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Neuroscience

Producción de neuronas humanas inducibles por neurogenina 2 en un biorreactor de suspensión tridimensional

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/65085
, , , , , , , , ,
1Fraunhofer Project Center for Stem Cell Process Engineering,Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering IBMT, 2Bioneer A/S, 3Fraunhofer UK Research Ltd, Technology and Innovation Centre, 4Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering IBMT, 5Department of Molecular and Cellular Biotechnology,Saarland University, 6Facultad de Ciencias del Mar,Universidad Católica del Norte

Summary

Este artículo describe un protocolo para la generación de neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos en un biorreactor de suspensión 3D de sobremesa.

Abstract

La derivación de células de linaje neuronal a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) marcó un hito en la investigación del cerebro. Desde su primer advenimiento, los protocolos se han optimizado continuamente y ahora se utilizan ampliamente en la investigación y el desarrollo de fármacos. Sin embargo, la larga duración de estos protocolos convencionales de diferenciación y maduración y la creciente demanda de hiPSC de alta calidad y sus derivados neuronales plantean la necesidad de la adopción, optimización y estandarización de estos protocolos para la producción a gran escala. Este trabajo presenta un protocolo rápido y eficiente para la diferenciación de hiPSCs genéticamente modificadas que expresan neurogenina 2 (iNGN2) inducibles por doxiciclina en neuronas utilizando un biorreactor de suspensión tridimensional (3D) de sobremesa.

En resumen, se permitió que las suspensiones unicelulares de iNGN2-hiPSCs formaran agregados dentro de las 24 h, y el compromiso del linaje neuronal se indujo mediante la adición de doxiciclina. Los agregados se disociaron después de 2 días de inducción y las células fueron criopreservadas o rechapadas para la maduración terminal. Las neuronas iNGN2 generadas expresaron marcadores neuronales clásicos desde el principio y formaron redes neuríticas complejas dentro de 1 semana después del replacado, lo que indica una madurez creciente de los cultivos neuronales. En resumen, se proporciona un protocolo detallado paso a paso para la generación rápida de neuronas derivadas de hiPSC en un entorno 3D que tiene un gran potencial como punto de partida para el modelado de enfermedades, exámenes fenotípicos de fármacos de alto rendimiento y pruebas de toxicidad a gran escala.

Introduction

Los trastornos neurológicos son la principal causa de discapacidad en todo el mundo1. Una de cada seis personas se ve afectada, y la incidencia sigue aumentando. La carga financiera asociada para las sociedades y sus sistemas de atención de la salud es enorme. Una evaluación de 30 países europeos en 2010 estimó los costes anuales de 800.000 millones de euros relacionados con trastornos mentales y neurológicos2. La creciente carga socioeconómica exige estrategias de tratamiento efectivas, y aunque nuestra comprensión de la fisiopatología de la enfermedad ha aumentado sustancialmente, la traducción a las clínicas a menudo es insuficiente. En general, solo el 12% de los productos farmacéuticos entran en ensayos clínicos, de los cuales más del 80% fracasan en etapas posteriores, principalmente debido a la ineficacia o toxicidad imprevista 3,4. Las razones son variadas, pero la transferibilidad limitada de las pruebas con animales en etapas preclínicas a los ensayos en humanos ha pasado a primer plano cada vez más5. Los modelos humanos de células y tejidos in vitro pueden cerrar la brecha de la traducción entre especies, y los avances en la tecnología de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) poseen un gran potencial en este sentido. Las hiPSC son ampliamente utilizadas en la investigación básica y comparten características esenciales con las células madre embrionarias (hESCs), como una capacidad de autorrenovación casi ilimitada y la capacidad de diferenciarse en las tres capas germinales6, al tiempo que eluden las preocupaciones éticas asociadas con la destrucción embrionaria.

La derivación de células neuronales a partir de hESCs, y más tarde hiPSCs, marcó un hito en la investigación del cerebro. Los protocolos iniciales de diferenciación se basaron en la aplicación de factores de crecimiento que imitan pasos críticos durante la embriogénesis, la mayoría de ellos con doble inhibición de SMAD en cultivos en suspensión o adherentes 7,8,9. Las neuronas maduras se han generado con éxito, pero varios inconvenientes de estos protocolos aún dificultan su amplio uso en el desarrollo de fármacos, como el bajo rendimiento y la alta variabilidad de lote a lote de las neuronas generadas, así como la extensa carga de trabajo relacionada con los largos tiempos de cultivo. Se han logrado mejoras mediante la expresión forzada de factores de transcripción críticamente implicados en la neurogénesis, y los miembros de la familia de las neurogeninas (NGN), en particular la NGN2, han sido identificados como impulsores efectivos10. La expresión ectópica mediada por lentivirus de NGN2 en hiPSCs aceleró significativamente las primeras etapas de la diferenciación neuronal e indujo el destino celular neuronal en solo 1 semana11. La maduración terminal posterior en cocultivos con astrocitos produjo neuronas funcionales en alta pureza y cantidad con propiedades reproducibles. Luego se aplicó la edición génica dirigida al sitio del locus de puerto seguro del sitio de integración de virus adenoasociados 1 (AAVS1) para crear líneas hiPSC con un casete de expresión estable e inducible por doxiciclina para NGN212,13, minimizando así los efectos secundarios no deseados de la administración lentiviral.

La diferenciación robusta y eficiente de las neuronas de neurogenina 2 inducibles por doxiciclina (iNGN2) tiene un gran potencial para los exámenes fenotípicos de fármacos de alto rendimiento y los ensayos de toxicidad10,14,15; y se han logrado avances sustanciales en el bioprocesamiento durante la última década implementando biorreactores para una expansión y diferenciación celular escalable16,17,18,19. Sin embargo, la mayoría de los protocolos de diferenciación están optimizados para culturas adherentes, y la traducción a un entorno tridimensional (3D) a menudo requiere modificaciones esenciales. Recientemente, se ha reportado el uso exitoso de un biorreactor 3D de sobremesa con características de esfuerzo cortante reducido para la expansión de hiPSCs y para la diferenciación reproducible en hepatocitos, cardiomiocitos y neuronas20. Aquí, se proporciona un protocolo detallado para la generación y caracterización de neuronas iNGN2 utilizando el biorreactor 3D de sobremesa idéntico.

Protocol

NOTA: Todas las manipulaciones celulares, así como las placas de cultivo y las preparaciones del medio, deben realizarse en condiciones estériles. La campana de flujo laminar debe limpiarse a fondo antes de su uso y después del procesamiento limpiando todas las superficies con etanol al 70%. El protocolo descrito está optimizado para diferenciaciones neuronales en una Incubadora y Biorreactor 3D CERO (en lo sucesivo denominado biorreactor de sobremesa). Este biorreactor de sobremesa ofrece cuatro ranuras para tubos de biorreactores especializados, cada uno con una capacidad máxima de 50 ml. La temperatura y los niveles deCO2 se controlan continuamente, y los parámetros de cultivo (por ejemplo, velocidad y tiempo de rotación) se regulan para cada tubo de forma independiente. Todos los pasos de aspiración se han realizado utilizando una pipeta de aspiración y una bomba de vacío, si no se indica lo contrario. 1. Cultivo y expansión de hiPSCs NOTA: En este protocolo se utiliza la línea NGN2 hiPSC bionª inducible por doxiciclina El protocolo de expansión proporcionado aquí está optimizado para placas de Petri de 6 cm, pero se pueden usar formatos de cultivo alternativos si se prefiere. Cubrir las placas de Petri de 6 cm con la matriz de la membrana basal diluida en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 (-/-) a una concentración final de 0,083 mg/ml/10 cm2. Incubar los platos recubiertos a 37 °C durante al menos 30 min.NOTA: Puede encontrar un protocolo detallado para la preparación de la solución de matriz de membrana basal en las instrucciones del fabricante. Las hiPSCs se pueden cultivar en matrices extracelulares alternativas para su expansión. Descongelar hiPSCs criopreservados según el EBiSC Cell line UserProtocol 21 en medio de mantenimiento iPSC sin alimentador + inhibidor ROCK de 10 μM (Y-27632). Se recomienda una densidad de siembra de 1 × 106 células viables por plato de 60 mm. Cambie el medio al día siguiente a un medio de mantenimiento iPSC sin alimentador sin inhibidor de ROCK, y realice cambios diarios de medios. Comience a pasar cuando los cultivos hiPSC alcancen una confluencia del 60%-80%. Verifique las áreas diferenciadas y limpie las colonias manualmente si el área supera el 5%.NOTA: Las hiPSC indiferenciadas aparecen como células redondas con un nucléolo prominente y menos citoplasma. Las colonias planas y apretadas se forman temprano después de la descongelación o el paso. En la Figura 1 se muestran imágenes ejemplares de campo claro de cultivos hiPSC. Se proporciona más información en el Protocolo de usuario de línea celular EBiSC21. Para el paso, prepare platos recubiertos con matriz de membrana basal y medio de mantenimiento iPSC sin alimentador. Aspirar el medio a partir de cultivos de hiPSC y enjuagar las células 2x con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 mM en 1x solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) sin Ca 2+ y Mg2+ (DPS [-/-], ver Tabla de materiales). Retire el sobrenadante y agregue 2 ml de EDTA de 0,5 mM en 1x DPBS (-/-) a las placas de Petri de 6 cm. Incubar las células a 37 °C durante 3 min en la incubadora. Aspirar 1,5 ml de la solución de EDTA y continuar la incubación durante 3-5 min. Golpee suavemente los platos para facilitar el desprendimiento de células.NOTA: Verifique el desprendimiento mediante evaluación visual. Las colonias de hiPSC deben comenzar a desprenderse después de 5 minutos, pero puede ser necesario un tiempo de incubación más largo con cultivos de hiPSC de mayor confluentidad. Si las colonias no se desprenden, aumente el tiempo de incubación hasta 10 minutos, pero no exceda este marco de tiempo. Añadir 5 ml de medio de mantenimiento iPSC sin alimentador a las placas de Petri de 6 cm y resuspender suavemente las colonias 2x con una pipeta serológica de 10 ml o utilizando puntas de pipeta de gran calibre. Transfiera las células a un tubo de 15 ml.NOTA: las hiPSC son altamente sensibles al estrés mecánico; Por lo tanto, se debe evitar la resuspensión múltiple. La suspensión celular final debe consistir en pequeños fragmentos de colonia (50-200 μm). Aspirar el sobrenadante de las placas de cultivo recubiertas y preparar 4 ml de medio de mantenimiento iPSC sin alimentador por plato de 6 cm. Transfiera pequeños fragmentos de colonia a los platos de cultivo recién preparados en proporciones divididas de 1:10 a 1:40, y cultive a 37 °C y 5% deCO2 con cambios diarios de medios.NOTA: Las colonias pequeñas deben adherirse dentro de 1 o 2 h después del paso. Figura 1: Morfología de cultivos de células madre pluripotentes inducidos por humanos . (A,B) Cultivos de hiPSC de buena calidad de diferentes confluencias que muestran colonias compactas de hiPSC con una morfología homogénea y aristas definidas. (C) cultivo de hiPSC con grupos emergentes de células diferenciadas alrededor de los bordes de la colonia (línea blanca discontinua). Barra de escala = 200 μm. Abreviatura: hiPSC = célula madre pluripotente inducida por humanos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 2. Precultivo de hiPSCs en el sistema de biorreactor de sobremesa (día-2) NOTA: Comience el precultivo cuando los cultivos hiPSC alcancen una confluencia entre 60% y 80%. Verifique las colonias de hiPSC para ver las áreas diferenciadas. Durante esta fase de precultivo, las hiPSC se mantienen en un medio de mantenimiento iPSC sin alimentador durante 2 días. Preparar el medio de cultivo, que consiste en medio de mantenimiento iPSC sin alimentador e inhibidor ROCK de 10 μM (Y-27632). Aspire el medio completamente de las hiPSC y enjuague suavemente las celdas con 1x DPBS (-/-) dos veces. Añadir 2,0 ml de solución de tripsina-EDTA precalentada a las placas de Petri de 6 cm e incubar las células durante 3 min a 37 °C en la incubadora. Golpee suavemente los platos para facilitar el desprendimiento de células, o incube durante 1-2 minutos más. Resuspender las células en 5 ml de medio de mantenimiento iPSC sin alimentador + inhibidor ROCK por placa. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml o 50 ml y mezcle suavemente pipeteando para garantizar la singularización celular. Determine el número de células en 100 μL de suspensión celular utilizando un contador de células automatizado como se describió anteriormente20. Transfiera el volumen correspondiente para 15 × 106 células por tubo de biorreactor a un tubo de 50 ml. Centrifugar las células a 300 × g durante 3 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 2 ml de medio de mantenimiento iPSC libre de alimentador + inhibidor de ROCK. Llene cada tubo de 50 ml con 18 ml de medio (densidad de siembra celular de 0,75 × 106 células/ml). Dispensar la suspensión celular en los tubos del biorreactor (20 ml por tubo). Coloque los tubos en el sistema del biorreactor. Establezca los siguientes parámetros de cultivo: período de rotación de 2 s, velocidad de rotación de 60 rpm, sin pausa de agitación, 37 °C y 5% deCO2 para una duración ilimitada20. Inicie el programa de cultivo a través de la pantalla del biorreactor. Cambie los medios al día siguiente. Deje que los agregados se asienten en los tubos del biorreactor durante ~ 5 min. Aspire cuidadosamente el sobrenadante.NOTA: No permita que los agregados se asienten durante más de 10 minutos, ya que podrían adherirse entre sí y crear una suspensión de agregados heterogéneos. Se recomienda dejar ~5 mL de medio de cultivo en el tubo del biorreactor. Añadir 15 ml de medio de mantenimiento iPSC fresco sin alimentador sin inhibidor de ROCK por tubo, y continuar el cultivo en el biorreactor de sobremesa durante 24 h. 3. Diferenciación de hiPSCs en neuronas tempranas (día 0) Preparar medio neurobasal (NBM): 50% DMEM/F-12 con L-alanil-L-glutamina dipéptido estabilizado, 50% medio neurobasal, 0.5x suplemento sin suero (50x), 0.5x suplemento sin suero basado en la formulación N-1 de Bottenstein (100x), 0.5x dipéptido estabilizado L-alanil-L-glutamina, solución de aminoácidos no esenciales 0.5x MEM (100x), piruvato de sodio 500 nM (100 mM), 50 nM 2-mercaptoetanol (50 mM), solución de insulina humana al 0.025% y 5 U/ml penicilina-estreptomicina.NOTA: NBM debe almacenarse a 4 °C y puede utilizarse hasta 2 semanas. Comience la diferenciación neuronal agregando doxiciclina (DOX) a los cultivos de hiPSC. Para esto, deje que los agregados se asienten en los tubos del biorreactor. Aspire cuidadosamente el sobrenadante de las células, dejando ~ 5 ml en el tubo, y agregue 35 ml de medio de inducción neural (NIM) que consiste en NBM y 2 μg / ml DOX.NOTA: Como DOX es sensible a la luz, se recomienda apagar la luz mientras trabaja. Coloque los tubos de nuevo en el biorreactor de sobremesa y continúe el cultivo. Realice cambios de medios todos los días durante 2 días, como se describe en el paso 3.2.NOTA: Después de 4 días en cultivo en suspensión, los agregados pueden disociarse y las neuronas tempranas pueden criopreservarse o replatearse directamente para la maduración terminal. 4. Criopreservación de neuronas tempranas (día 2) NOTA: La criopreservación no es necesaria y no es crítica para el proceso de diferenciación, pero es muy recomendable ya que se pueden producir y almacenar grandes reservas de neuronas tempranas para su posterior maduración y análisis. Deje que los agregados se asienten en el tubo del biorreactor. Aspire el sobrenadante como se describió anteriormente. Transfiera los agregados a un tubo estéril de 15 ml o 50 ml y enjuague suavemente los agregados 2x con 1x DPBS (-/-). Aspire cuidadosamente el sobrenadante tanto como sea posible sin alterar los agregados. Añadir 2-5 ml de enzima de disociación celular precalentada, dependiendo del tamaño del pellet, e incubar las células durante aproximadamente 10 min a 37 °C en un baño maría. Resuspender suavemente los agregados sedimentados cada 2 min hasta que los agregados se disocien.NOTA: Se debe obtener una suspensión celular casi homogénea después de 7-10 minutos de incubación. Agregue el triple volumen de medio NBM precalentado y resuspenda las células cuidadosamente para asegurar la singularización celular. Determine el número de células y transfiera el volumen correspondiente para la criopreservación a un tubo de 15 ml o 50 ml.NOTA: Se recomienda una densidad celular de 5-10 × 106 células/ml de medio de congelación. Centrifugar las células a 300 × g durante 3 min. Aspire el sobrenadante y resuspenda suavemente el pellet celular en el volumen correspondiente de medio de congelación que contenga 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Alícuota la suspensión celular en viales adecuados para la criopreservación (1 mL/vial). Transfiera los viales inmediatamente a un recipiente de congelación preenfriado de velocidad lenta lleno de 2-propanol y coloque el recipiente a -80 °C durante la noche. Colocar los viales a -150 °C al día siguiente para su almacenamiento a largo plazo.NOTA: El líquido 2-Propanol es altamente inflamable y puede causar daño ocular al contacto. Manténgase alejado del calor y use guantes protectores, así como gafas. 5. Maduración de neuronas derivadas de hiPSC en cultivos monocapa Preparar placas de cultivo recubiertas de poli-L-ornitina/laminina para el cultivo a largo plazo de neuronas derivadas de hiPSC.Diluir la solución madre de poli-L-ornitina al 0,001% en 1x DPBS (-/-) y cubrir los platos durante la noche a 4 °C, o durante 4 h a 37 °C. Aspire la solución de poli-L-ornitina y lave las placas una vez con 1x DPBS (-/-). Diluir la solución de laminina en 1x DPBS (-/-) hasta una concentración final de 10 μg/ml e incubar los platos durante la noche a 4 °C, o durante 4 h a 37 °C.NOTA: Se recomienda un volumen de 0.1-0.15 ml por cm 2 para los procedimientos de recubrimiento y 0.2 ml por cm2 para todos los pasos de lavado respectivos. Se pueden utilizar sustratos de recubrimiento alternativos, pero se deben evaluar los efectos potenciales sobre la unión celular y la maduración. Descongelar las células criopreservadas. Para ello, coloque el criovial en un baño maría (ajustado a 37 °C) y gírelo durante aproximadamente 1 min, hasta que quede un pequeño grupo de suspensión de células congeladas. Transfiera cuidadosamente la suspensión celular gota a gota a un tubo de 15 ml preparado con 10 ml de NBM precalentado. Enjuague el criovial con 1 ml de NBM y transfiera la suspensión celular al tubo idéntico de 15 ml. Centrifugar las células a 300 × g durante 3 min. Aspirar el sobrenadante y añadir 1-2 ml de NIM suplementado con 10 μM inhibidor de ROCK. Resuspenda el pellet celular con cuidado y determine el número de células. Aspirar la solución de laminina restante de las placas de cultivo celular recubiertas y sembrar las células a una densidad de siembra de 1 × 105 células/cm2 en NIM suplementado con un inhibidor ROCK de 10 μM. Cambie el medio después de 24 h a NIM sin inhibidor de ROCK. Realizar cambios medios diarios durante 4 días. Después de esta fase inicial de inducción de NGN2, omitir el DOX y cultivar las células en NBM, con cambios de medio 2x a la semana hasta alcanzar la etapa de maduración deseada.NOTA: Se recomienda el cocultivo de neuronas iNGN2 con astrocitos para aumentar la supervivencia celular, la unión, la madurez y la actividad eléctrica13,22. 6. Caracterización de neuronas derivadas de hiPSC NOTA: La diferenciación en derivados neuronales puede evaluarse mediante las siguientes técnicas. Inmunocitoquímica e imágenesAspirar el medio de las neuronas derivadas de hiPSC y lavar las células una vez con 1x DPBS con Ca 2+ y Mg2+ (+/+).NOTA: Pipetear cuidadosamente, preferentemente en los bordes del pozo, ya que las células pueden desprenderse muy fácilmente de la superficie. Se recomienda un volumen de 0,2 ml por cm2 para todos los pasos de lavado para garantizar una cobertura completa de las celdas con 1x DPBS (+/+). Fijar las células neuronales utilizando una solución de fijación que contenga paraformaldehído al 4% en DPBS (+/+) durante 15 min a temperatura ambiente (RT). Se recomienda un volumen de 0,1 mL porcm2 .NOTA: El paraformaldehído (4%) en DPBS es una solución peligrosa e irritante de la piel con toxicidad aguda y carcinogenicidad potencial. Manténgase alejado del calor, use guantes y anteojos protectores, evite la inhalación y use la solución solo en un ambiente ventilado. Enjuague suavemente las celdas 2 veces en 1x DPBS (+/+) y proceda con la tinción.NOTA: Las celdas fijas se pueden almacenar en DPBS (+/+) a 4 °C durante un máximo de 1 mes hasta su posterior procesamiento. Aspirar el DPBS (+/+) a partir de muestras. Permeabilizar las células y bloquear sitios de unión no específicos con 1x DPBS (+/+) que contiene 1% BSA y 0,2% Triton-X-100 durante 60 min en RT.NOTA: Se recomienda un volumen de 0,2 mL porcm2 . Retirar el sobrenadante e incubar las células durante la noche a 4 °C, con los respectivos anticuerpos primarios diluidos en tampón de tinción (1x DPBS [+/+] que contiene 1% de BSA) (ver Tabla de materiales). Asegúrese de que las células estén completamente cubiertas por la solución.NOTA: Se recomienda un volumen de 0.1-0.15 mL por cm2 . Aspire el tampón de tinción y enjuague las células 3 veces en 1x DPBS (+/+). Diluir los anticuerpos secundarios correspondientes (ver Tabla de materiales) en tampón de tinción a una concentración final de 1:1.000. Incubar las células en solución de anticuerpos diluidos durante 1 h a RT en la oscuridad. Asegúrese de que las células estén completamente cubiertas por la solución.NOTA: Se recomienda un volumen de 0.1-0.15 mL por cm2 . Aspirar la solución de anticuerpos secundarios y enjuagar las células 2x en 1x DPBS (+/+). Contrarrestar la tinción de los núcleos con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), diluido en DPBS (+/+) durante 5 min a RT.NOTA: Se recomienda un volumen de trabajo de 0.1-0.15 mL por cm2 . Enjuague las celdas 2 veces en 1x DPBS (+/+). Almacene las células en DPBS (+/+) a 4 °C hasta obtener imágenes.NOTA: Las imágenes de campo claro son adecuadas para rastrear los cambios morfológicos y el crecimiento de neuritas. Además, la expresión de marcadores estereotipados puede evaluarse mediante microscopía de fluorescencia. Mientras que las hiPSC indiferenciadas expresan OCT 3/4 y NANOG, la beta-III-tubulina (TUBB3) y la proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2) pueden servir como marcadores neuronales para visualizar neuritas y axones. La red neurítica se puede evaluar aún más determinando la longitud de la neurita en imágenes de campo claro o fluorescentes. Análisis de expresión génica mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR)Aspire el medio y enjuague las células una vez en 1x DPBS (-/-).NOTA: Se recomienda un volumen de 0,2 mL porcm2 . Agregue tampón de lisis de ARN frío y coseche las células rascando. Aísle el ARN utilizando un kit adecuado basado en columnas y determine las concentraciones de ARN mediante fotoespectrometría UV. Generar ADNc utilizando 250 ng de ARN total y un kit adecuado para la transcripción inversa. Preparar reacciones de qPCR de baliza molecular que contengan 2,5 ng de ADNc por duplicado. Utilice una mezcla maestra apropiada y los ensayos de imprimación correspondientes20 (consulte la Tabla de materiales). Ejecutar la qPCR aplicando 45 ciclos con recocido de imprimación a 60 °C durante 20 s. Normalizar los niveles relativos de expresión génica a la media de los genes de mantenimiento GAPDH, HPRT1 y GUSB. Aplicar el método ΔΔCt23, utilizando hiPSCs indiferenciadas como calibrador.

Representative Results

Durante los pasos iniciales, los cultivos adherentes de hiPSCs se separan, singularizan y transfieren a suspensión (Figura 2). Los agregados se forman en 24 h y crecen continuamente en tamaño. Después de 2 días de inducción transgénica, las neuronas tempranas pueden ser criopreservadas para experimentos posteriores. La proliferación persistente durante los primeros días en suspensión produce un aumento en el número de células, alcanzando su pico después de 2 días de inducción (Figura 3A, B). Junto con la proliferación, los agregados comienzan a crecer. En comparación con el día 0, el diámetro muestra un aumento del 50% en el día 2, y casi se duplica en el día 5 (Figura 3D). Aunque un diámetro creciente limita el suministro de nutrientes dentro de los agregados, la viabilidad de las células no se ve afectada en el día 2 o en el día 5 de diferenciación (Figura 3C). Sin embargo, un cultivo prolongado durante más de 4 días en suspensión no mejora aún más el rendimiento celular, ya que los agregados se vuelven cada vez más resistentes a la singularización enzimática (Figura 3B). Tras la criopreservación, las células del día 2 se descongelan y se colocan en platos recubiertos de poli-L-ornitina (PLO) laminina para su maduración terminal. En general, las células se adhieren muy bien después de la descongelación y comienzan a extender las neuritas desde el principio. El perfil de expresión génica temporal, así como la tinción inmunocitoquímica para los marcadores neuronales TUBB3 y MAP2, confirma la identidad celular neuronal (Figura 4A,B). Además del aumento de los niveles de TUBB3 y MAP2, los cultivos neuronales están enriquecidos en transcripciones de proteínas tau asociadas a microtúbulos (MAPT), que codifican una proteína neuronal implicada en la estabilización del axón, y muestran una disminución concomitante en la expresión del factor de transcripción regulador de la pluripotencia POU5F1. Además, se forma una densa red neurítica dentro de la primera semana después de la descongelación (Figura 4C). Estos cambios morfológicos, junto con el perfil transcripcional, sugieren una maduración creciente de los cultivos neuronales. Figura 2: Generación de neuronas iNGN2 derivadas de hiPSC utilizando un biorreactor de sobremesa. (A) Visión general esquemática del paradigma de diferenciación, destacando los pasos clave del cultivo celular. (B-F) Las imágenes de campo claro visualizan (B) hiPSCs y (C,D) la formación de agregados en el biorreactor de sobremesa. (E,F) Las neuronas iNGN2 extienden las neuritas y sufren cambios morfológicos durante la diferenciación. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: BMM = matriz de membrana basal; iPSC-MM = medio de mantenimiento iPSC; PLO = poli-L-ornitina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Rendimiento celular y viabilidad durante la formación y el crecimiento agregado. (A) Las imágenes de campo claro muestran la formación de agregados dentro de los 2 días posteriores al cultivo en el biorreactor de sobremesa, así como el aumento en el tamaño del agregado con el tiempo. Barra de escala = 500 μm. (B) Cuantificación del rendimiento celular y (C) viabilidad sobre el curso de diferenciación. Los gráficos de barras representan la media + SD de cuatro experimentos independientes. (D) El diámetro, indicativo del tamaño de los agregados, se determinó semiautomáticamente utilizando el software de código abierto ImageJ (versión 1.53). Primero, las imágenes de campo claro se convirtieron en imágenes binarias y luego se evaluaron más a fondo utilizando la herramienta analizar partículas, aplicando los siguientes parámetros: tamaño > 2.500 μm2, circularidad 0.45-1, excluir bordes e incluir agujeros. Las líneas horizontales indican la media ± DE de cinco diferenciaciones independientes. Los puntos individuales representan la media de los experimentos de diferenciación individuales con al menos 20 agregados por punto de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Caracterización de neuronas iNGN2 derivadas de hiPSC. Perfil de expresión génica temporal para los genes neuronales TUBB3, MAP2 y MAPT, así como el gen pluripotente asociado a células madre POU5F1. Los niveles de expresión relativos se normalizaron a los genes de referencia GAPDH, HPRT1 y GUSB. Se eligieron hiPSC indiferenciadas (día-2) como calibrador. Los símbolos geométricos indican la media ± SD de cuatro diferenciaciones independientes. (B) Imágenes representativas de neuronas iNGN2 en el día 7 después de la descongelación (día-2 + 7), teñidas para beta-III-tubulina (TUBB3, magenta) y proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2, cian). Los núcleos celulares fueron teñidos con DAPI. Barras de escala = 100 μm. (C) Evaluación de la red neurítica en imágenes de campo claro de cultivos neuronales después de la descongelación. La longitud total de las neuritas se determinó en un área de 930,82 × 698,11μm2 utilizando ImageJ (versión 1.53). Después de ajustar el brillo y el contraste, las imágenes se convirtieron en imágenes de 8 bits y los colores se invirtieron. Las neuritas fueron posteriormente esqueletizadas y luego analizadas usando los plugins de ImageJ ‘Skeletonize’ y ‘Analyze Skeleton’, respectivamente. La longitud total de las neuritas se dividió por el número de somas en la región de interés para obtener la longitud / célula promedio de neurita. Los gráficos de barras representan la media + SD de tres experimentos independientes. Abreviaturas: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Se ha demostrado previamente que la expresión ectópica del factor de transcripción neuronal NGN2 acelera las primeras etapas de la diferenciación neuronal e induce el compromiso del linaje neuronal en las hiPSCs dentro de 1 semana del cultivo12,13,20. Este trabajo describe un protocolo detallado para la diferenciación de hiPSC BIONi010-C-13 editadas genéticamente en neuronas iNGN2 utilizando un biorreactor de sobremesa.

El biorreactor CERO 3D es un biorreactor de bajo volumen con cuatro ranuras para tubos especializados, cada una con una capacidad máxima de 50 mL. La temperatura y los niveles deCO2 se controlan continuamente y los parámetros de cultivo (por ejemplo, velocidad y tiempo de rotación) se regulan para cada tubo, lo que permite a los usuarios ejecutar varios enfoques de diferenciación en paralelo. Los rompeondas integrados en la pared interior del tubo permiten una perturbación del medio con baja tensión de cizallamiento y mantienen los agregados 3D en suspensión durante la rotación controlada. El acceso limitado a los nutrientes, así como las interacciones 3D célula-célula y célula-matriz extracelular (ECM), pueden influir significativamente en la diferenciación y el comportamiento celular24,25,26,27.

El cultivo de células como agregados 3D en suspensión aumenta estas interacciones celulares, imitando así el entorno in vivo de tejidos u órganosmás estrechamente 28. La perturbación concomitante del medio regula el tamaño del agregado debido a la fricción mecánica, mejora el intercambio de gases y reduce el gradiente de nutrientes y desechos en el tubo, al tiempo que preserva los gradientes fisiológicos relevantes dentro de los agregados 29,30,31,32,33,34 . Aunque los cambios de medio se realizan manualmente, el biorreactor de sobremesa reduce los costos de mano de obra y operación en comparación con los matraces de cultivo estáticos. El biorreactor también ofrece varias ventajas sobre los biorreactores de tanque de agitación totalmente automatizados, ya que el diseño libre de impulsor reduce el esfuerzo cortante hidrodinámico en la superficie del agregado, lo que no solo mejora la supervivencia celular, sino que también limita los efectos del esfuerzo cortante en iPSC sensibles, diferenciación celular y función35,36,37,38.

Los biorreactores de rueda vertical, en los que las células son agitadas por un gran impulsor vertical, así como los biorreactores de movimiento oscilante que utilizan bolsas de cultivo infladas unidas a una plataforma motorizada, representan plataformas de suspensión 3D alternativas. Aunque excesivamente probados para el cultivo de hiPSCs 17,18,19,39,40, se sabe poco sobre su aplicabilidad en enfoques de diferenciación neuronal, y los informes se limitan a la expansión exitosa de células precursoras neurales de mamíferos y humanos en biorreactores de tanque agitado41,42,43,44, con un número raro de estudios centrados en Maduración44,45. En general, las plataformas de suspensión 3D automatizadas ofrecen la ventaja de cambios de medio totalmente automatizados y controlados por computadora, lo que reduce las variaciones en el manejo y minimiza el riesgo de contaminación. Además, los parámetros de nutrientes como el lactato y la concentración de glucosa se pueden controlar continuamente. Sin embargo, el establecimiento de estos sistemas a menudo requiere una inversión inicial significativa, espacio de laboratorio y la capacitación de personal calificado. El biorreactor de sobremesa representa una alternativa compacta y fácil de usar para el cultivo de células en suspensión, pero no proporciona un monitoreo concurrente de nutrientes.

Como en la mayoría de los protocolos utilizados para el cultivo de células en plataformas de suspensión 3D, la formación inicial de agregados representa un paso crítico. Las hiPSC se cultivan como monocapas adherentes y posteriormente se transfieren como suspensiones unicelulares a un entorno 3D. Para minimizar la pérdida de células en esa etapa, se deben considerar varios aspectos. El diseño de los tubos con los rompeondas integrados significa que se requiere un volumen de cultivo mínimo de 10 ml por tubo para garantizar una perturbación óptima del medio. Por lo tanto, el volumen crítico no debe reducirse a largo plazo. Además, se recomienda encarecidamente una densidad de siembra inicial de 7,5 millones de células por 10 ml de volumen de cultivo, y una velocidad de rotación de 60 rpm, para formar agregados estables a corto plazo, aunque las adaptaciones pueden ser necesarias dependiendo de la línea celular.

Después de transferir las hiPSC a la suspensión, los agregados deben formarse dentro de las 24 h. El primer cambio medio es crítico, ya que los agregados son pequeños y pueden no establecerse correctamente. El tiempo para la sedimentación de los agregados puede extenderse, pero no debe exceder más de 10 minutos, ya que los agregados pueden comenzar a agruparse y crecer de manera heterogénea. Durante la aspiración, se debe dejar un volumen mínimo de cultivo de 5 ml en el tubo y se debe evitar cualquier perturbación del medio. Sin embargo, es de esperar una pérdida de células y agregados durante las fases iniciales. Los recuentos celulares indican un rendimiento celular constante durante los primeros 2 días en cultivo, lo que indica que la alta capacidad proliferativa de las hiPSC compensa la pérdida celular inicial. Una vez en suspensión, el cultivo suave y la perturbación conducen a agregados de tamaño homogéneo que comienzan a crecer con el tiempo.

La diferenciación neuronal se realizó de acuerdo con un protocolo previamente publicado basado en la sobreexpresión de NGN2 inducida por doxiciclina13, y los pasos individuales se optimizaron para un cultivo 3D. El factor de transcripción neuronal NGN2 es un conductor bien descrito en la diferenciación neuronal y acelera significativamente la inducción neuronal11,13,46. Mientras que el patrón convencional con factores de crecimiento definidos tarda de varias semanas a meses 7,8,9, la expresión de NGN2 induce el destino de las células neuronales en cuestión de días. Además del tiempo de cultivo más corto, el protocolo no depende de factores de crecimiento costosos ni de matrices de recubrimiento para el cultivo de suspensión inicial, lo que reduce los costos de cultivo adicionalmente.

Además, una comparación directa de la generación impulsada por NGN2 de neuronas inmaduras en cultivos adherentes y en suspensión reveló un aumento de 1,36 veces en las células después de 4 días en cultivo utilizando el biorreactor de sobremesa20, mientras que se espera que el volumen de medio requerido para la generación de 1 millón de células se reduzca a la mitad. Por lo tanto, el empleo del biorreactor de sobremesa para la generación de neuronas iNGN2 puede ser beneficioso, ya que se puede producir un mayor número de células con un menor tiempo y costo de manipulación. En línea con informes anteriores, el compromiso del linaje neuronal se observó desde el principio. Después de 2 días de inducción de NGN2, se evidenció una expresión profunda de marcadores neuronales clásicos como TUBB3, MAP2 y MAPT, lo que respalda la aplicabilidad del biorreactor de sobremesa para la inducción neuronal. Siguiendo este protocolo, se pueden obtener aproximadamente 6,2 millones de neuronas iNGN2 inmaduras de 1 millón de hiPSCs dentro de los 4 días posteriores al cultivo. Sin embargo, la capacidad de salida puede variar entre lotes y depender del volumen de cultivo en suspensión en la siembra.

Para aumentar aún más el rendimiento, el tiempo de cultivo se extendió por 3 días adicionales; Sin embargo, aunque los agregados se hicieron más grandes, también se volvieron altamente compactos y no pudieron disociarse adecuadamente para la criopreservación o el rechapado. A pesar de los avances en los enfoques de cultivo 3D, los cultivos neuronales 2D adherentes siguen siendo el estándar de oro para análisis funcionales como matrices de microelectrodos o imágenes de calcio. La singularización celular es, por lo tanto, un requisito previo importante para una monocapa neuronal distribuida homogéneamente y una red neurítica. Se puede utilizar un desprendimiento mecánico más fuerte de las células o reactivos de disociación ásperos para asegurar la singularización, pero con efectos potenciales sobre la viabilidad celular, la fisiología y la capacidad de re-unión47,48. Con respecto a la necesidad de células individuales para análisis y maduración adicionales, los agregados se disociaron después de 4 días en suspensión, y las neuronas iNGN2 (día 2) se criopreservaron. La diferenciación post-descongelación y caracterización de las neuronas iNGN2 confirmó una madurez creciente de los cultivos neuronales y la formación de una red neurítica densa.

El protocolo proporcionado produce un alto número de neuronas iNGN2. Sin embargo, es necesario considerar varias limitaciones. Al igual que para la mayoría de las plataformas de cultivo en suspensión, la transferencia de hiPSCs de un cultivo adherente 2D a un entorno 3D es crítica y a menudo se asocia con una pérdida celular profunda. Se espera una pérdida adicional significativa de células y agregados durante los cambios en los medios. En comparación con las plataformas automatizadas, el tiempo de manipulación y el riesgo de contaminación utilizando el biorreactor de sobremesa aumentan, ya que los cambios de medio deben realizarse manualmente. Aparte de la falta de automatización, el biorreactor de sobremesa no ofrece la posibilidad de monitorear los nutrientes, y la capacidad máxima de 50 ml por tubo limita el potencial de ampliación del protocolo. Finalmente, es importante señalar que, aunque NGN2 acelera el compromiso del linaje neuronal, la duración de la maduración terminal no se acorta y aún requiere un cultivo a largo plazo durante varias semanas. Dada la importancia del apoyo astrocítico para la función neuronal, el apego y la supervivencia 49,50,51, se deben considerar los enfoques de cocultivo, que incluso pueden ser esenciales para el cultivo a largo plazo.

En resumen, un protocolo de diferenciación 2D se tradujo con éxito a un entorno 3D para la generación rápida y reproducible de neuronas iNGN2 mediante la implementación de un biorreactor de sobremesa. El protocolo descrito produce altas cantidades de neuronas derivadas de iPSC de buena calidad, que pueden servir como punto de partida para pruebas de modelos complejos, exámenes de drogas de alto rendimiento y ensayos de toxicidad a gran escala.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El proyecto EBiSC2 ha recibido financiación de la Empresa Común (JU) de la Iniciativa sobre Medicamentos Innovadores 2 en virtud del acuerdo de subvención nº 821362. La Empresa Conjunta recibe apoyo del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea y de la EFPIA. Agradecemos a Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters y Vanessa M. Nalewaja por su ayuda en los análisis inmunocitoquímicos y de expresión génica, así como a Heike Arthen por su excelente apoyo técnico. Además, agradecemos a Stephanie Bur por el establecimiento del programa de biorreactores. La figura 2A se creó con BioRender.com.

Materials

2-Mercaptoethanol 50 mM Gibco  11528926
60 mm Nunclon Delta Surface Nunc 734-2040
Anti-beta III Tubulin antibody [TU-20] (dilution 1:1,000) Abcam   ab7751 
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific   10400745
B-27 Supplement (50x)  Gibco 11530536 serum-free Supplement (50x)
BIONi010-C-13 hiPSC line European Bank for induced pluripotent Stem Cell (EBiSC), BIONEER as Depositor SAMEA103988285 Bioneer is depositor in EBiSC and owner of the hiPSC line.
Biorender  Biorender.com
BSA Cell Culture grade Thermo Fisher Scientific   12330023
CERO 3D Incubator & Bioreactor OLS OMNI Life Science 2800000
CEROtubes Cell culture Tubes 50 mL OLS OMNI Life Science 2800005
Citavi 6 Swiss Academic Software
CryoStor CS10 Stemcell 7930 freezing medium containing 10% DMSO
Cytofix Fixation Solution BD Biosciences  554655 fixation solution containing 4% paraformaldehyde 
DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN)  Thermo Fisher Scientific   12333553
Doxycycline hydrochloride (DOX) Sigma-Aldrich D3447
DPBS without Calcium and Magnesium (DPBS -/-)  Gibco 14190250
DPBS with Calcium and Magnesium (DPBS +/+)  Gibco 11580456
DMEM/F12 (-/-) Gibco 21331-020
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement Gibco 31331-028
EVOS XL Core Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific   A21424
GlutaMAX supplement  Gibco  35050-038 stabilized L-alanyl-L-glutamine dipeptid
ImageJ 1.51v  National Institute of Health
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278l
Laminin Merck L2020
MACSQuant Analyzer Miltenyi
MAP2 Monoclonal Antibody (dilution 1: 300) Thermo Fisher Scientific   13-1500 
Matrigel Growth factor reduced, phenol-red free  Corning Life Science  356231 basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Gibco  11140035
MicroAmp Optical Adhesive Film Kit  Thermo Fisher Scientific   10095714
mTeSR1 Stemcell 85850 feeder-free iPSC maintenance medium 
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502-048 serum-free Supplement based on Bottenstein’s N-1 formulation
Neurobasal Medium Gibco 11570556
Nikon Eclipse TS2 Nikon Instruments Europe B.V.
NucleoCounter-NC200 ChemoMetec A/S
Origin 2021 OriginLab
Penicillin-Streptomycin Gibco 11548876
Perm/Wash Buffer  BD Biosciences  554723
Primer assay TUBB3(Hs00801390_s1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay GAPDH (Hs99999905_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay GUSB (Hs99999908_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay HPRT1 (Hs99999909_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay MAP2 (Hs00258900_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay MAPT (Hs00902194_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay POU5F1 (Hs04260367_gH) Thermo Fisher Scientific 11620099
Poly-L-ornithine 0.01% Merck P4957
RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit Qiagen 74034 column-based RNA isolation kit
RLT Buffer Qiagen 79216 cell lysis buffer
Sodium Pyruvat (100 mM) Gibco 12539059
StemPro Accutase Gibco 11599686 cell dissociation enzyme
TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX Thermo Fisher Scientific   11380912 qPCR master mix
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
TrypLE Select Enzym Gibco 12563-011 Trypsin-EDTA solution
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G
Via1-Cassette ChemoMetec A/S 941-0012
Wide Bore Filtered Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 10088880
X20 OPTICAL 96WELL FAST CLEAR REACTION PLATES  Thermo Fisher Scientific 15206343
Y-27632 dihydrochloride, Rho kinase inhibitor (ROCK inhibitor) Abcam ab120129
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Wihan, J., Karnatz, I., Sébastien, I., Kettenhofen, R., Schmid, B., Clausen, C., Fischer, B., Steeg, R., Zimmermann, H., Neubauer, J. C. Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor. J. Vis. Exp. (193), e65085, doi:10.3791/65085 (2023).
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