JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Производство нейрогенин-2-индуцируемых нейронов человека в трехмерном суспензионном биореакторе

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/65085
, , , , , , , , ,
1Fraunhofer Project Center for Stem Cell Process Engineering,Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering IBMT, 2Bioneer A/S, 3Fraunhofer UK Research Ltd, Technology and Innovation Centre, 4Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering IBMT, 5Department of Molecular and Cellular Biotechnology,Saarland University, 6Facultad de Ciencias del Mar,Universidad Católica del Norte

Summary

В этой статье описывается протокол генерации индуцированных плюрипотентных нейронов, полученных из стволовых клеток человека, в настольном 3D-суспензионном биореакторе.

Abstract

Получение клеток нейронной линии из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) стало важной вехой в исследованиях мозга. С момента своего первого появления протоколы постоянно оптимизировались и в настоящее время широко используются в исследованиях и разработке лекарств. Однако очень длительный срок действия этих традиционных протоколов дифференциации и созревания, а также растущий спрос на высококачественные ИПСК и их нейронные производные повышают потребность в принятии, оптимизации и стандартизации этих протоколов для крупномасштабного производства. В этой работе представлен быстрый и эффективный протокол дифференцировки генетически модифицированных, индуцируемых доксициклином нейрогенина 2 (iNGN2)-экспрессирующих ИПСК в нейроны с использованием настольного трехмерного (3D) суспензионного биореактора.

Короче говоря, одноклеточные суспензии iNGN2-hiPSC могли образовывать агрегаты в течение 24 часов, а приверженность нейрональной линии была индуцирована добавлением доксициклина. Агрегаты диссоциировали после 2 дней индукции, и клетки были либо криоконсервированы, либо перепокрыты для терминального созревания. Сгенерированные нейроны iNGN2 экспрессировали классические нейрональные маркеры на ранней стадии и образовывали сложные нейритические сети в течение 1 недели после повторного покрытия, что указывает на растущую зрелость нейрональных культур. Таким образом, представлен подробный пошаговый протокол для быстрой генерации нейронов, полученных из hiPSC, в 3D-среде, который обладает большим потенциалом в качестве отправной точки для моделирования заболеваний, фенотипического скрининга высокопроизводительных лекарств и крупномасштабного тестирования токсичности.

Introduction

Неврологические расстройства являются основной причиной инвалидности во всем мире1. Каждый шестой человек страдает, и заболеваемость продолжает расти. Связанное с этим финансовое бремя для общества и его систем здравоохранения огромно. По оценкам 30 европейских стран в 2010 г., ежегодные расходы, связанные с психическими и неврологическими расстройствами, составили 800 млрд. евро2. Растущее социально-экономическое бремя требует эффективных стратегий лечения, и хотя наше понимание патофизиологии заболеваний значительно возросло, перевод в клиники часто недостаточен. В целом, только 12% фармацевтических препаратов вступают в клинические испытания, из которых более 80% терпят неудачу на более поздних стадиях, в основном из-за неэффективности или непредвиденной токсичности 3,4. Причины разнообразны, но ограниченная переносимость испытаний на животных на доклинических стадиях к испытаниям на людях все чаще выходит на первый план5. Человеческие модели клеток и тканей in vitro могут преодолеть разрыв в межвидовой трансляции, и достижения в технологии плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC), индуцированных человеком, обладают большим потенциалом в этом отношении. ИПСК широко используются в фундаментальных исследованиях и имеют общие основные характеристики с эмбриональными стволовыми клетками (hESCs), такие как почти неограниченная способность к самообновлению и способность дифференцироваться во все три зародышевых слоя6, обходя при этом этические проблемы, связанные с разрушением эмбрионов.

Получение нейрональных клеток из hESCs, а затем и hiPSCs, ознаменовало собой веху в исследованиях мозга. Первоначальные протоколы дифференцировки были основаны на применении факторов роста, имитирующих критические этапы эмбриогенеза, большинство из которых включали двойное ингибирование SMAD либо в суспензии, либо в адгезивных культурах 7,8,9. Зрелые нейроны были успешно сгенерированы, но несколько недостатков этих протоколов по-прежнему препятствуют их широкому использованию в разработке лекарств, таких как низкий выход и высокая вариабельность генерируемых нейронов от партии к партии, а также обширная рабочая нагрузка, связанная с длительным временем культивирования. Улучшения были достигнуты за счет форсированной экспрессии транскрипционных факторов, критически участвующих в нейрогенезе, и члены семейства нейрогенинов (NGN), в частности NGN2, были идентифицированы как эффективные драйверы10. Лентивирально-опосредованная эктопическая экспрессия NGN2 в ИПСК значительно ускорила ранние стадии дифференцировки нейронов и индуцировала судьбу нейрональных клеток всего за 1 неделю11. Последующее терминальное созревание в кокультурах с астроцитами дало функциональные нейроны высокой чистоты и количества с воспроизводимыми свойствами. Затем было применено сайт-направленное редактирование генов локуса безопасной гавани сайта интеграции аденоассоциированного вируса 1 (AAVS1) для создания линий hiPSC со стабильной и индуцируемой доксициклином кассетой экспрессии для NGN212,13, что сводило к минимуму нежелательные побочные эффекты лентивирусной доставки.

Надежная и эффективная дифференцировка доксициклин-индуцируемых нейронов нейрогенина 2 (iNGN2) обладает большим потенциалом для высокопроизводительных фенотипических скринингов лекарств и анализов токсичности10,14,15; и за последнее десятилетие был достигнут существенный прогресс в биообработке, внедрив биореакторы для масштабируемой экспансии и дифференцировки клеток16,17,18,19. Тем не менее, большинство протоколов дифференциации оптимизированы для приверженных культур, и перевод в трехмерную (3D) среду часто требует существенных модификаций. Недавно сообщалось об успешном использовании настольного 3D-биореактора с уменьшенными характеристиками напряжения сдвига для расширения ИПСК и воспроизводимой дифференцировки в гепатоциты, кардиомиоциты и нейроны20. Здесь представлен подробный протокол генерации и характеристики нейронов iNGN2 с использованием идентичного настольного 3D-биореактора.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все манипуляции с клетками, а также с чашками для культивирования и средними препаратами должны выполняться в стерильных условиях. Вытяжку с ламинарным потоком следует тщательно очистить перед использованием и после обработки, протерев все поверхности 70% этанолом. Описанный протокол оптимизирован для дифференцировки нейронов в 3D-инкубаторе и биореакторе CERO (далее именуемом настольным биореактором). Этот настольный биореактор имеет четыре слота для специализированных трубок биореактора, каждая из которых имеет максимальную емкость 50 мл. Температура и уровень CO2 постоянно контролируются, а параметры культивирования (например, скорость вращения и время) регулируются для каждой трубы независимо. Все этапы аспирации были выполнены с помощью аспирационной пипетки и вакуумного насоса, если не указано иное. 1. Культивирование и экспансия ИПСК ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется инженерная доксициклин-индуцируемая линия NGN2 hiPSC BIONi010-C-13. Представленный здесь протокол расширения оптимизирован для 6-сантиметровых чашек Петри, но при желании можно использовать альтернативные форматы культивирования. Покрыть 6-сантиметровые чашки Петри матрицей базальной мембраны, разбавленной в холодной модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM)/F12 (-/-) в конечной концентрации 0,083 мг/мл/10см2. Инкубировать покрытую глазурью посуду при 37 °C не менее 30 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный протокол приготовления матричного раствора базальной мембраны можно найти в инструкциях производителя. ИПСК можно культивировать на альтернативных внеклеточных матрицах для расширения. Размораживание криоконсервированных ИПСК в соответствии с протоколомпользователя клеточной линии EBiSC 21 в поддерживающей среде iPSC без фидера + ингибитор ROCK 10 мкМ (Y-27632). Рекомендуется плотность посева 1 × 106 жизнеспособных ячеек на 60-миллиметровую посуду. На следующий день замените среду на поддерживающую среду без питателя iPSC без ингибитора ROCK и выполняйте ежедневную смену среды. Начинайте пассаж, когда культуры hiPSC достигают слияния 60-80%. Проверьте наличие дифференцированных участков и очистите колонии вручную, если площадь превышает 5%.ПРИМЕЧАНИЕ: Недифференцированные ИПСК выглядят как круглые клетки с заметным ядрышком и меньшим количеством цитоплазмы. Плоские и плотно упакованные колонии образуются рано после оттаивания или пассажа. Примерные изображения культур hiPSC в светлом поле показаны на рисунке 1. Дополнительная информация представлена в Пользовательском протоколе линии сотовой связи EBiSC21. Для пассажа подготовьте посуду с матричным покрытием из базальной мембраны и среду для обслуживания iPSC без питателя. Аспирируйте среду из культур hiPSC и промойте клетки 2 раза этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) 0,5 мМ в 1x фосфатном буферном физиологическом растворе Дульбекко (DPBS) без Ca 2+ и Mg2+ (DPS [-/-], см. Таблицу материалов). Удалите надосадочную жидкость и добавьте 2 мл 0,5 мМ ЭДТА в 1x DPBS (-/-) в 6-сантиметровые чашки Петри. Инкубируют клетки при 37 °C в течение 3 мин в инкубаторе. Аспирировать 1,5 мл раствора ЭДТА и продолжать инкубацию в течение 3-5 мин. Аккуратно постучите по посуде, чтобы облегчить отсоединение клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте отслоение визуальной оценкой. Колонии hiPSC должны начать отделяться через 5 минут, но может потребоваться более длительное время инкубации с более высокими сливающимися культурами hiPSC. Если колонии не отделяются, увеличьте время инкубации до 10 мин, но не превышайте эти временные рамки. Добавьте 5 мл поддерживающей среды iPSC без кормушки в 6-сантиметровые чашки Петри и осторожно ресуспендируйте колонии 2 раза серологической пипеткой объемом 10 мл или с помощью широкопроходных наконечников пипеток. Перенесите клетки в пробирку объемом 15 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: ИПСК очень чувствительны к механическим воздействиям; Таким образом, следует избегать многократной переподвешивания. Конечная клеточная суспензия должна состоять из небольших фрагментов колонии (50-200 мкм). Отдохните надосадочную жидкость из посуды для культур с покрытием и приготовьте 4 мл поддерживающей среды iPSC без кормушки на 6-сантиметровую чашку. Перенесите небольшие фрагменты колоний в свежеприготовленные посуды для культур в соотношении от 1:10 до 1:40 и культивируйте при 37 ° C и 5% CO2 с ежедневной сменой среды.ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие колонии должны прикрепляться в течение 1 или 2 часов после прохождения. Рисунок 1: Морфология индуцированных плюрипотентных культур стволовых клеток человека . (А, Б) Высококачественные культуры hiPSC разного слияния, демонстрирующие уплотненные колонии hiPSC с однородной морфологией и очерченными краями. (C) культура hiPSC с возникающими кластерами дифференцированных клеток по краям колонии (пунктирная белая линия). Масштабная линейка = 200 мкм. Аббревиатура: hiPSC = индуцированная плюрипотентная стволовая клетка человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 2. Предварительное культивирование ИПСК в настольной биореакторной системе (день-2) ПРИМЕЧАНИЕ: Приступайте к предварительному культивированию, когда культуры hiPSC достигают слияния между 60% и 80%. Проверьте колонии hiPSC на наличие дифференцированных областей. Во время этой фазы предварительного культивирования ИПСК выдерживают в среде для поддержания ИПСК без кормушки в течение 2 дней. Подготовьте питательную среду, состоящую из поддерживающей среды iPSC, не содержащей питателя, и ингибитора ROCK 10 мкМ (Y-27632). Полностью аспирируйте среду из ИПСК и осторожно промойте клетки 1x DPBS (-/-) дважды. Добавьте 2,0 мл предварительно подогретого раствора трипсина-ЭДТА в чашки Петри диаметром 6 см и инкубируйте клетки в течение 3 мин при 37 ° C в инкубаторе. Аккуратно постучите по посуде, чтобы облегчить отслоение клеток, или инкубируйте еще 1-2 минуты. Ресуспендируйте клетки в 5 мл поддерживающей среды iPSC без фидера + ингибитор ROCK на чашку. Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл или 50 мл и аккуратно перемешайте пипеткой, чтобы обеспечить сингуляризацию клеток. Определите количество клеток в 100 мкл клеточной суспензии с помощью автоматического счетчика клеток, как описано ранее20. Перенесите соответствующий объем для 15 × 106 клеток на пробирку биореактора в пробирку объемом 50 мл. Центрифугируют клетки при концентрации 300 × г в течение 3 мин. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в 2 мл поддерживающей среды iPSC без фидера + ингибитор ROCK. Заполните каждую пробирку объемом 50 мл 18 мл среды (плотность посева клеток 0,75 ×10,6 клеток/мл). Распределите клеточную суспензию в пробирки биореактора (20 мл на пробирку). Поместите трубки в систему биореактора. Установите следующие параметры обработки: период вращения 2 с, скорость вращения 60 об/мин, отсутствие паузы в перемешивании, 37 °C и 5% CO2 на неограниченную продолжительность20. Запустите программу выращивания через дисплей биореактора. Смените носитель на следующий день. Дайте заполнителям осесть в трубах биореактора в течение ~5 минут. Тщательно аспирируйте надосадочную жидкость.ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте заполнителям оседать дольше 10 минут, так как они могут прилипнуть друг к другу и образовать гетерогенную суспензию заполнителя. Рекомендуется оставить ~5 мл питательной среды в пробирке биореактора. Добавьте 15 мл свежей поддерживающей среды iPSC без кормушки без ингибитора ROCK на пробирку и продолжайте культивирование в настольном биореакторе в течение 24 часов. 3. Дифференцировка ИПСК в ранние нейроны (день 0) Подготовьте нейробазальную среду (NBM): 50% DMEM/F-12 со стабилизированным дипептидом L-аланил-L-глутамина, 50% нейробазальной средой, 0,5x добавкой без сыворотки (50x), 0,5x добавкой без сыворотки на основе препарата N-1 Боттенштейна (100x), 0,5x стабилизированным L-аланил-L-дипептидом глутамина, 0,5x раствором заменимых аминокислот MEM (100x), 500 нМ пирувата натрия (100 мМ), 50 нМ 2-меркаптоэтанолом (50 мМ), 0,025% раствором человеческого инсулина и 5 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина.ПРИМЕЧАНИЕ: NBM должен храниться при температуре 4 °C и может использоваться до 2 недель. Начните дифференцировку нейронов, добавив доксициклин (DOX) к культурам hiPSC. Для этого дайте агрегатам осесть в трубах биореактора. Тщательно аспирируйте надосадочную жидкость из клеток, оставляя ~ 5 мл в пробирке, и добавьте 35 мл среды нейронной индукции (NIM), состоящей из NBM и 2 мкг / мл DOX.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку DOX чувствителен к свету, рекомендуется выключать свет во время работы. Поместите трубки обратно в настольный биореактор и продолжайте выращивание. Выполняйте смену носителя каждый день в течение 2 дней, как описано в шаге 3.2.ПРИМЕЧАНИЕ: После 4 дней в культуре суспензии агрегаты могут быть диссоциированы, а ранние нейроны криоконсервированы или непосредственно перепокрыты для терминального созревания. 4. Криоконсервация ранних нейронов (день 2) ПРИМЕЧАНИЕ: Криоконсервация не требуется и не имеет критического значения для процесса дифференцировки, но настоятельно рекомендуется, так как большие запасы ранних нейронов могут быть получены и сохранены для последующего созревания и анализа. Дайте агрегатам осесть в трубе биореактора. Аспирируйте надосадочную жидкость, как описано ранее. Переложите агрегаты в стерильную пробирку объемом 15 мл или 50 мл и осторожно промойте агрегаты 2 раза с помощью 1x DPBS (-/-). Максимально тщательно аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая агрегаты. Добавьте 2-5 мл предварительно подогретого фермента диссоциации клеток, в зависимости от размера гранул, и инкубируйте клетки в течение примерно 10 минут при 37 ° C на водяной бане. Осторожно ресуспендируйте осажденные заполнители каждые 2 минуты, пока заполнители не диссоциируют.ПРИМЕЧАНИЕ: Почти однородная клеточная суспензия должна быть получена после 7-10 мин инкубации. Добавьте тройной объем предварительно нагретой среды NBM и осторожно ресуспендируйте ячейки, чтобы обеспечить сингуляризацию клеток. Определите номера клеток и перенесите соответствующий объем для криоконсервации в пробирку объемом 15 мл или 50 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется плотность клеток 5-10 × 106 клеток / мл замораживающей среды. Центрифугируют клетки при 300 × г в течение 3 мин. Аспирируют надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируют клеточную гранулу в соответствующем объеме замораживающей среды, содержащей 10% диметилсульфоксида (ДМСО). Аликвотируйте клеточную суспензию в подходящие флаконы для криоконсервации (1 мл/флакон). Немедленно переложите флаконы в предварительно охлажденный контейнер для медленного замораживания, заполненный 2-пропанолом, и поместите контейнер при температуре -80 ° C на ночь. Поместите флаконы при температуре -150 °C на следующий день для длительного хранения.ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкий 2-пропанол легко воспламеняется и может вызвать повреждение глаз при контакте. Беречь от источников тепла и надевать защитные перчатки и очки. 5. Созревание нейронов, полученных из hiPSC, в монослойных культурах Приготовьте культуральные чашки, покрытые поли-L-орнитином/ламинином, для долгосрочного культивирования нейронов, полученных из hiPSC.Разбавьте исходный раствор поли-L-орнитина до 0,001% в 1x DPBS (-/-) и покройте посуду на ночь при 4 ° C или в течение 4 ч при 37 ° C. Аспирируйте раствор поли-L-орнитина и один раз промойте пластины 1x DPBS (-/-). Разбавьте раствор ламинина в 1x DPBS (-/-) до конечной концентрации 10 мкг/мл и инкубируйте посуду в течение ночи при 4 °C или в течение 4 ч при 37 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Объем 0,1-0,15 мл на см 2 рекомендуется для процедур нанесения покрытия и 0,2 мл на см2 для всех соответствующих этапов стирки. Можно использовать альтернативные подложки для покрытия, но необходимо оценить потенциальное влияние на прикрепление и созревание клеток. Разморозьте криоконсервированные клетки. Для этого поместите криовиал на водяную баню (установите на 37 ° C) и взбалтывайте его в течение примерно 1 минуты, пока не останется небольшой комок замороженной клеточной суспензии. Осторожно перенесите клеточную суспензию по каплям в пробирку объемом 15 мл, приготовленную из 10 мл предварительно подогретого NBM. Промойте криовиал 1 мл NBM и перенесите клеточную суспензию в идентичную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируют клетки при 300 × г в течение 3 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и добавьте 1-2 мл NIM с добавлением 10 мкМ ингибитора ROCK. Осторожно ресуспендируйте гранулу ячейки и определите номера ячеек. Аспирируйте оставшийся раствор ламинина из посуды для культивирования клеток, покрытых оболочкой, и засейте клетки с плотностью высева 1 × 10,5 клеток/см2 в NIM с добавлением 10 мкМ ингибитора ROCK. Через 24 ч переключите среду на NIM без ингибитора ROCK. Выполняйте ежедневные средние смены в течение 4 дней. После этой начальной фазы индукции NGN2 исключите DOX и культивируйте клетки в NBM, с половинной сменой среды 2 раза в неделю до достижения желаемой стадии созревания.ПРИМЕЧАНИЕ: Совместное культивирование нейронов iNGN2 с астроцитами рекомендуется для повышения выживаемости, прикрепления, зрелости и электрической активности клеток13,22. 6. Характеристика нейронов, полученных из hiPSC ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференцировка в производные нейронов может быть оценена следующими методами. Иммуноцитохимия и визуализацияАспирируйте среду из нейронов, полученных из hiPSC, и промойте клетки один раз с помощью 1x DPBS с Ca 2+ и Mg2+ (+/+).ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетка наносите осторожно, преимущественно на края скважины, так как клетки могут очень легко отсоединиться от поверхности. Объем 0,2 мл насм2 рекомендуется для всех этапов промывки, чтобы обеспечить полное покрытие клеток 1x DPBS (+/+). Фиксируют нейрональные клетки с помощью фиксирующего раствора, содержащего 4% параформальдегида в DPBS (+/+) в течение 15 мин при комнатной температуре (RT). Рекомендуется объем 0,1 мл насм2 .ПРИМЕЧАНИЕ: Параформальдегид (4%) в DPBS представляет собой опасный и раздражающий кожу раствор с острой токсичностью и потенциальной канцерогенностью. Беречь от источников тепла, надевать защитные перчатки и очки, избегать вдыхания и использовать раствор только в проветриваемом помещении. Аккуратно промойте ячейки 2x в 1x DPBS (+/+) и приступайте к окрашиванию.ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированные ячейки можно хранить в DPBS (+/+) при 4 °C до 1 месяца до дальнейшей обработки. Аспирируйте DPBS (+/+) из образцов. Проникайте в клетки и блокируйте неспецифические сайты связывания с помощью 1x DPBS (+/+), содержащего 1% BSA и 0,2% Triton-X-100, в течение 60 мин при ЛТ.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется объем 0,2 мл насм2 . Удалите надосадочную жидкость и инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 4 ° C, при этом соответствующие первичные антитела разбавляются в окрашивающем буфере (1x DPBS [+/+], содержащий 1% BSA) (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что ячейки полностью покрыты раствором.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется объем 0,1-0,15 мл насм2 . Аспирируйте окрашивающий буфер и промойте ячейки 3 раза в 1x DPBS (+/+). Разбавьте соответствующие вторичные антитела (см. Таблицу материалов) в окрашивающем буфере в конечной концентрации 1:1000. Инкубируют клетки в разбавленном растворе антител в течение 1 ч при ЛТ в темноте. Убедитесь, что ячейки полностью покрыты раствором.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется объем 0,1-0,15 мл насм2 . Аспирируйте раствор вторичных антител и промойте клетки 2 раза в 1x DPBS (+/+). Противоокрашивают ядра 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), разведенным в DPBS (+/+) в течение 5 мин при ЛТ.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется рабочий объем 0,1-0,15 мл насм2 . Промойте ячейки 2 раза в 1x DPBS (+/+). Храните ячейки в DPBS (+/+) при температуре 4 °C до получения изображения.ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация светлого поля подходит для отслеживания морфологических изменений и роста нейритов. Кроме того, экспрессия стереотипных маркеров может быть оценена с помощью флуоресцентной микроскопии. В то время как недифференцированные ИПСК экспрессируют OCT 3/4 и NANOG, бета-III-тубулин (TUBB3) и связанный с микротрубочками белок 2 (MAP2) могут служить нейронными маркерами для визуализации нейритов и аксонов. Нейритическая сеть может быть дополнительно оценена путем определения длины нейрита в светлом поле или флуоресцентных изображениях. Анализ экспрессии генов с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР)Аспирируйте среду и промойте ячейки один раз в 1x DPBS (-/-).ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется объем 0,2 мл насм2 . Добавьте холодный буфер для лизиса РНК и соберите клетки, поцарапавшись. Изолируйте РНК с помощью подходящего набора на основе колонки и определите концентрацию РНК с помощью УФ-фотоспектрометрии. Сгенерируйте кДНК, используя 250 нг общей РНК и подходящий набор для обратной транскрипции. Подготовьте реакции кПЦР молекулярного маяка, содержащие 2,5 нг кДНК в двух экземплярах. Используйте соответствующую мастер-смесь и соответствующие анализы грунтовки20 (см. Таблицу материалов). Запустите qPCR, применяя 45 циклов с отжигом грунтовки при 60 ° C в течение 20 с. Нормализовать относительные уровни экспрессии генов к среднему значению генов домашнего хозяйства GAPDH, HPRT1 и GUSB. Применяют методΔΔCt 23, используя в качестве калибратора недифференцированные ИПСК.

Representative Results

На начальных этапах адгезивные культуры ИПСК отделяются, сингуляризируются и переносятся в суспензию (рис. 2). Агрегаты образуются в течение 24 ч и непрерывно увеличиваются в размерах. После 2 дней индукции трансгена ранние нейроны могут быть криоконсервированы для последующих экспериментов. Стойкая пролиферация в первые дни в суспензии приводит к увеличению количества клеток, достигая своего пика через 2 дня индукции (рис. 3A, B). Вместе с распространением начинают расти агрегаты. По сравнению с днем 0 диаметр показывает увеличение на 50% на 2-й день и почти удваивается на 5-й день (рис. 3D). Хотя увеличение диаметра ограничивает поступление питательных веществ внутрь агрегатов, жизнеспособность клеток не снижается на 2-й или 5-й день дифференцировки (рис. 3C). Однако длительное культивирование более 4 дней в суспензии не приводит к дальнейшему повышению выхода клеток, поскольку агрегаты становятся все более устойчивыми к ферментативной сингуляризации (рис. 3B). После криоконсервации клетки 2-го дня размораживают и наносят на посуду, покрытую поли-L-орнитином (PLO)-ламинином, для терминального созревания. В целом, клетки очень хорошо прикрепляются после размораживания и начинают расширять нейриты на ранней стадии. Временной профиль экспрессии генов, а также иммуноцитохимическое окрашивание нейрональных маркеров TUBB3 и MAP2 подтверждают идентичность нейрональных клеток (рис. 4A, B). В дополнение к повышению уровней TUBB3 и MAP2 культуры нейронов обогащаются ассоциированными с микротрубочками белковыми тау-транскриптами (MAPT), кодирующими нейрональный белок, участвующий в стабилизации аксонов, и демонстрируют сопутствующее снижение экспрессии плюрипотент-регулирующего транскрипционного фактора POU5F1. Более того, плотная невритная сеть образуется в течение первой недели после оттаивания (рис. 4В). Эти морфологические изменения в сочетании с транскрипционным профилем предполагают ускорение созревания нейронных культур. Рисунок 2: Генерация нейронов iNGN2, полученных из hiPSC, с использованием настольного биореактора. (A) Схематический обзор парадигмы дифференцировки с выделением ключевых этапов культивирования клеток. (Б-Ж) Изображения светлого поля визуализируют (B) hiPSC и (C, D) образование агрегатов в настольном биореакторе. (E, F) Нейроны iNGN2 расширяют нейриты и претерпевают морфологические изменения во время дифференцировки. Масштабная линейка = 100 мкм. Сокращения: BMM = матрица базальной мембраны; iPSC-MM = среда для обслуживания iPSC; PLO = поли-L-орнитин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Выход и жизнеспособность клеток при формировании и росте агрегатов. (A) Изображения светлого поля показывают образование агрегатов в течение 2 дней после культивирования в настольном биореакторе, а также увеличение размера заполнителя с течением времени. Масштабная линейка = 500 мкм. (B) Количественная оценка выхода клеток и (C) жизнеспособность в течение курса дифференцировки. Гистограммы представляют собой среднее значение + SD из четырех независимых экспериментов. (D) Диаметр, указывающий на размер агрегатов, был определен полуавтоматически с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом ImageJ (версия 1.53). Сначала изображения светлого поля были преобразованы в двоичные изображения, а затем дополнительно оценены с помощью инструмента анализа частиц, применяя следующие параметры: размер > 2,500мкм 2 , округлость 0,45-1, исключать края и включать отверстия. Горизонтальные линии показывают среднее значение ± SD пяти независимых дифференциаций. Одиночные точки представляют собой среднее значение индивидуальных экспериментов по дифференциации с не менее чем 20 агрегатами на момент времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Характеристика нейронов iNGN2, полученных из hiPSC. Временной профиль экспрессии генов нейрональных генов TUBB3, MAP2 и MAPT, а также плюрипотентного гена POU5F1, ассоциированного с плюрипотентными стволовыми клетками. Относительные уровни экспрессии были нормализованы к эталонным генам GAPDH, HPRT1 и GUSB. В качестве калибратора были выбраны недифференцированные ИПСК (день-2). Геометрические символы указывают среднее значение ± SD четырех независимых дифференцианий. (B) Репрезентативные изображения нейронов iNGN2 на 7-й день после размораживания (день-2 + 7), окрашенные на бета-III-тубулин (TUBB3, пурпурный) и связанный с микротрубочками белок 2 (MAP2, голубой). Ядра клеток были контрокрашены DAPI. Масштабные линейки = 100 мкм. (C) Оценка нейритной сети на изображениях светлого поля культур нейронов после размораживания. Общую длину нейритов определяли на площади 930,82 × 698,11мкм2 с помощью ImageJ (версия 1.53). После регулировки яркости и контрастности изображения были преобразованы в 8-битные изображения, а цвета инвертировались. Нейриты были впоследствии скелетизированы, а затем проанализированы с помощью плагинов ImageJ «Skeletonize» и «Analyze Skeleton» соответственно. Общая длина нейритов была разделена на количество сомов в интересующей области, чтобы получить среднюю длину нейрита на клетку. Гистограммы представляют собой среднее значение + SD из трех независимых экспериментов. Сокращения: DAPI = 4′,6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Ранее было показано, что эктопическая экспрессия нейронального фактора транскрипции NGN2 ускоряет ранние стадии дифференцировки нейронов и индуцирует приверженность нейрональной линии в ИПСК в течение 1 недели культивирования12,13,20. В этой работе описан подробный протокол дифференцировки генно-отредактированных ИПСК BIONi010-C-13 в нейроны iNGN2 с использованием настольного биореактора.

Биореактор CERO 3D представляет собой биореактор малого объема с четырьмя слотами для специализированных трубок, каждая из которых имеет максимальную емкость 50 мл. Температура и уровни CO2 непрерывно контролируются, а параметры культивирования (например, скорость вращения и время) регулируются для каждой трубы, что позволяет пользователям независимо друг от друга выполнять несколько подходов к дифференциации параллельно. Встроенные волнорезы на внутренней стенке трубы позволяют возмущать среду с низким напряжением сдвига и поддерживать 3D-агрегаты во взвешенном состоянии во время контролируемого вращения. Ограниченный доступ к питательным веществам, а также принудительные 3D-взаимодействия между клетками и клетками-внеклеточным матриксом (ECM) могут существенно влиять на клеточную дифференцировку и поведение24,25,26,27.

Культивирование клеток в виде 3D-агрегатов в суспензии увеличивает эти клеточные взаимодействия, тем самым более точно имитируя среду in vivo ткани или органов28. Сопутствующее возмущение среды регулирует размер агрегатов за счет механического трения, улучшает газообмен и уменьшает градиент питательных веществ и отходов в трубке, сохраняя при этом физиологически значимые градиенты внутри агрегатов 29,30,31,32,33,34. Несмотря на то, что смена среды выполняется вручную, настольный биореактор снижает трудозатраты и эксплуатационные расходы по сравнению со статическими колбами для культивирования. Биореактор также имеет ряд преимуществ по сравнению с полностью автоматизированными биореакторами с перемешиванием, поскольку конструкция без рабочего колеса снижает гидродинамическое напряжение сдвига на поверхности заполнителя, тем самым не только улучшая выживаемость клеток, но и ограничивая влияние напряжения сдвига на чувствительные ИПСК, дифференцировку клеток и функцию35,36,37,38.

Биореакторы с вертикальным колесом, в которых клетки перемешиваются большим вертикальным рабочим колесом, а также биореакторы с качающимся движением с использованием надутых мешков для культивирования, прикрепленных к моторизованной платформе, представляют собой альтернативные 3D-подвесные платформы. Несмотря на то, что они были чрезмерно протестированы для культивирования hiPSC 17,18,19,39,40, мало что известно об их применимости в подходах к дифференцировке нейронов, и сообщения ограничиваются успешным расширением нейронных клеток-предшественников млекопитающих и человека в биореакторах с перемешиванием 41,42,43,44,с редким числом исследований, посвященных Созревание44,45. В целом, автоматизированные платформы 3D-подвески предлагают преимущество полностью автоматизированной и управляемой компьютером смены среды, тем самым уменьшая колебания в обращении и сводя к минимуму риск загрязнения. Кроме того, можно постоянно контролировать параметры питательных веществ, такие как концентрация лактата и глюкозы. Однако создание этих систем часто требует значительных первоначальных инвестиций, лабораторных площадей и обучения квалифицированного персонала. Настольный биореактор представляет собой компактную и простую в использовании альтернативу для культивирования клеток в суспензии, но не обеспечивает одновременный мониторинг питательных веществ.

Как и в большинстве протоколов, используемых для культивирования клеток на 3D-подвесных платформах, начальное формирование агрегатов представляет собой критический шаг. ИПСК культивируют в виде адгезивных монослоев, а затем переносят в виде одноклеточных суспензий в 3D-среду. Чтобы свести к минимуму потерю клеток на этом этапе, необходимо учитывать несколько аспектов. Конструкция пробирок со встроенными волнорезами означает, что для обеспечения оптимального возмущения среды требуется минимальный объем культивирования 10 мл на пробирку. Поэтому критический объем не должен быть подорван в долгосрочной перспективе. Кроме того, для формирования стабильных агрегатов в краткосрочной перспективе настоятельно рекомендуется начальная плотность посева 7,5 миллионов клеток на 10 мл объема культуры и скорость вращения 60 об/мин, хотя адаптация может потребоваться в зависимости от клеточной линии.

После перевода ИПСК в суспензию агрегаты должны образоваться в течение 24 ч. Первая смена среды имеет решающее значение, так как агрегаты малы и могут не оседать должным образом. Время осаждения заполнителей может быть увеличено, но не должно превышать более 10 минут, так как заполнители могут начать слипаться и расти неоднородным образом. Во время аспирации в пробирке следует оставлять минимальный объем культуры 5 мл и избегать любых возмущений среды. Тем не менее, на начальных этапах следует ожидать потери клеток и агрегатов. Количество клеток указывает на постоянный выход клеток в течение первых 2 дней в культуре, что указывает на то, что высокая пролиферативная способность ИПСК компенсирует первоначальную потерю клеток. Попав в суспензию, бережное культивирование и возмущение приводят к образованию агрегатов однородного размера, которые со временем начинают расти.

Дифференцировка нейронов проводилась в соответствии с ранее опубликованным протоколом, основанным на индуцированной доксициклином сверхэкспрессии NGN213, а отдельные этапы были оптимизированы для 3D-культивирования. Нейрональный транскрипционный фактор NGN2 является хорошо описанным драйвером дифференцировки нейронов и значительно ускоряет нейрональную индукцию11,13,46. В то время как обычное моделирование с определенными факторами роста занимает от нескольких недель до 7,8,9 месяцев, экспрессия NGN2 индуцирует судьбу нейрональных клеток в течение нескольких дней. В дополнение к сокращению времени выращивания, протокол не зависит ни от дорогостоящих факторов роста, ни от матриц покрытия для исходной суспензионной культуры, что дополнительно снижает затраты на выращивание.

Более того, прямое сравнение генерации незрелых нейронов, управляемой NGN2, в адгезивных и суспензионных культурах показало увеличение клеток в 1,36 раза после 4 дней в культуре с использованием настольного биореактора20, в то время как объем среды, необходимый для генерации 1 миллиона клеток, как ожидается, будет уменьшен вдвое. Таким образом, использование настольного биореактора для генерации нейронов iNGN2 может быть полезным, поскольку большее количество клеток может быть получено с меньшим временем обработки и затратами. В соответствии с предыдущими отчетами, приверженность нейронной линии наблюдалась на ранней стадии. После 2 дней индукции NGN2 была очевидна глубокая экспрессия классических нейрональных маркеров, таких как TUBB3, MAP2 и MAPT, что подтверждает применимость настольного биореактора для индукции нейронов. Следуя этому протоколу, приблизительно 6,2 миллиона незрелых нейронов iNGN2 могут быть получены из 1 миллиона ИПСК в течение 4 дней культивирования. Однако производительность может варьироваться в зависимости от партии и зависит от объема суспензионной культуры при посеве.

Для дальнейшего повышения урожайности время выращивания было продлено еще на 3 дня; Однако, несмотря на то, что агрегаты стали больше, они также стали очень компактными и не могли быть должным образом диссоциированы для криоконсервации или повторного покрытия. Несмотря на достижения в подходах к 3D-культуре, адгезивные 2D-культуры нейронов по-прежнему являются золотым стандартом для функционального анализа, такого как микроэлектродные матрицы или визуализация кальция. Таким образом, клеточная сингуляризация является важной предпосылкой для однородно распределенного нейронального монослоя и нейритной сети. Более сильное механическое отслоение клеток или реагенты жесткой диссоциации могут быть использованы для обеспечения сингуляризации, но с потенциальным воздействием на жизнеспособность клеток, физиологию и способность к повторному прикреплению47,48. Что касается потребности в отдельных клетках для дальнейшего анализа и созревания, агрегаты были диссоциированы после 4 дней в суспензии, а (2-й день) нейроны iNGN2 криоконсервированы. Постоттаивающая дифференцировка и характеристика нейронов iNGN2 подтвердили возрастающую зрелость культур нейронов и формирование плотной нейритной сети.

Предоставленный протокол дает большое количество нейронов iNGN2. Однако необходимо учитывать несколько ограничений. Как и для большинства платформ суспензионных культур, перенос hiPSC из 2D-адгезивной культуры в 3D-среду имеет решающее значение и часто связан с глубокой потерей клеток. Во время смены среды ожидаются дальнейшие значительные потери ячеек и агрегатов. По сравнению с автоматизированными платформами время обработки и риск загрязнения при использовании настольного биореактора увеличиваются, поскольку смена среды должна выполняться вручную. Помимо отсутствия автоматизации, настольный биореактор не дает возможности контролировать питательные вещества, а максимальная емкость 50 мл на пробирку ограничивает потенциал масштабирования протокола. Наконец, важно отметить, что, хотя NGN2 ускоряет приверженность нейронной линии, продолжительность терминального созревания не сокращается и по-прежнему требует длительного культивирования в течение нескольких недель. Учитывая важность астроцитарной поддержки для функции нейронов, привязанности и выживания 49,50,51, следует рассмотреть подходы к совместному культивированию, которые могут быть даже необходимы для долгосрочного культивирования.

Таким образом, протокол 2D-дифференциации был успешно переведен в 3D-среду для быстрой и воспроизводимой генерации нейронов iNGN2 путем внедрения настольного биореактора. Описанный протокол дает большое количество высококачественных нейронов, полученных из iPSC, которые могут служить отправной точкой для сложных модельных испытаний, высокопроизводительных скринингов лекарств и крупномасштабных анализов токсичности.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Проект EBiSC2 получил финансирование от совместного предприятия Innovative Medicines Initiative 2 (JU) в рамках грантового соглашения No 821362. JU получает поддержку от программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» и EFPIA. Мы благодарим Надин Смандзич, Хелен Д. М. Хеммер, Джонн-Маджд Балстерс и Ванессу М. Налевая за их помощь в иммуноцитохимическом анализе и анализе экспрессии генов, а также Хайке Артен за ее отличную техническую поддержку. Кроме того, мы благодарим Стефани Бур за создание программы биореактора. Рисунок 2A был создан с помощью BioRender.com.

Materials

2-Mercaptoethanol 50 mM Gibco  11528926
60 mm Nunclon Delta Surface Nunc 734-2040
Anti-beta III Tubulin antibody [TU-20] (dilution 1:1,000) Abcam   ab7751 
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific   10400745
B-27 Supplement (50x)  Gibco 11530536 serum-free Supplement (50x)
BIONi010-C-13 hiPSC line European Bank for induced pluripotent Stem Cell (EBiSC), BIONEER as Depositor SAMEA103988285 Bioneer is depositor in EBiSC and owner of the hiPSC line.
Biorender  Biorender.com
BSA Cell Culture grade Thermo Fisher Scientific   12330023
CERO 3D Incubator & Bioreactor OLS OMNI Life Science 2800000
CEROtubes Cell culture Tubes 50 mL OLS OMNI Life Science 2800005
Citavi 6 Swiss Academic Software
CryoStor CS10 Stemcell 7930 freezing medium containing 10% DMSO
Cytofix Fixation Solution BD Biosciences  554655 fixation solution containing 4% paraformaldehyde 
DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN)  Thermo Fisher Scientific   12333553
Doxycycline hydrochloride (DOX) Sigma-Aldrich D3447
DPBS without Calcium and Magnesium (DPBS -/-)  Gibco 14190250
DPBS with Calcium and Magnesium (DPBS +/+)  Gibco 11580456
DMEM/F12 (-/-) Gibco 21331-020
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement Gibco 31331-028
EVOS XL Core Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific   A21424
GlutaMAX supplement  Gibco  35050-038 stabilized L-alanyl-L-glutamine dipeptid
ImageJ 1.51v  National Institute of Health
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278l
Laminin Merck L2020
MACSQuant Analyzer Miltenyi
MAP2 Monoclonal Antibody (dilution 1: 300) Thermo Fisher Scientific   13-1500 
Matrigel Growth factor reduced, phenol-red free  Corning Life Science  356231 basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Gibco  11140035
MicroAmp Optical Adhesive Film Kit  Thermo Fisher Scientific   10095714
mTeSR1 Stemcell 85850 feeder-free iPSC maintenance medium 
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502-048 serum-free Supplement based on Bottenstein’s N-1 formulation
Neurobasal Medium Gibco 11570556
Nikon Eclipse TS2 Nikon Instruments Europe B.V.
NucleoCounter-NC200 ChemoMetec A/S
Origin 2021 OriginLab
Penicillin-Streptomycin Gibco 11548876
Perm/Wash Buffer  BD Biosciences  554723
Primer assay TUBB3(Hs00801390_s1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay GAPDH (Hs99999905_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay GUSB (Hs99999908_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay HPRT1 (Hs99999909_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay MAP2 (Hs00258900_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay MAPT (Hs00902194_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay POU5F1 (Hs04260367_gH) Thermo Fisher Scientific 11620099
Poly-L-ornithine 0.01% Merck P4957
RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit Qiagen 74034 column-based RNA isolation kit
RLT Buffer Qiagen 79216 cell lysis buffer
Sodium Pyruvat (100 mM) Gibco 12539059
StemPro Accutase Gibco 11599686 cell dissociation enzyme
TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX Thermo Fisher Scientific   11380912 qPCR master mix
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
TrypLE Select Enzym Gibco 12563-011 Trypsin-EDTA solution
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G
Via1-Cassette ChemoMetec A/S 941-0012
Wide Bore Filtered Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 10088880
X20 OPTICAL 96WELL FAST CLEAR REACTION PLATES  Thermo Fisher Scientific 15206343
Y-27632 dihydrochloride, Rho kinase inhibitor (ROCK inhibitor) Abcam ab120129
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feigin, V. L., et al. The global burden of neurological disorders: translating evidence into policy. The Lancet. Neurology. 19 (3), 255-265 (2020).
  2. Olesen, J., Gustavsson, A., Svensson, M., Wittchen, H. -. U., Jönsson, B. The economic cost of brain disorders in Europe. European Journal of Neurology. 19 (1), 155-162 (2012).
  3. Preclinical Development: The Safety Hurdle Prior to Human Trials. American Pharmaceutical Review Available from: https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/187349-Preclinical-Development-The-Safety-Hurdle-Prior-to-Human-Trials (2016)
  4. van Norman, G. A. Phase II trials in drug development and adaptive trial design. JACC. Basic to Translational Science. 4 (3), 428-437 (2019).
  5. van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: part 2: potential alternatives to the use of animals in preclinical trials. JACC. Basic to Translational Science. 5 (4), 387-397 (2020).
  6. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  7. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  8. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  9. Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS One. 8 (3), 59252 (2013).
  10. Hulme, A. J., Maksour, S., St-Clair Glover, M., Miellet, S., Dottori, M. Making neurons, made easy: the use of Neurogenin-2 in neuronal differentiation. Stem Cell Reports. 17 (1), 14-34 (2022).
  11. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  12. Schmid, B., et al. Generation of two gene edited iPSC-lines carrying a DOX-inducible NGN2 expression cassette with and without GFP in the AAVS1 locus. Stem Cell Research. 52, 102240 (2021).
  13. Shih, P. -. Y., et al. Development of a fully human assay combining NGN2-inducible neurons co-cultured with iPSC-derived astrocytes amenable for electrophysiological studies. Stem Cell Research. 54, 102386 (2021).
  14. Chang, C. -. Y., et al. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-based neurodegenerative disease models for phenotype recapitulation and drug screening. Molecules. 25 (8), 2000 (2000).
  15. Silva, M. C., Haggarty, S. J. Human pluripotent stem cell-derived models and drug screening in CNS precision medicine. Annals of the New York Academy of Sciences. 1471 (1), 18-56 (2020).
  16. Elanzew, A., Sommer, A., Pusch-Klein, A., Brüstle, O., Haupt, S. A reproducible and versatile system for the dynamic expansion of human pluripotent stem cells in suspension. Biotechnology Journal. 10 (10), 1589-1599 (2015).
  17. Davis, B. M., Loghin, E. R., Conway, K. R., Zhang, X. Automated closed-system expansion of pluripotent stem cell aggregates in a rocking-motion bioreactor. SLAS Technology. 23 (4), 364-373 (2018).
  18. Kropp, C., et al. Impact of feeding strategies on the scalable expansion of human pluripotent stem cells in single-use stirred tank bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 5 (10), 1289-1301 (2016).
  19. Borys, B. S., et al. Overcoming bioprocess bottlenecks in the large-scale expansion of high-quality hiPSC aggregates in vertical-wheel stirred suspension bioreactors. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 55 (2021).
  20. Kwok, C. K., et al. Scalable expansion of iPSC and their derivatives across multiple lineages. Reproductive Toxicology. 112, 23-35 (2022).
  21. User Protocol for Human induced Pluripotent Stem Cells. EBiSC Available from: https://ebisc.org/docs/ebisc/EBiSC_User_Protocol_for_Human_induced_Pluripotent_Stem_Cells.pdf (2023)
  22. Neyrinck, K., et al. SOX9-induced generation of functional astrocytes supporting neuronal maturation in an all-human system. Stem Cell Reviews and Reports. 17 (5), 1855-1873 (2021).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  25. Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Engineering. Part A. 15 (2), 205-219 (2009).
  26. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  27. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  28. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
  29. Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Effects of hydrodynamics on cultures of mammalian neural stem cell aggregates in suspension bioreactors. Industrial and Engineering Chemical Research. 40 (23), 5350-5357 (2001).
  30. Gerecht-Nir, S., Cohen, S., Itskovitz-Eldor, J. Bioreactor cultivation enhances the efficiency of human embryoid body (hEB) formation and differentiation. Biotechnology and Bioengineering. 86 (5), 493-502 (2004).
  31. Zhao, F., et al. Effects of oxygen transport on 3-d human mesenchymal stem cell metabolic activity in perfusion and static cultures: experiments and mathematical model. Biotechnology Progress. 21 (4), 1269-1280 (2005).
  32. Cimetta, E., Figallo, E., Cannizzaro, C., Elvassore, N., Vunjak-Novakovic, G. Micro-bioreactor arrays for controlling cellular environments: design principles for human embryonic stem cell applications. Methods. 47 (2), 81-89 (2009).
  33. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Engineering. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
  34. Sargent, C. Y., et al. Hydrodynamic modulation of embryonic stem cell differentiation by rotary orbital suspension culture. Biotechnology and Bioengineering. 105 (3), 611-626 (2010).
  35. Liu, N., Zang, R., Yang, S. -. T., Li, Y. Stem cell engineering in bioreactors for large-scale bioprocessing. Engineering in Life Sciences. 14 (1), 4-15 (2014).
  36. Wolfe, R. P., Leleux, J., Nerem, R. M., Ahsan, T. Effects of shear stress on germ lineage specification of embryonic stem cells. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (10), 1263-1273 (2012).
  37. Wolfe, R. P., Ahsan, T. Shear stress during early embryonic stem cell differentiation promotes hematopoietic and endothelial phenotypes. Biotechnology and Bioengineering. 110 (4), 1231-1242 (2013).
  38. Shafa, M., et al. Impact of stirred suspension bioreactor culture on the differentiation of murine embryonic stem cells into cardiomyocytes. BMC Cell Biology. 12 (1), 53 (2011).
  39. Kwok, C. K., et al. Scalable stirred suspension culture for the generation of billions of human induced pluripotent stem cells using single-use bioreactors. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1076-1087 (2018).
  40. Rodrigues, C. A. V., et al. Scalable culture of human induced pluripotent cells on microcarriers under xeno-free conditions using single-use vertical-wheel™ bioreactors. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 93 (12), 3597-3606 (2018).
  41. Gilbertson, J. A., Sen, A., Behie, L. A., Kallos, M. S. Scaled-up production of mammalian neural precursor cell aggregates in computer-controlled suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 94 (4), 783-792 (2006).
  42. Baghbaderani, B. A., et al. Expansion of human neural precursor cells in large-scale bioreactors for the treatment of neurodegenerative disorders. Biotechnology Progress. 24 (4), 859-870 (2008).
  43. Baghbaderani, B. A., et al. Bioreactor expansion of human neural precursor cells in serum-free media retains neurogenic potential. Biotechnology and Bioengineering. 105 (4), 823-833 (2010).
  44. Serra, M., Brito, C., Costa, E. M., Sousa, M. F. Q., Alves, P. M. Integrating human stem cell expansion and neuronal differentiation in bioreactors. BMC Biotechnology. , 82 (2009).
  45. Zhao, S., et al. Generation of cortical neurons through large-scale expanding neuroepithelial stem cell from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 431 (2020).
  46. Pawlowski, M., et al. Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
  47. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
  48. Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2016).
  49. Allen, N. J. Astrocyte regulation of synaptic behavior. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 439-463 (2014).
  50. Verkhratsky, A., Nedergaard, M., Hertz, L. Why are astrocytes important. Neurochemical Research. 40 (2), 389-401 (2015).
  51. Jäkel, S., Dimou, L. Glial cells and their function in the adult brain: a journey through the history of their ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 24 (2017).

Tags

3D Suspension BioreactorHuman Neurogenin 2-inducible NeuronsInduced Pluripotent Stem CellsIPSC CultureNeuronal DifferentiationHigh-throughput ScreeningRapid And Cost-efficient GenerationCardiomyocytesPre-cultivationTrypsinizationCell SingularizationCell CountingCell SuspensionCentrifugationFeeder-free IPSC Maintenance MediumROCK InhibitorBioreactor Cultivation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wihan, J., Karnatz, I., Sébastien, I., Kettenhofen, R., Schmid, B., Clausen, C., Fischer, B., Steeg, R., Zimmermann, H., Neubauer, J. C. Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor. J. Vis. Exp. (193), e65085, doi:10.3791/65085 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image