS’de (+/+) 2 kat durulayın. Çekirdekleri, RT’de 5 dakika boyunca DPBS (+/+) içinde seyreltilmiş 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile karşı boyayın.NOT:cm2 başına 0,1-0,15 mL’lik bir çalışma hacmi önerilir. Hücreleri 1x DPBS’de (+/+) 2 kat durulayın. Hücreleri görüntülemeye kadar DPBS’de (+/+) 4 °C’de saklayın.NOT: Parlak alan görüntüleme, morfolojik değişiklikleri ve nörit büyümesini izlemek için uygundur. Ek olarak, stereotipik belirteç ekspresyonu floresan mikroskobu ile değerlendirilebilir. Farklılaşmamış hiPSC’ler OCT 3/4 ve NANOG’u eksprese ederken, beta-III-tübülin (TUBB3) ve mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2), nöritleri ve aksonları görselleştirmek için nöronal belirteçler olarak işlev görebilir. Nöritik ağ, parlak alan veya floresan görüntülerdeki nörit uzunluğunu belirleyerek daha fazla değerlendirilebilir. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile gen ekspresyon analizleriOrtamı aspire edin ve hücreleri 1x DPBS’de (-/-) bir kez durulayın.NOT:cm2 başına 0,2 mL’lik bir hacim önerilir. Soğuk RNA lizis tamponu ekleyin ve hücreleri çizerek toplayın. Uygun bir kolon bazlı kit kullanarak RNA’yı izole edin ve RNA konsantrasyonlarını UV fotospektrometrisi ile belirleyin. 250 ng toplam RNA ve ters transkripsiyon için uygun bir kit kullanarak cDNA üretin. Kopya halinde 2.5 ng cDNA içeren moleküler beacon qPCR reaksiyonlarını hazırlayın. Uygun bir ana karışım ve ilgili astar tahlilleri20 kullanın (bakınız Malzeme Tablosu). qPCR’yi, 20 s boyunca 60 ° C’de astar tavlama ile 45 döngü uygulayarak çalıştırın. Göreceli gen ekspresyon seviyelerini, temizlik genleri GAPDH, HPRT1 ve GUSB’nin ortalamasına normalleştirin. Kalibratör olarak farklılaşmamış hiPSC’leri kullanarak ΔΔCt metodu23’ü uygulayın.

Representative Results

İlk adımlarda, hiPSC’lerin yapışkan kültürleri ayrılır, tekilleştirilir ve süspansiyona aktarılır (Şekil 2). Agregalar 24 saat içinde oluşur ve sürekli olarak büyür. Transgen indüksiyonundan 2 gün sonra, erken nöronlar sonraki deneyler için kriyokorunabilir. Süspansiyonun ilk günlerinde kalıcı proliferasyon, hücre sayısında bir artışa neden olur ve 2 günlük indüksiyondan sonra zirveye ulaşır (Şekil 3A, B). Çoğalma ile birlikte, agregalar büyümeye başlar. 0. güne kıyasla, çap 2. günde ‘lik bir artış gösterir ve 5. günde neredeyse iki katına çıkar (Şekil 3D). Artan bir çap, agregaların içindeki besin arzını sınırlasa da, hücrelerin canlılığı farklılaşmanın 2. gününde veya 5. gününde etkilenmez (Şekil 3C). Bununla birlikte, süspansiyonda 4 günden fazla uzun süreli bir ekim, agregalar enzimatik tekilleşmeye karşı giderek daha dirençli hale geldiğinden, hücre verimini daha da artırmaz (Şekil 3B). Kriyoprezervasyon üzerine, 2. gün hücreleri çözülür ve terminal olgunlaşması için poli-L-ornitin (PLO)-laminin kaplı tabaklara kaplanır. Genel olarak, hücreler çözüldükten sonra çok iyi bağlanır ve nöritleri erken uzatmaya başlar. Temporal gen ekspresyon profili ve nöronal belirteçler TUBB3 ve MAP2 için immünositokimyasal boyama, nöronal hücre kimliğini doğrulamaktadır (Şekil 4A, B). Yükselen TUBB3 ve MAP2 seviyelerine ek olarak, nöronal kültürler mikrotübül ile ilişkili protein tau transkriptlerinde (MAPT) zenginleştirilir, akson stabilizasyonunda yer alan nöronal bir proteini kodlar ve pluripotensi düzenleyici transkripsiyon faktörü POU5F1’in ekspresyonunda eşzamanlı bir düşüş gösterir. Ayrıca, çözülmeden sonraki ilk hafta içinde yoğun bir nöritik ağ oluşur (Şekil 4C). Bu morfolojik değişiklikler, transkripsiyonel profil ile birlikte, nöronal kültürlerin artan bir olgunlaşmasını göstermektedir. Şekil 2: Bir tezgah üstü biyoreaktör kullanılarak hiPSC türevi iNGN2 nöronlarının üretimi. (A) Hücre kültürünün temel adımlarını vurgulayarak farklılaşma paradigmasına şematik genel bakış. (B-F) Parlak alan görüntüleri, (B) hiPSC’leri ve (C,D) tezgah üstü biyoreaktörde agrega oluşumunu görselleştirir. (E,F) iNGN2 nöronları nöritleri genişletir ve farklılaşma sırasında morfolojik değişikliklere uğrar. Ölçek çubuğu = 100 μm. Kısaltmalar: BMM = bazal membran matrisi; iPSC-MM = iPSC bakım ortamı; FKÖ = poli-L-ornitin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Agrega oluşumu ve büyümesi sırasında hücre verimi ve canlılığı. (A) Parlak alan görüntüleri, tezgah üstü biyoreaktörde kültürden sonraki 2 gün içinde agrega oluşumunu ve zaman içinde agrega boyutundaki artışı göstermektedir. Ölçek çubuğu = 500 μm. (B) Hücre veriminin nicelleştirilmesi ve (C) farklılaşma seyri boyunca canlılık. Çubuk grafikler, dört bağımsız deneyden elde edilen ortalama + SD’yi temsil eder. (D) Agregaların boyutunu gösteren çap, açık kaynaklı yazılım ImageJ (sürüm 1.53) kullanılarak yarı otomatik olarak belirlenmiştir. İlk olarak, parlak alan görüntüleri ikili görüntülere dönüştürüldü ve daha sonra aşağıdaki parametreleri uygulayarak parçacıkları analiz etme aracı kullanılarak daha fazla değerlendirildi: boyut > 2.500 μm2, dairesellik 0.45-1, kenarları hariç tutma ve delikler içerme. Yatay çizgiler, beş bağımsız farklılaşmanın ortalama ± SD’sini gösterir. Tek noktalar, zaman noktası başına en az 20 toplama ile bireysel farklılaşma deneylerinin ortalamasını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: HiPSC türevi iNGN2 nöronlarının karakterizasyonu. Nöronal genler TUBB3, MAP2 ve MAPT için zamansal gen ekspresyon profilinin yanı sıra pluripotent kök hücre ile ilişkili gen POU5F1. Göreceli ekspresyon seviyeleri referans genler GAPDH, HPRT1 ve GUSB’ye normalleştirildi. Kalibratör olarak farklılaşmamış hiPSC’ler (gün-2) seçildi. Geometrik semboller, dört bağımsız farklılaşmanın ortalama ± SD’sini gösterir. (B) Çözüldükten sonra 7. günde (gün-2 + 7) iNGN2 nöronlarının temsili görüntüleri, beta-III-tübülin (TUBB3, macenta) ve mikrotübül ile ilişkili protein 2 (MAP2, camgöbeği) için boyanmıştır. Hücre çekirdekleri DAPI ile boyandı. Ölçek çubukları = 100 μm. (C) Çözüldükten sonra nöronal kültürlerin parlak alan görüntülerinde nöritik ağın değerlendirilmesi. Nöritlerin toplam uzunluğu, ImageJ (versiyon 1.53) kullanılarak 930.82 × 698.11μm2’lik bir alanda belirlendi. Parlaklık ve kontrast ayarlandıktan sonra, görüntüler 8 bit görüntülere dönüştürüldü ve renkler tersine çevrildi. Nöritler daha sonra iskeletleştirildi ve daha sonra sırasıyla ImageJ eklentileri ‘Skeletonize’ ve ‘Analyze Skeleton’ kullanılarak analiz edildi. Nöritlerin toplam uzunluğu, ortalama nörit uzunluğunu / hücresini vermek için ilgili bölgedeki soma sayısına bölündü. Çubuk grafikler, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama + SD’yi temsil eder. Kısaltmalar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Nöronal transkripsiyon faktörü NGN2’nin ektopik ekspresyonunun, nöronal farklılaşmanın erken aşamalarını hızlandırdığı ve ekimden sonraki 1 hafta içinde hiPSC’lerde nöronal soy bağlılığını indüklediği daha önce gösterilmiştir12,13,20. Bu çalışma, gen düzenlenmiş BIONi010-C-13 hiPSC’lerin bir tezgah üstü biyoreaktör kullanılarak iNGN2 nöronlarına farklılaştırılması için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır.

CERO 3D biyoreaktör, her biri maksimum 50 mL kapasiteye sahip özel tüpler için dört yuvaya sahip düşük hacimli bir biyoreaktördür. Sıcaklık ve CO2 seviyeleri sürekli olarak kontrol edilir ve her tüp için yetiştirme parametreleri (örneğin, dönme hızı ve zamanı) düzenlenir, böylece bağımsız olarak kullanıcıların paralel olarak çeşitli farklılaştırma yaklaşımlarını çalıştırmasına olanak tanır. İç boru duvarındaki entegre dalga kırıcılar, ortamın düşük kayma gerilimi ile pertürbasyonuna izin verir ve kontrollü dönüş sırasında süspansiyonda 3D agregaları korur. Besinlere sınırlı erişimin yanı sıra zorla 3D hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matris (ECM) etkileşimleri, hücresel farklılaşmayı ve davranışı önemli ölçüde etkileyebilir24,25,26,27.

Hücrelerin süspansiyonda 3D agregalar olarak kültürlenmesi, bu hücre etkileşimlerini arttırır, böylece doku veya organların in vivo ortamını daha yakından taklit eder28. Ortamın eşzamanlı pertürbasyonu, mekanik sürtünme nedeniyle agrega boyutunu düzenler, gaz değişimini iyileştirir ve agregaların içindeki fizyolojik ilgili gradyanları korurken, tüpteki besin maddelerinin ve atıkların gradyanını azaltır 29,30,31,32,33,34. Orta modifikasyonlar manuel olarak yapılsa da, tezgah üstü biyoreaktör statik kültür şişelerine kıyasla işçilik ve işletme maliyetlerini azaltır. Biyoreaktör ayrıca tam otomatik karıştırma tankı biyoreaktörlerine göre çeşitli avantajlar sunar, çünkü pervanesiz tasarım agrega yüzeyindeki hidrodinamik kayma stresini azaltır, böylece sadece hücre sağkalımını iyileştirmekle kalmaz, aynı zamanda kayma stresinin hassas iPSC’ler, hücre farklılaşması ve fonksiyon35,36,37,38 üzerindeki etkilerini de sınırlar.

Hücrelerin büyük bir dikey pervane ile çalkalandığı dikey tekerlek biyoreaktörleri ve motorlu bir platforma bağlı şişirilmiş kültür torbaları kullanan sallanan hareket biyoreaktörleri, alternatif 3D süspansiyon platformlarını temsil eder. HiPSC’lerin yetiştirilmesi için aşırı derecede test edilmesine rağmen, 17,18,19,39,40, nöronal farklılaşma yaklaşımlarında uygulanabilirlikleri hakkında çok az şey bilinmektedir ve raporlar, karıştırma tankı biyoreaktörlerinde memeli ve insan nöral öncü hücrelerinin başarılı bir şekilde genişlemesi ile sınırlıdır41,42,43,44, nadir sayıda çalışma odaklanmaktadır. olgunlaşma44,45. Genel olarak, otomatik 3D süspansiyon platformları, tam otomatik ve bilgisayar kontrollü ortam değişimlerinin avantajını sunar, böylece kullanımdaki farklılıkları azaltır ve kontaminasyon riskini en aza indirir. Ayrıca, laktat ve glikoz konsantrasyonu gibi besin parametreleri sürekli olarak izlenebilir. Bununla birlikte, bu sistemlerin kurulması genellikle önemli bir ilk yatırım, laboratuvar alanı ve nitelikli personelin eğitimini gerektirir. Masaüstü biyoreaktör, süspansiyondaki hücrelerin kültürlenmesi için kompakt ve kullanımı kolay bir alternatifi temsil eder, ancak besin maddelerinin eşzamanlı olarak izlenmesini sağlamaz.

3D süspansiyon platformlarında hücrelerin yetiştirilmesi için kullanılan protokollerin çoğunda olduğu gibi, agregaların ilk oluşumu kritik bir adımı temsil eder. hiPSC’ler yapışkan tek katmanlar olarak kültürlenir ve daha sonra tek hücreli süspansiyonlar olarak 3B ortama aktarılır. Bu aşamada hücre kaybını en aza indirmek için, birkaç yönün göz önünde bulundurulması gerekir. Entegre dalga kırıcılı tüplerin tasarımı, optimum ortam pertürbasyonunu sağlamak için tüp başına minimum 10 mL’lik bir kültür hacminin gerekli olduğu anlamına gelir. Bu nedenle kritik hacim uzun vadede kesilmemelidir. Ayrıca, 10 mL kültür hacmi başına 7,5 milyon hücrelik bir başlangıç tohumlama yoğunluğu ve 60 rpm’lik bir dönme hızı, kısa vadede kararlı agregalar oluşturmak için şiddetle tavsiye edilir, ancak adaptasyonlar hücre hattına bağlı olarak gerekli olabilir.

HiPSC’leri süspansiyona aktardıktan sonra, agregalar 24 saat içinde oluşturulmalıdır. İlk ortam değişikliği kritiktir, çünkü agregalar küçüktür ve düzgün bir şekilde yerleşmeyebilir. Agregaların çökelme süresi uzatılabilir, ancak agregalar kümelenmeye ve heterojen bir şekilde büyümeye başlayabileceğinden, 10 dakikadan fazla olmamalıdır. Aspirasyon sırasında, tüpte minimum 5 mL’lik bir kültür hacmi bırakılmalı ve ortamın herhangi bir şekilde bozulmasından kaçınılmalıdır. Bununla birlikte, ilk aşamalarda hücre ve agrega kaybı beklenir. Hücre sayımları, kültürdeki ilk 2 gün boyunca sabit bir hücre verimini gösterir, bu da hiPSC’lerin yüksek proliferatif kapasitesinin ilk hücre kaybını telafi ettiğini gösterir. Süspansiyona girdikten sonra, nazik ekim ve pertürbasyon, zamanla büyümeye başlayan homojen boyutlu agregalara yol açar.

Nöronal farklılaşma, doksisiklin kaynaklı NGN2 aşırı ekspresyonu13’e dayanan daha önce yayınlanmış bir protokole göre gerçekleştirildi ve bireysel adımlar 3D yetiştirme için optimize edildi. Nöronal transkripsiyon faktörü NGN2, nöronal farklılaşmada iyi tanımlanmış bir sürücüdür ve nöronal indüksiyonu önemli ölçüde hızlandırır11,13,46. Tanımlanmış büyüme faktörleri ile konvansiyonel modelleme birkaç hafta ilaay 7,8,9 sürerken, NGN2 ekspresyonu günler içinde nöronal hücre kaderini indükler. Kısaltılmış yetiştirme süresine ek olarak, protokol ne pahalı büyüme faktörlerine ne de ilk süspansiyon kültürü için kaplama matrislerine bağlıdır, böylece ekim maliyetlerini ek olarak azaltır.

Dahası, yapışkan ve süspansiyonlu kültürlerde NGN2 güdümlü olgunlaşmamış nöron neslinin doğrudan karşılaştırılması, tezgah üstü biyoreaktör20 kullanılarak kültürde 4 gün sonra hücrelerde 1.36 kat artış olduğunu ortaya koyarken, 1 milyon hücrenin üretimi için gereken ortam hacminin yarıya indirilmesi bekleniyor. Bu nedenle, iNGN2 nöronlarının üretimi için tezgah üstü biyoreaktörün kullanılması faydalı olabilir, çünkü daha düşük bir taşıma süresi ve maliyeti ile daha fazla sayıda hücre üretilebilir. Önceki raporlara paralel olarak, nöronal soy bağlılığı erken dönemde gözlenmiştir. 2 günlük NGN2 indüksiyonundan sonra, TUBB3, MAP2 ve MAPT gibi klasik nöronal belirteçlerin derin bir ekspresyonu belirgindi ve nöronal indüksiyon için tezgah üstü biyoreaktörün uygulanabilirliğini destekledi. Bu protokolü takiben, kültürden sonraki 4 gün içinde 1 milyon hiPSC’den yaklaşık 6.2 milyon olgunlaşmamış iNGN2 nöronu elde edilebilir. Bununla birlikte, çıkış kapasitesi partiler arasında değişebilir ve tohumlamadaki süspansiyon kültürünün hacmine bağlı olabilir.

Verimi daha da artırmak için, ekim süresi 3 gün daha uzatıldı; Bununla birlikte, agregalar daha büyük olmasına rağmen, aynı zamanda oldukça kompakt hale geldiler ve kriyoprezervasyon veya yeniden kaplama için uygun şekilde ayrıştırılamadılar. 3D kültür yaklaşımlarındaki ilerlemelere rağmen, yapışkan 2D nöronal kültürler hala mikroelektrot dizileri veya kalsiyum görüntüleme gibi fonksiyonel analizler için altın standarttır. Bu nedenle hücre tekilizasyonu, homojen olarak dağılmış nöronal tek katmanlı ve nöritik ağ için önemli bir ön koşuldur. Tekilleşmeyi sağlamak için hücrelerin daha güçlü mekanik ayrılması veya sert ayrışma reaktifleri kullanılabilir, ancak hücre canlılığı, fizyolojisi ve yeniden bağlanma kapasitesi üzerinde potansiyel etkileri vardır47,48. Daha ileri analizler ve olgunlaşma için tek hücrelere duyulan ihtiyaç ile ilgili olarak, agregalar süspansiyonda 4 gün sonra ayrıştırıldı ve (2. gün) iNGN2 nöronları kriyoprezerve edildi. iNGN2 nöronlarının çözülme sonrası farklılaşması ve karakterizasyonu, nöronal kültürlerin artan olgunluğunu ve yoğun bir nöritik ağın oluşumunu doğruladı.

Sağlanan protokol çok sayıda iNGN2 nöronu verir. Bununla birlikte, birkaç sınırlamanın dikkate alınması gerekir. Çoğu süspansiyon kültürü platformuna gelince, hiPSC’lerin 2B’ye bağlı bir kültürden 3B bir ortama aktarılması kritiktir ve genellikle derin bir hücre kaybıyla ilişkilidir. Medya değişiklikleri sırasında daha da önemli hücre ve toplam kaybı beklenmektedir. Otomatik platformlarla karşılaştırıldığında, orta değişikliklerin manuel olarak yapılması gerektiğinden, tezgah üstü biyoreaktör kullanılarak elleçleme süresi ve kontaminasyon riski artar. Otomasyon eksikliğinin yanı sıra, tezgah üstü biyoreaktör besinleri izleme imkanı sunmaz ve tüp başına maksimum 50 mL kapasite, protokolün yükseltme potansiyelini sınırlar. Son olarak, NGN2’nin nöronal soy bağlılığını hızlandırmasına rağmen, terminal olgunlaşma süresinin kısaltılmadığını ve hala birkaç hafta boyunca uzun süreli kültür gerektirdiğini belirtmek önemlidir. Nöronal fonksiyon, bağlanma ve hayatta kalma için astrositik desteğin önemi göz önüne alındığında 49,50,51, eş-kültür yaklaşımları göz önünde bulundurulmalıdır ve hatta uzun vadeli uygulama için gerekli olabilir.

Özetle, bir 2D farklılaşma protokolü, bir tezgah üstü biyoreaktör uygulanarak iNGN2 nöronlarının hızlı ve tekrarlanabilir üretimi için 3D bir ortama başarıyla çevrildi. Açıklanan protokol, karmaşık model testleri, yüksek verimli ilaç taramaları ve büyük ölçekli toksisite testleri için bir başlangıç noktası olarak hizmet edebilecek yüksek miktarlarda iyi kaliteli, iPSC türevli nöronlar verir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

EBiSC2 projesi, 821362 numaralı hibe anlaşması kapsamında Yenilikçi İlaçlar Girişimi 2 Ortak Girişimi’nden (JU) finansman almıştır. JU, Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı ve EFPIA’dan destek almaktadır. Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters ve Vanessa M. Nalewaja’ya immünositokimyasal ve gen ekspresyon analizlerindeki yardımları için ve Heike Arthen’e mükemmel teknik desteği için teşekkür ederiz. Ayrıca, biyoreaktör programının kurulması için Stephanie Bur’a teşekkür ederiz. Şekil 2A , BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Materials

2-Mercaptoethanol 50 mM Gibco  11528926
60 mm Nunclon Delta Surface Nunc 734-2040
Anti-beta III Tubulin antibody [TU-20] (dilution 1:1,000) Abcam   ab7751 
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific   10400745
B-27 Supplement (50x)  Gibco 11530536 serum-free Supplement (50x)
BIONi010-C-13 hiPSC line European Bank for induced pluripotent Stem Cell (EBiSC), BIONEER as Depositor SAMEA103988285 Bioneer is depositor in EBiSC and owner of the hiPSC line.
Biorender  Biorender.com
BSA Cell Culture grade Thermo Fisher Scientific   12330023
CERO 3D Incubator & Bioreactor OLS OMNI Life Science 2800000
CEROtubes Cell culture Tubes 50 mL OLS OMNI Life Science 2800005
Citavi 6 Swiss Academic Software
CryoStor CS10 Stemcell 7930 freezing medium containing 10% DMSO
Cytofix Fixation Solution BD Biosciences  554655 fixation solution containing 4% paraformaldehyde 
DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN)  Thermo Fisher Scientific   12333553
Doxycycline hydrochloride (DOX) Sigma-Aldrich D3447
DPBS without Calcium and Magnesium (DPBS -/-)  Gibco 14190250
DPBS with Calcium and Magnesium (DPBS +/+)  Gibco 11580456
DMEM/F12 (-/-) Gibco 21331-020
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement Gibco 31331-028
EVOS XL Core Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific   A21424
GlutaMAX supplement  Gibco  35050-038 stabilized L-alanyl-L-glutamine dipeptid
ImageJ 1.51v  National Institute of Health
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278l
Laminin Merck L2020
MACSQuant Analyzer Miltenyi
MAP2 Monoclonal Antibody (dilution 1: 300) Thermo Fisher Scientific   13-1500 
Matrigel Growth factor reduced, phenol-red free  Corning Life Science  356231 basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Gibco  11140035
MicroAmp Optical Adhesive Film Kit  Thermo Fisher Scientific   10095714
mTeSR1 Stemcell 85850 feeder-free iPSC maintenance medium 
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502-048 serum-free Supplement based on Bottenstein’s N-1 formulation
Neurobasal Medium Gibco 11570556
Nikon Eclipse TS2 Nikon Instruments Europe B.V.
NucleoCounter-NC200 ChemoMetec A/S
Origin 2021 OriginLab
Penicillin-Streptomycin Gibco 11548876
Perm/Wash Buffer  BD Biosciences  554723
Primer assay TUBB3(Hs00801390_s1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay GAPDH (Hs99999905_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay GUSB (Hs99999908_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay HPRT1 (Hs99999909_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay MAP2 (Hs00258900_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay MAPT (Hs00902194_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay POU5F1 (Hs04260367_gH) Thermo Fisher Scientific 11620099
Poly-L-ornithine 0.01% Merck P4957
RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit Qiagen 74034 column-based RNA isolation kit
RLT Buffer Qiagen 79216 cell lysis buffer
Sodium Pyruvat (100 mM) Gibco 12539059
StemPro Accutase Gibco 11599686 cell dissociation enzyme
TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX Thermo Fisher Scientific   11380912 qPCR master mix
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
TrypLE Select Enzym Gibco 12563-011 Trypsin-EDTA solution
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G
Via1-Cassette ChemoMetec A/S 941-0012
Wide Bore Filtered Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 10088880
X20 OPTICAL 96WELL FAST CLEAR REACTION PLATES  Thermo Fisher Scientific 15206343
Y-27632 dihydrochloride, Rho kinase inhibitor (ROCK inhibitor) Abcam ab120129
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feigin, V. L., et al. The global burden of neurological disorders: translating evidence into policy. The Lancet. Neurology. 19 (3), 255-265 (2020).
  2. Olesen, J., Gustavsson, A., Svensson, M., Wittchen, H. -. U., Jönsson, B. The economic cost of brain disorders in Europe. European Journal of Neurology. 19 (1), 155-162 (2012).
  3. Preclinical Development: The Safety Hurdle Prior to Human Trials. American Pharmaceutical Review Available from: https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/187349-Preclinical-Development-The-Safety-Hurdle-Prior-to-Human-Trials (2016)
  4. van Norman, G. A. Phase II trials in drug development and adaptive trial design. JACC. Basic to Translational Science. 4 (3), 428-437 (2019).
  5. van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: part 2: potential alternatives to the use of animals in preclinical trials. JACC. Basic to Translational Science. 5 (4), 387-397 (2020).
  6. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  7. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  8. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  9. Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS One. 8 (3), 59252 (2013).
  10. Hulme, A. J., Maksour, S., St-Clair Glover, M., Miellet, S., Dottori, M. Making neurons, made easy: the use of Neurogenin-2 in neuronal differentiation. Stem Cell Reports. 17 (1), 14-34 (2022).
  11. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  12. Schmid, B., et al. Generation of two gene edited iPSC-lines carrying a DOX-inducible NGN2 expression cassette with and without GFP in the AAVS1 locus. Stem Cell Research. 52, 102240 (2021).
  13. Shih, P. -. Y., et al. Development of a fully human assay combining NGN2-inducible neurons co-cultured with iPSC-derived astrocytes amenable for electrophysiological studies. Stem Cell Research. 54, 102386 (2021).
  14. Chang, C. -. Y., et al. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-based neurodegenerative disease models for phenotype recapitulation and drug screening. Molecules. 25 (8), 2000 (2000).
  15. Silva, M. C., Haggarty, S. J. Human pluripotent stem cell-derived models and drug screening in CNS precision medicine. Annals of the New York Academy of Sciences. 1471 (1), 18-56 (2020).
  16. Elanzew, A., Sommer, A., Pusch-Klein, A., Brüstle, O., Haupt, S. A reproducible and versatile system for the dynamic expansion of human pluripotent stem cells in suspension. Biotechnology Journal. 10 (10), 1589-1599 (2015).
  17. Davis, B. M., Loghin, E. R., Conway, K. R., Zhang, X. Automated closed-system expansion of pluripotent stem cell aggregates in a rocking-motion bioreactor. SLAS Technology. 23 (4), 364-373 (2018).
  18. Kropp, C., et al. Impact of feeding strategies on the scalable expansion of human pluripotent stem cells in single-use stirred tank bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 5 (10), 1289-1301 (2016).
  19. Borys, B. S., et al. Overcoming bioprocess bottlenecks in the large-scale expansion of high-quality hiPSC aggregates in vertical-wheel stirred suspension bioreactors. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 55 (2021).
  20. Kwok, C. K., et al. Scalable expansion of iPSC and their derivatives across multiple lineages. Reproductive Toxicology. 112, 23-35 (2022).
  21. User Protocol for Human induced Pluripotent Stem Cells. EBiSC Available from: https://ebisc.org/docs/ebisc/EBiSC_User_Protocol_for_Human_induced_Pluripotent_Stem_Cells.pdf (2023)
  22. Neyrinck, K., et al. SOX9-induced generation of functional astrocytes supporting neuronal maturation in an all-human system. Stem Cell Reviews and Reports. 17 (5), 1855-1873 (2021).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  25. Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Engineering. Part A. 15 (2), 205-219 (2009).
  26. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  27. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  28. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
  29. Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Effects of hydrodynamics on cultures of mammalian neural stem cell aggregates in suspension bioreactors. Industrial and Engineering Chemical Research. 40 (23), 5350-5357 (2001).
  30. Gerecht-Nir, S., Cohen, S., Itskovitz-Eldor, J. Bioreactor cultivation enhances the efficiency of human embryoid body (hEB) formation and differentiation. Biotechnology and Bioengineering. 86 (5), 493-502 (2004).
  31. Zhao, F., et al. Effects of oxygen transport on 3-d human mesenchymal stem cell metabolic activity in perfusion and static cultures: experiments and mathematical model. Biotechnology Progress. 21 (4), 1269-1280 (2005).
  32. Cimetta, E., Figallo, E., Cannizzaro, C., Elvassore, N., Vunjak-Novakovic, G. Micro-bioreactor arrays for controlling cellular environments: design principles for human embryonic stem cell applications. Methods. 47 (2), 81-89 (2009).
  33. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Engineering. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
  34. Sargent, C. Y., et al. Hydrodynamic modulation of embryonic stem cell differentiation by rotary orbital suspension culture. Biotechnology and Bioengineering. 105 (3), 611-626 (2010).
  35. Liu, N., Zang, R., Yang, S. -. T., Li, Y. Stem cell engineering in bioreactors for large-scale bioprocessing. Engineering in Life Sciences. 14 (1), 4-15 (2014).
  36. Wolfe, R. P., Leleux, J., Nerem, R. M., Ahsan, T. Effects of shear stress on germ lineage specification of embryonic stem cells. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (10), 1263-1273 (2012).
  37. Wolfe, R. P., Ahsan, T. Shear stress during early embryonic stem cell differentiation promotes hematopoietic and endothelial phenotypes. Biotechnology and Bioengineering. 110 (4), 1231-1242 (2013).
  38. Shafa, M., et al. Impact of stirred suspension bioreactor culture on the differentiation of murine embryonic stem cells into cardiomyocytes. BMC Cell Biology. 12 (1), 53 (2011).
  39. Kwok, C. K., et al. Scalable stirred suspension culture for the generation of billions of human induced pluripotent stem cells using single-use bioreactors. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1076-1087 (2018).
  40. Rodrigues, C. A. V., et al. Scalable culture of human induced pluripotent cells on microcarriers under xeno-free conditions using single-use vertical-wheel™ bioreactors. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 93 (12), 3597-3606 (2018).
  41. Gilbertson, J. A., Sen, A., Behie, L. A., Kallos, M. S. Scaled-up production of mammalian neural precursor cell aggregates in computer-controlled suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 94 (4), 783-792 (2006).
  42. Baghbaderani, B. A., et al. Expansion of human neural precursor cells in large-scale bioreactors for the treatment of neurodegenerative disorders. Biotechnology Progress. 24 (4), 859-870 (2008).
  43. Baghbaderani, B. A., et al. Bioreactor expansion of human neural precursor cells in serum-free media retains neurogenic potential. Biotechnology and Bioengineering. 105 (4), 823-833 (2010).
  44. Serra, M., Brito, C., Costa, E. M., Sousa, M. F. Q., Alves, P. M. Integrating human stem cell expansion and neuronal differentiation in bioreactors. BMC Biotechnology. , 82 (2009).
  45. Zhao, S., et al. Generation of cortical neurons through large-scale expanding neuroepithelial stem cell from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 431 (2020).
  46. Pawlowski, M., et al. Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
  47. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
  48. Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2016).
  49. Allen, N. J. Astrocyte regulation of synaptic behavior. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 439-463 (2014).
  50. Verkhratsky, A., Nedergaard, M., Hertz, L. Why are astrocytes important. Neurochemical Research. 40 (2), 389-401 (2015).
  51. Jäkel, S., Dimou, L. Glial cells and their function in the adult brain: a journey through the history of their ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 24 (2017).

Tags

3D Suspension BioreactorHuman Neurogenin 2-inducible NeuronsInduced Pluripotent Stem CellsIPSC CultureNeuronal DifferentiationHigh-throughput ScreeningRapid And Cost-efficient GenerationCardiomyocytesPre-cultivationTrypsinizationCell SingularizationCell CountingCell SuspensionCentrifugationFeeder-free IPSC Maintenance MediumROCK InhibitorBioreactor Cultivation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wihan, J., Karnatz, I., Sébastien, I., Kettenhofen, R., Schmid, B., Clausen, C., Fischer, B., Steeg, R., Zimmermann, H., Neubauer, J. C. Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor. J. Vis. Exp. (193), e65085, doi:10.3791/65085 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image