JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

ייצור נוירוגנין אנושי 2-Inducible Neurons בביוריאקטור תרחיף תלת ממדי

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/65085
, , , , , , , , ,
1Fraunhofer Project Center for Stem Cell Process Engineering,Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering IBMT, 2Bioneer A/S, 3Fraunhofer UK Research Ltd, Technology and Innovation Centre, 4Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering IBMT, 5Department of Molecular and Cellular Biotechnology,Saarland University, 6Facultad de Ciencias del Mar,Universidad Católica del Norte

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול ליצירת תאי עצב פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים בביוריאקטור תרחיף תלת-ממדי של ספסל.

Abstract

הגזירה של תאי שושלת עצבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) סימנה אבן דרך בחקר המוח. מאז הופעתם הראשונה, פרוטוקולים עברו אופטימיזציה מתמדת וכעת נמצאים בשימוש נרחב במחקר ופיתוח תרופות. עם זאת, משך הזמן הארוך מאוד של פרוטוקולי בידול והתבגרות קונבנציונליים אלה והביקוש הגובר ל- hiPSCs באיכות גבוהה ונגזרותיהם העצביות מעלים את הצורך באימוץ, אופטימיזציה וסטנדרטיזציה של פרוטוקולים אלה לייצור בקנה מידה גדול. עבודה זו מציגה פרוטוקול מהיר ויעיל להבחנה של נוירוגנין 2 (iNGN2) מהונדס גנטית, המושרה על ידי דוקסיציקלין – המבטא hiPSCs לנוירונים באמצעות ביוריאקטור תרחיף תלת-ממדי (3D).

בקצרה, תרחיפים חד-תאיים של iNGN2-hiPSCs הורשו ליצור אגרגטים תוך 24 שעות, ומחויבות השושלת העצבית נגרמה על ידי תוספת של דוקסיציקלין. האגרגטים נותקו לאחר יומיים של אינדוקציה והתאים נשמרו בהקפאה או צופו מחדש להבשלה סופנית. תאי העצב שנוצרו iNGN2 ביטאו סמנים עצביים קלאסיים בשלב מוקדם ויצרו רשתות עצביות מורכבות תוך שבוע לאחר ציפוי מחדש, מה שמצביע על בגרות גוברת של תרביות עצביות. לסיכום, פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב ליצירה מהירה של נוירונים שמקורם ב-hiPSC בסביבה תלת-ממדית מסופק הטומן בחובו פוטנציאל גדול כנקודת מוצא למידול מחלות, בדיקות תרופות פנוטיפיות בעלות תפוקה גבוהה ובדיקות רעילות בקנה מידה גדול.

Introduction

הפרעות נוירולוגיות הן הגורם המוביל לנכות ברחבי העולם1. אחד מכל שישה אנשים נפגע, והתחלואה ממשיכה לעלות. הנטל הכלכלי הנלווה על חברות ומערכות הבריאות שלהן הוא עצום. הערכה של 30 מדינות אירופיות בשנת 2010 העריכה עלויות שנתיות של 800 מיליארד אירו הקשורות להפרעות נפשיות ונוירולוגיות2. הנטל החברתי-כלכלי הגובר דורש אסטרטגיות טיפול יעילות, ואף על פי שהבנתנו את הפתופיזיולוגיה של מחלות גדלה באופן משמעותי, התרגום למרפאות לעתים קרובות אינו מספיק. באופן כללי, רק 12% מהתרופות נכנסות לניסויים קליניים, מתוכם יותר מ -80% נכשלות בשלבים מאוחרים יותר, בעיקר בגלל חוסר יעילות או רעילות בלתי צפויה 3,4. הסיבות לכך מגוונות, אך יכולת ההעברה המוגבלת מניסויים בבעלי חיים בשלבים פרה-קליניים לניסויים בבני אדם באה לידי ביטוי יותר ויותר5. מודלים אנושיים של תאי מבחנה ורקמות עשויים לגשר על הפער של תרגום בין מינים, ולהתקדמות בטכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם (hiPSC) יש פוטנציאל גדול בהקשר זה. hiPSCs נמצאים בשימוש נרחב במחקר בסיסי וחולקים מאפיינים חיוניים עם תאי גזע עובריים (hESCs), כגון יכולת התחדשות עצמית כמעט בלתי מוגבלת והיכולת להתמיין לכל שלוש שכבות הנבט6, תוך עקיפת חששות אתיים הקשורים להשמדת עוברים.

הנגזרת של תאים עצביים מתאי גזע עובריים עובריים, ומאוחר יותר מתאי גזע עובריים, סימנה אבן דרך בחקר המוח. פרוטוקולי התמיינות ראשוניים התבססו על יישום גורמי גדילה המחקים שלבים קריטיים במהלך אמבריוגנזה, רובם כללו עיכוב SMAD כפול או בתרביות השעיה או בתרביות דבק 7,8,9. תאי עצב בוגרים נוצרו בהצלחה, אך מספר חסרונות של פרוטוקולים אלה עדיין מעכבים את השימוש הרחב בהם בפיתוח תרופות, כגון התפוקה הנמוכה והשונות הגבוהה בין אצווה לאצווה של תאי עצב שנוצרו, כמו גם עומס העבודה הנרחב הקשור לזמני תרבית ארוכים. שיפורים הושגו על ידי ביטוי כפוי של גורמי שעתוק המעורבים באופן קריטי בנוירוגנזה, ובני משפחת הנוירוגנין (NGN), במיוחד NGN2, זוהו כמניעים יעילים10. הביטוי החוץ רחמי בתיווך לנטי-ויראלי של NGN2 בתאי גזע גזעיים גבוהים האיץ את השלבים המוקדמים של התמיינות עצבית באופן משמעותי, וגרם לגורל תאי עצב תוך שבוע11 בלבד. הבשלה סופנית מאוחרת יותר בתרביות משותפות עם אסטרוציטים הניבה נוירונים פונקציונליים ברמת טוהר וכמות גבוהים עם תכונות הניתנות לשחזור. עריכה גנטית מכוונת אתר של אתר שילוב וירוסים הקשור לאדנו 1 (AAVS1) יושמה לאחר מכן כדי ליצור קווי hiPSC עם קלטת ביטוי יציבה ודוקסיציקלין עבור NGN212,13, ובכך למזער תופעות לוואי לא רצויות של מתן לנטיויראלי.

ההתמיינות החזקה והיעילה של נוירוגנין 2 (iNGN2) המושרה על ידי דוקסיציקלין טומנת בחובה פוטנציאל גדול לבדיקות תרופות פנוטיפיות בתפוקה גבוהה ומבחני רעילות10,14,15; והתקדמות משמעותית בעיבוד ביולוגי נעשתה במהלך העשור האחרון ביישום ביוריאקטורים להרחבה והתמיינות של תאים ניתנים להרחבה והתמיינות 16,17,18,19. עם זאת, רוב פרוטוקולי הבידול מותאמים לתרבויות דבקות, ותרגום לסביבה תלת-ממדית (3D) דורש לעתים קרובות שינויים חיוניים. לאחרונה, דווח על שימוש מוצלח בביוריאקטור תלת-ממדי עם תכונות לחץ גזירה מופחתות להרחבת hiPSCs ולהתמיינות הניתנת לשחזור להפטוציטים, קרדיומיוציטים ונוירונים20. כאן, פרוטוקול מפורט ליצירה ואפיון של נוירונים iNGN2 מסופק באמצעות ביוריאקטור תלת-ממדי זהה.

Protocol

הערה: כל מניפולציות התא, כמו גם צלחות תרבית ותכשירים בינוניים, צריך להתבצע בתנאים סטריליים. יש לנקות היטב את מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית לפני השימוש ולאחר העיבוד על ידי ניגוב כל המשטחים עם אתנול 70%. הפרוטוקול המתואר מותאם להבדלים עצביים באינקובטור תלת-ממדי CERO ובביוריאקטור (להלן נקרא ביוריאקטור benchtop). ביוריאקטור זה מציע ארבעה חריצים לצינורות ביוריאקטורים מיוחדים, כל אחד עם קיבולת מקסימלית של 50 מ”ל. הטמפרטורה ורמות ה-CO2 נשלטות באופן רציף, ופרמטרי הגידול (למשל, מהירות סיבוב וזמן) מוסדרים עבור כל צינור בנפרד. כל שלבי השאיפה בוצעו באמצעות פיפטת שאיפה ומשאבת ואקום, אם לא צוין אחרת. 1. טיפוח והרחבה של hiPSCs הערה: BIONi010-C-13 מהונדס מסוג NGN2 hiPSC הניתן להשראת דוקסיציקלין משמש בפרוטוקול זה. פרוטוקול ההרחבה המסופק כאן מותאם לצלחות פטרי בקוטר 6 ס”מ, אך ניתן להשתמש בתבניות תרבית חלופיות אם מעדיפים. ציפוי צלחות פטרי בקוטר 6 ס”מ עם מטריצת קרום מרתף מדוללת בתווך הנשר (DMEM)/F12 (-/-) של דולבקו בריכוז סופי של 0.083 מ”ג/מ”ל/10 ס”מ2. לדגור את הכלים המצופים ב 37 ° C במשך 30 דקות לפחות.הערה: פרוטוקול מפורט להכנת פתרון מטריצת קרום מרתף ניתן למצוא בהוראות היצרן. ניתן לתרבית hiPSCs על מטריצות חוץ-תאיות חלופיות לצורך הרחבה. הפשרת hiPSCs בהקפאה בהתאם לפרוטוקול המשתמש EBiSC Cell line User Protocol21 באמצעי תחזוקה iPSC ללא מזין + מעכב ROCK 10 μM (Y-27632). צפיפות זריעה של 1 × 106 תאים קיימא לכל צלחת 60 מ”מ מומלץ. החליפו את המדיום למחרת למדיום תחזוקת iPSC ללא מזין ללא מעכב ROCK, ובצעו החלפת מדיה יומית. התחילו לעבור כאשר תרביות hiPSC מגיעות למפגש של 60%-80%. בדוק אם יש אזורים מובחנים ונקה את המושבות באופן ידני אם השטח עולה על 5%.הערה: hiPSCs לא ממוינים מופיעים כתאים עגולים עם גרעין בולט ופחות ציטופלסמה. מושבות שטוחות וצפופות נוצרות מוקדם לאחר הפשרה או מעבר. תמונות מופתיות של שדה בהיר של תרביות hiPSC מוצגות באיור 1. מידע נוסף ניתן למצוא ב-EBiSC Cell line User Protocol21. למעבר, הכינו כלים מצופים מטריצה בקרום מרתף ואמצעי תחזוקה iPSC ללא הזנה. שאפו את המדיום מתרביות hiPSC ושטפו את התאים פי 2 עם 0.5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ב-1x מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS) ללא Ca 2+ ו-Mg2+ (DPS [-/-], ראו טבלת חומרים). הסר את supernatant ולהוסיף 2 מ”ל של 0.5 mM EDTA ב 1x DPBS (-/-) לצלחות פטרי 6 ס”מ. לדגור על התאים ב 37 ° C במשך 3 דקות באינקובטור. יש לשאוף 1.5 מ”ל של תמיסת EDTA ולהמשיך בדגירה במשך 3-5 דקות. טפחו בעדינות על הכלים כדי להקל על ניתוק התאים.הערה: בדוק ניתוק באמצעות הערכה חזותית. מושבות hiPSC אמורות להתחיל להתנתק לאחר 5 דקות, אך ייתכן שיהיה צורך בזמן דגירה ארוך יותר עם תרביות hiPSC חזקות יותר. אם המושבות אינן מתנתקות, מגדילים את זמן הדגירה עד 10 דקות, אך לא חורגים ממסגרת זמן זו. הוסיפו 5 מ”ל של מדיום תחזוקת iPSC ללא מזין לצלחות פטרי בקוטר 6 ס”מ, והשהו מחדש בעדינות את המושבות 2x עם פיפטה סרולוגית של 10 מ”ל או באמצעות קצוות פיפטה רחבים. מעבירים את התאים לצינור של 15 מ”ל.הערה: hiPSCs רגישים מאוד ללחץ מכני; לכן, יש להימנע מהשעיה מרובה מחדש. השעיית התא הסופית צריכה להיות מורכבת משברי מושבה קטנים (50-200 מיקרומטר). שאפו את הסופרנאטנט מכלי התרבית המצופים, והכינו 4 מ”ל של אמצעי תחזוקה iPSC ללא מזין לכל צלחת של 6 ס”מ. העבירו שברי מושבה קטנים לצלחות התרבית הטריות ביחסים מפוצלים של 1:10 עד 1:40, וטפחו ב-37°C וב-5% CO2 עם שינויי מדיה יומיים.הערה: מושבות קטנות צריכות להתחבר תוך שעה או שעתיים לאחר המעבר. איור 1: מורפולוגיה של תרביות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם . (A,B) תרביות hiPSC באיכות טובה במפגש שונה המראות מושבות hiPSC דחוסות עם מורפולוגיה הומוגנית וקצוות מוגדרים. (C) תרבית hiPSC עם אשכולות מתפתחים של תאים ממוינים סביב קצוות המושבה (קו לבן מקווקו). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצור: hiPSC = תא גזע פלוריפוטנטי המושרה על ידי האדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 2. טיפוח מוקדם של hiPSCs במערכת הביוריאקטור benchtop (יום-2) הערה: התחילו קדם-טיפוח כאשר תרביות hiPSC מגיעות למפגש בין 60% ל-80%. בדוק את מושבות hiPSC עבור אזורים מובחנים. במהלך שלב טרום טיפוח זה, hiPSCs נשמרים באמצעי תחזוקה iPSC ללא מזין במשך יומיים. הכינו את מדיית התרבית, המורכבת ממדיום תחזוקת iPSC ללא מזין ומעכב ROCK של 10 מיקרומטר (Y-27632). יש לשאוף את המדיום לחלוטין מה-hiPSCs ולשטוף בעדינות את התאים עם 1x DPBS (-/-) פעמיים. הוסיפו 2.0 מ”ל של תמיסת טריפסין-EDTA שחוממה מראש לצלחות פטרי בקוטר 6 ס”מ ודגרו על התאים למשך 3 דקות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור. טפחו בעדינות על הכלים כדי להקל על ניתוק התא, או דגרו למשך 1-2 דקות נוספות. השהה מחדש את התאים ב 5 מ”ל של אמצעי תחזוקה iPSC ללא מזין + מעכב ROCK לכל מנה. העבירו את תרחיף התא לצינור של 15 מ”ל או 50 מ”ל וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג כדי להבטיח סינגולריזציה של התא. קבע את מספרי התאים ב- 100 μL של תרחיף תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי כפי שתואר קודם לכן20. העבר את הנפח המתאים עבור 15 × 106 תאים לכל צינור ביוריאקטור לתוך צינור 50 מ”ל. צנטריפוגה את התאים ב 300 × גרם במשך 3 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב 2 מ”ל של מדיום תחזוקת iPSC ללא מזין + מעכב רוק. מלא כל צינור 50 מ”ל עם 18 מ”ל של בינוני (צפיפות זריעת תאים של 0.75 × 106 תאים / מ”ל). יש להוציא את תרחיף התא לתוך צינורות הביוריאקטור (20 מ”ל לכל צינור). הכניסו את הצינורות למערכת הביוריאקטורים. הגדר את פרמטרי הטיפוח הבאים: תקופת סיבוב של 2 שניות, מהירות סיבוב של 60 סל”ד, ללא הפסקת תסיסה, 37 ° C ו- 5% CO2 למשך זמן בלתי מוגבל20. התחל את תוכנית הטיפוח באמצעות תצוגת הביוריאקטורים. שנה את המדיה למחרת. תן לצברים להתיישב בצינורות הביוריאקטור למשך ~ 5 דקות. בזהירות לשאוף את supernatant.הערה: אל תתנו לצברים לשקוע למשך יותר מ-10 דקות, מכיוון שהם עלולים להיצמד זה לזה ולבנות מתלה אגרגטים הטרוגני. מומלץ להשאיר ~ 5 מ”ל של מדיום תרבית בצינור הביוריאקטור. הוסף 15 מ”ל של אמצעי תחזוקה iPSC טרי ללא מזין ללא מעכב ROCK לכל צינור, והמשך את הגידול בביוריאקטור benchtop במשך 24 שעות. 3. הבחנה של hiPSCs לתוך נוירונים מוקדמים (יום 0) הכן מדיום נוירובזאלי (NBM): 50% DMEM/F-12 עם דיפפטיד מיוצב L-אלניל-L-גלוטמין, 50% נוירובזל בינוני, תוסף 0.5x ללא סרום (50x), תוסף ללא סרום 0.5x המבוסס על נוסחת N-1 של בוטנשטיין (100x), 0.5x דיפפטיד L-alanyl-L-גלוטמין מיוצב, 0.5x MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x), 500 ננומטר נתרן פירובט (100 מילימול), 50 ננומטר 2-מרקפטואתנול (50 מ”מ), 0.025% תמיסת אינסולין אנושית ו-5 U/מ”ל פניצילין-סטרפטומיצין.הערה: NBM צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C וניתן להשתמש בו עד שבועיים. התחל התמיינות עצבית על ידי הוספת דוקסיציקלין (DOX) לתרביות hiPSC. לשם כך, תן לצברים להתיישב בצינורות הביוריאקטורים. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט מהתאים, השאירו ~ 5 מ”ל בצינור, והוסיפו 35 מ”ל של מדיום השראה עצבי (NIM) המורכב מ- NBM ו- 2 מיקרוגרם / מ”ל DOX.הערה: מכיוון ש-DOX רגיש לאור, מומלץ לכבות את האור בזמן העבודה. החזירו את הצינורות לביוריאקטור והמשיכו בטיפוח. בצע שינויי מדיה מדי יום במשך יומיים, כמתואר בשלב 3.2.הערה: לאחר 4 ימים בתרבית השעיה, ניתן לנתק את הצברים, ותאי עצב מוקדמים נשמרים בהקפאה או מצופים מחדש ישירות להבשלה סופנית. 4. שימור בהקפאה של נוירונים מוקדמים (יום 2) הערה: שימור בהקפאה אינו נדרש ואינו קריטי לתהליך ההתמיינות, אך מומלץ מאוד מכיוון שניתן לייצר ולאחסן מלאי גדול של נוירונים מוקדמים לצורך הבשלה וניתוח לאחר מכן. הניחו לצברים לשקוע בצינור הביוריאקטור. שאפו את הסופרנאטנט כפי שתואר קודם לכן. העבירו את האגרגטים לצינור סטרילי של 15 מ”ל או 50 מ”ל ושטפו בעדינות את האגרגטים 2x עם 1x DPBS (-/-). שאפו בזהירות את הסופרנאטנט ככל האפשר מבלי להפריע לאגרגטים. הוסף 2-5 מ”ל של אנזים דיסוציאציה תאים שחומם מראש, בהתאם לגודל הכדור, ודגר על התאים במשך כ -10 דקות ב 37 ° C באמבט מים. השהה מחדש בעדינות את הצברים המשוקעים כל 2 דקות עד שהאגרגטים יתנתקו.הערה: יש לקבל תרחיף תאים כמעט הומוגני לאחר 7-10 דקות של דגירה. הוסף את הנפח המשולש של תווך NBM שחומם מראש והשהה מחדש את התאים בזהירות כדי להבטיח סינגולריזציה של התא. קבע את מספרי התאים והעבר את הנפח המתאים לשימור בהקפאה לצינור של 15 מ”ל או 50 מ”ל.הערה: צפיפות תאים של 5-10 × 106 תאים/מ”ל של תווך הקפאה מומלצת. צנטריפוגה את התאים ב 300 × גרם במשך 3 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשעו בעדינות את גלולת התא בנפח המתאים של מדיום הקפאה המכיל 10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO). Aliquot את תרחיף התא בבקבוקונים מתאימים להקפאה (1 מ”ל / בקבוקון). מעבירים את הבקבוקונים מיד למיכל הקפאה מצונן ואיטי מלא ב-2-פרופנול ומניחים את המיכל על -80°C למשך הלילה. הניחו את הבקבוקונים בטמפרטורה של -150°C למחרת לאחסון לטווח ארוך.הערה: 2-פרופנול נוזלי הוא דליק מאוד ועלול לגרום נזק לעין במגע. יש להרחיק מחום וללבוש כפפות מגן כמו גם משקפיים. 5. הבשלה של נוירונים שמקורם ב-hiPSC בתרביות חד-שכבתיות הכינו צלחות תרבית מצופות פולי-L-אורניתין/למינין לטיפוח ארוך טווח של נוירונים שמקורם ב-hiPSC.לדלל את תמיסת מלאי poly-L-ornithine ל 0.001% ב 1x DPBS (-/-) ולצפות את הכלים לילה ב 4 ° C, או במשך 4 שעות ב 37 ° C. שאפו את תמיסת פולי-L-אורניתין ושטפו את הצלחות פעם אחת עם 1x DPBS (-/-). לדלל את תמיסת הלמינין ב 1x DPBS (-/-) לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ”ל ולדגור את הכלים לילה ב 4 ° C, או במשך 4 שעות ב 37 ° C.הערה: נפח של 0.1-0.15 מ”ל לסמ”ר 2 מומלץ עבור הליכי הציפוי, ו- 0.2 מ”ל לס”מ2 עבור כל שלבי הכביסה המתאימים. ניתן להשתמש במצעי ציפוי חלופיים, אך יש להעריך השפעות אפשריות על חיבור התאים והבשלתם. הפשירו את התאים השמורים. לשם כך, מניחים את הקריוביאל באמבט מים (מוגדר ל -37 מעלות צלזיוס) ומערבלים אותו במשך כדקה, עד שנותר גוש קטן של השעיית תאים קפואים. בזהירות להעביר את ההשעיה התא טיפה צינור 15 מ”ל מוכן עם 10 מ”ל של NBM מחומם מראש. שטפו את הקריוביאל עם 1 מ”ל של NBM והעבירו את תרחיף התא לצינור זהה של 15 מ”ל. צנטריפוגה את התאים ב 300 × גרם במשך 3 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והוסיפו 1-2 מ”ל של NIM בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר. השהה מחדש את גלולת התא בזהירות וקבע את מספרי התא. שאפו את תמיסת הלמינין הנותרת מצלחות תרבית התאים המצופים וזרעו את התאים בצפיפות זריעה של 1 × 105 תאים לסמ”ק2 ב- NIM בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר. החלף את המדיום לאחר 24 שעות ל- NIM ללא מעכב ROCK. בצע שינויים בינוניים יומיים במשך 4 ימים. לאחר שלב ראשוני זה של השראת NGN2, יש להשמיט את ה-DOX ולתרבת את התאים ב-NBM, עם שינויי חצי מדיה 2 פעמים בשבוע עד שמגיעים לשלב ההבשלה הרצוי.הערה: תרבית משותפת של נוירוני iNGN2 עם אסטרוציטים מומלצת כדי להגביר את הישרדות התא, התקשרות, בגרות ופעילות חשמלית13,22. 6. אפיון נוירונים שמקורם ב-hiPSC הערה: ניתן להעריך את ההבחנה לנגזרות עצביות באמצעות הטכניקות הבאות. אימונוציטוכימיה והדמיהשאפו את המדיום מהנוירונים שמקורם ב-hiPSC ושטפו את התאים פעם אחת עם 1x DPBS עם Ca 2+ ו-Mg2+ (+/+).הערה: פיפטה בזהירות, עדיף על קצוות הבאר כמו תאים עשויים להתנתק בקלות רבה מן פני השטח. נפח של 0.2 מ”ל לסמ”ר2 מומלץ לכל שלבי הכביסה כדי להבטיח כיסוי מלא של תאים עם 1x DPBS (+/+). תקן את התאים העצביים באמצעות תמיסת קיבוע המכילה 4% paraformaldehyde ב- DPBS (+/+) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT). מומלץ נפח של 0.1 מ”ל לסמ”ר 2 .הערה: פרפורמלדהיד (4%) ב-DPBS הוא תמיסה מסוכנת ומגרה את העור עם רעילות חריפה וקרצינוגניות פוטנציאלית. יש להרחיק מחום, ללבוש כפפות מגן ומשקפיים, להימנע משאיפה ולהשתמש בתמיסה רק בסביבה מאווררת. שטפו בעדינות את התאים 2x ב-1x DPBS (+/+) והמשיכו עם הצביעה.הערה: ניתן לאחסן תאים קבועים ב- DPBS (+/+) ב- 4 ° C למשך עד חודש אחד עד לעיבוד נוסף. שאפו את ה-DPBS (+/+) מדגימות. חדור לתאים וחסום אתרי קישור לא ספציפיים עם 1x DPBS (+/+) המכיל 1% BSA ו- 0.2% Triton-X-100 למשך 60 דקות ב- RT.הערה: מומלץ נפח של 0.2 מ”ל לס”מ2 . הסר את הסופרנאטנט ודגר על התאים למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס, כאשר נוגדנים ראשוניים בהתאמה מדוללים במאגר צביעה (1x DPBS [+/+] המכיל 1% BSA) (ראה טבלת חומרים). ודא כי התאים מכוסים לחלוטין על ידי תמיסה.הערה: מומלץ נפח של 0.1-0.15 מ”ל לסמ”ר 2 . שאפו את חיץ הצביעה ושטפו את התאים 3x ב-1x DPBS (+/+). לדלל את הנוגדנים המשניים המתאימים (ראה טבלת חומרים) בחיץ צביעה בריכוז סופי של 1:1,000. לדגור על התאים בתמיסת נוגדנים מדוללת במשך שעה אחת ב- RT בחושך. ודא כי התאים מכוסים לחלוטין על ידי תמיסה.הערה: מומלץ נפח של 0.1-0.15 מ”ל לסמ”ר 2 . שאפו את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטפו את התאים 2x ב-1x DPBS (+/+). מכתימים את הגרעינים עם 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), מדולל ב-DPBS (+/+) למשך 5 דקות ב-RT.הערה: מומלץ נפח עבודה של 0.1-0.15 מ”ל לס”מ2 . שטוף את התאים 2x ב 1x DPBS ( +/+). אחסן את התאים ב- DPBS (+/+) ב- 4 °C עד להדמיה.הערה: הדמיית Brightfield מתאימה למעקב אחר שינויים מורפולוגיים וצמיחת נוירוטים. בנוסף, ביטוי סמן סטריאוטיפי ניתן להעריך על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בעוד hiPSCs בלתי ממוינים מבטאים OCT 3/4 ו- NANOG, בטא-III-טובולין (TUBB3) וחלבון הקשור למיקרוטובול 2 (MAP2) עשויים לשמש כסמנים עצביים להדמיית נוירוטים ואקסונים. ניתן להעריך עוד יותר את הרשת העצבית על ידי קביעת אורך הנוירוט בתמונות שדה בהיר או פלואורסצנטי. ניתוח ביטוי גנים על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qPCR)שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעם ב-1x DPBS (-/-).הערה: מומלץ נפח של 0.2 מ”ל לס”מ2 . מוסיפים חיץ RNA ליזיס קר וקוצרו את התאים על ידי גירוד. בודדו את הרנ”א באמצעות ערכה מתאימה מבוססת עמודה, וקבעו את ריכוזי הרנ”א על ידי פוטוספקטרומטריית UV. צור cDNA באמצעות 250 ננוגרם של RNA כולל וערכה מתאימה לשעתוק לאחור. הכן תגובות qPCR משואות מולקולריות המכילות 2.5 ng של cDNA כפול. השתמש בתערובת אב מתאימה ובמבחני פריימר20 מתאימים (ראה טבלת חומרים). הפעל את ה- qPCR על ידי החלת 45 מחזורים עם חישול פריימר ב- 60 ° C למשך 20 שניות. נרמלו את רמות ביטוי הגנים היחסיות לממוצע של הגנים GAPDH, HPRT1 ו-GUSB. החל את שיטת ΔΔCt23, תוך שימוש ב- hiPSCs בלתי מובחנים ככיול.

Representative Results

במהלך השלבים הראשונים, תרביות דבק של hiPSCs מנותקות, ייחודיות ומועברות לתרחיף (איור 2). אגרגטים נוצרים בתוך 24 שעות וגדלים ברציפות בגודל. לאחר יומיים של השראת טרנסגנים, נוירונים מוקדמים יכולים להישמר בהקפאה לניסויים הבאים. ההתפשטות המתמשכת בימים הראשונים של ההשעיה מניבה עלייה במספר התאים, ומגיעה לשיאה לאחר יומיים של זירוז (איור 3A,B). יחד עם ההתפשטות, האגרגטים מתחילים לגדול. בהשוואה ליום 0, הקוטר מראה עלייה של 50% ביום 2, והוא כמעט הוכפל ביום 5 (איור 3D). אף על פי שקוטר הולך וגדל מגביל את אספקת חומרי המזון בתוך האגרגטים, יכולת הקיום של התאים אינה מושפעת ביום 2 או ביום 5 להתמיינות (איור 3C). אולם גידול ממושך במשך יותר מ-4 ימים בתרחיף אינו משפר עוד יותר את תפוקת התאים, מאחר שהאגרגטים נעשים עמידים יותר ויותר לסינגולריזציה אנזימטית (איור 3B). לאחר שימור בהקפאה, תאי יום 2 מופשרים ומצופים על כלים מצופים פולי-L-אורניתין (PLO)-למינין להבשלה סופנית. באופן כללי, תאים נצמדים היטב לאחר הפשרה, ומתחילים להאריך נוירוטים בשלב מוקדם. פרופיל ביטוי הגנים הרקתי, כמו גם צביעה אימונוציטוכימית עבור הסמנים העצביים TUBB3 ו-MAP2, מאשרים את זהות התא העצבי (איור 4A,B). בנוסף לרמות העולות של TUBB3 ו-MAP2, תרביות עצביות מועשרות בתעתיקי טאו של חלבון הקשור למיקרוטובולים (MAPT), המקודדים חלבון עצבי המעורב בייצוב אקסונים, ומראות ירידה במקביל בביטוי גורם השעתוק המווסת פלוריפוטנציה POU5F1. יתר על כן, רשת עצבית צפופה נוצרת בשבוע הראשון לאחר ההפשרה (איור 4C). שינויים מורפולוגיים אלה, בשילוב עם פרופיל השעתוק, מצביעים על הבשלה הולכת וגוברת של התרביות העצביות. איור 2: יצירת תאי עצב iNGN2 שמקורם ב-hiPSC באמצעות ביוריאקטור בנצ’טופ. (A) סקירה סכמטית של פרדיגמת ההתמיינות, המדגישה את שלבי המפתח של תרבית תאים. (ב-ו) תמונות Brightfield ממחישות (B) hiPSCs ו-(C,D) היווצרות אגרגטים בביוריאקטור הספסל. (E,F) תאי עצב iNGN2 מרחיבים את תאי העצב ועוברים שינויים מורפולוגיים במהלך ההתמיינות. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: BMM = מטריצת קרום מרתף; iPSC-MM = אמצעי תחזוקה iPSC; אש”ף = פולי-L-אורניתין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: תפוקת תאים וכדאיות במהלך היווצרות וגדילה של תאים. (A) תמונות ברייטפילד מתארות את היווצרות האגרגטים בתוך יומיים מהתרבית בביוריאקטור הספסל, כמו גם את הגידול בגודל המצרפיים לאורך זמן. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) כימות תפוקת התא ו-(C) כדאיות לאורך מסלול ההתמיינות. תרשימי עמודות מייצגים את הממוצע + SD מארבעה ניסויים בלתי תלויים. (D) הקוטר, המעיד על גודל האגרגטים, נקבע באופן חצי אוטומטי באמצעות תוכנת הקוד הפתוח ImageJ (גרסה 1.53). ראשית, תמונות שדה בהיר הומרו לתמונות בינאריות, ולאחר מכן הוערכו עוד יותר באמצעות הכלי ניתוח חלקיקים, תוך החלת הפרמטרים הבאים: גודל > 2,500 מיקרומטר2, מעגליות 0.45-1, לא לכלול קצוות, ולכלול חורים. קווים אופקיים מציינים את הממוצע ± SD של חמישה הבדלים בלתי תלויים. נקודות בודדות מייצגות את הממוצע של ניסויי התמיינות בודדים עם לפחות 20 אגרגטים לכל נקודת זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: אפיון תאי עצב iNGN2 שמקורם ב-hiPSC. פרופיל ביטוי גנים טמפורלי עבור הגנים העצביים TUBB3, MAP2 ו- MAPT, כמו גם הגן הקשור לתאי גזע פלוריפוטנטיים POU5F1. רמות הביטוי היחסיות נורמלו לגני הייחוס GAPDH, HPRT1 ו-GUSB. hiPSCs בלתי מובחנים (יום-2) נבחרו ככיול. הסמלים הגיאומטריים מציינים את הממוצע ± SD של ארבעה הבדלים בלתי תלויים. (B) תמונות מייצגות של תאי עצב iNGN2 ביום 7 לאחר ההפשרה (יום-2+7), מוכתמים עבור בטא-III-טובולין (TUBB3, מגנטה) וחלבון הקשור למיקרוטובול 2 (MAP2, ציאן). גרעיני התא הוכתמו ב-DAPI. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. (C) הערכת הרשת העצבית בתמונות שדה בהיר של תרביות עצביות לאחר הפשרה. האורך הכולל של תאי עצב נקבע באזור של 930.82 × 698.11 מיקרומטר2 באמצעות ImageJ (גרסה 1.53). לאחר התאמת הבהירות והניגודיות, התמונות הומרו לתמונות של 8 סיביות והצבעים היו הפוכים. לאחר מכן נוירוטים עברו שלד ולאחר מכן נותחו באמצעות תוספי ImageJ ‘Skeletonize’ ו-‘Analyze Skeleton’, בהתאמה. האורך הכולל של תאי העצב חולק במספר הסומות באזור העניין כדי להניב את אורך הנוירוט הממוצע / התא. תרשימי עמודות מייצגים את הממוצע + SD משלושה ניסויים בלתי תלויים. קיצורים: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

הביטוי החוץ רחמי של גורם השעתוק העצבי NGN2 הוכח בעבר כמאיץ שלבים מוקדמים של התמיינות עצבית וגורם למחויבות לשושלת עצבית ב- hiPSCs תוך שבוע אחד מהטיפוח12,13,20. עבודה זו מתארת פרוטוקול מפורט להתמיינות של BIONi010-C-13 hiPSCs ערוכים גנטית לנוירונים iNGN2 באמצעות ביוריאקטור benchtop.

CERO 3D bioreactor הוא ביוריאקטור בנפח נמוך עם ארבעה חריצים עבור צינורות מיוחדים, כל אחד עם קיבולת מקסימלית של 50 מ”ל. הטמפרטורה ורמות ה-CO2 נשלטות ברציפות ופרמטרי הגידול (למשל, מהירות סיבוב וזמן) מוסדרים עבור כל צינור, מה שמאפשר למשתמשים להריץ מספר גישות בידול במקביל. שוברי גלים משולבים על דופן הצינור הפנימי מאפשרים הפרעה של התווך עם לחץ גזירה נמוך ושומרים על אגרגטים תלת ממדיים במתלים במהלך סיבוב מבוקר. גישה מוגבלת לחומרים מזינים, כמו גם אינטראקציות תלת-ממדיות של תאים ומטריצה חוץ-תאית (ECM), עשויות להשפיע באופן משמעותי על התמיינות התא והתנהגותו24,25,26,27.

תרבית תאים כצברים תלת-ממדיים בתרחיף מגדילה את האינטראקציות בין התאים הללו, ובכך מחקה את סביבת in vivo של רקמות או איברים באופן הדוק יותר28. ההפרעה המקבילה של התווך מווסתת את גודל המצרף עקב חיכוך מכני, משפרת את חילוף הגזים ומפחיתה את שיפוע חומרי המזון והפסולת בצינור, תוך שמירה על שיפועים פיזיולוגיים רלוונטיים בתוך הצברים 29,30,31,32,33,34. למרות ששינויים בינוניים מבוצעים באופן ידני, הביוריאקטור מפחית את עלויות העבודה והתפעול בהשוואה לצלוחיות תרבית סטטיות. הביוריאקטור מציע גם מספר יתרונות על פני ביוריאקטורים אוטומטיים לחלוטין, שכן העיצוב נטול האימפלר מפחית את לחץ הגזירה ההידרודינמי על פני השטח המצרפיים, ובכך לא רק משפר את הישרדות התא, אלא גם מגביל את ההשפעות של לחץ גזירה על תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים רגישים, התמיינות תאים ותפקוד35,36,37,38.

ביוריאקטורים של גלגל אנכי, שבהם תאים נסערים על ידי אימפלר אנכי גדול, כמו גם ביוריאקטורים מתנדנדים באמצעות שקיות תרבית מנופחות המחוברות לפלטפורמה ממונעת, מייצגים פלטפורמות מתלה תלת-ממדיות חלופיות. למרות שנבדקו יתר על המידה לגידול hiPSCs 17,18,19,39,40, מעט ידוע על יישומם בגישות התמיינות עצבית, והדיווחים מוגבלים להתרחבות מוצלחת של תאים מקדימים עצביים של יונקים ובני אדם בביוריאקטורים 41,42,43,44, עם מספר נדיר של מחקרים המתמקדים התבגרות44,45. באופן כללי, פלטפורמות מתלים תלת-ממדיות אוטומטיות מציעות את היתרון של שינויי ביניים אוטומטיים לחלוטין ומבוקרי מחשב, ובכך מפחיתות את השונות בטיפול וממזערות את הסיכון לזיהום. יתר על כן, פרמטרים תזונתיים כגון ריכוז לקטט וגלוקוז ניתן לנטר ברציפות. עם זאת, הקמת מערכות אלה דורשת לעתים קרובות השקעה ראשונית משמעותית, שטח מעבדה, והכשרה של כוח אדם מוסמך. הביוריאקטור הבנצ’טופ מייצג חלופה קומפקטית וקלה לשימוש לגידול תאים בתרחיף, אך אינו מספק ניטור מקביל של חומרים מזינים.

כמו ברוב הפרוטוקולים המשמשים לטיפוח תאים בפלטפורמות השעיה תלת-ממדיות, היווצרות ראשונית של אגרגטים מייצגת צעד קריטי. hiPSCs מתורבתים כחד-שכבות דבקות ולאחר מכן מועברים כתרחיפים חד-תאיים לסביבה תלת-ממדית. כדי למזער את אובדן התאים בשלב זה, יש לקחת בחשבון מספר היבטים. תכנון הצינורות עם שוברי הגלים המשולבים פירושו שנדרש נפח תרבית מינימלי של 10 מ”ל לכל צינור כדי להבטיח הפרעה בינונית אופטימלית. לכן אין להמעיט בנפח הקריטי בטווח הארוך. יתר על כן, צפיפות זריעה התחלתית של 7.5 מיליון תאים לכל 10 מ”ל נפח תרבית, ומהירות סיבוב של 60 סל”ד, מומלצת מאוד ליצירת אגרגטים יציבים בטווח הקצר, אם כי התאמות עשויות להיות נחוצות בהתאם לקו התא.

לאחר העברת hiPSCs להשעיה, אגרגטים צריכים להיווצר בתוך 24 שעות. השינוי הבינוני הראשון הוא קריטי, מכיוון שהאגרגטים קטנים ועלולים שלא להתיישב כראוי. זמן שקיעת האגרגטים יכול להיות מוארך אך לא יעלה על יותר מ -10 דקות, מכיוון שצברים עשויים להתחיל להתגבש ולגדול בצורה הטרוגנית. במהלך השאיפה, נפח תרבית מינימלי של 5 מ”ל יש להשאיר בצינור, וכל הפרעות של המדיום יש להימנע. עם זאת, אובדן של תאים וצברים צפוי במהלך השלבים הראשונים. ספירת תאים מצביעה על תפוקת תאים קבועה במהלך היומיים הראשונים בתרבית, מה שמצביע על כך שיכולת ההתרבות הגבוהה של hiPSCs מפצה על אובדן התאים הראשוני. ברגע שהם בהשעיה, הטיפוח וההפרעה העדינים מובילים לצברים בגודל הומוגני שמתחילים לצמוח עם הזמן.

התמיינות עצבית בוצעה על פי פרוטוקול שפורסם בעבר המבוסס על ביטוי יתר NGN2 המושרה על ידי דוקסיציקלין13, והצעדים הבודדים עברו אופטימיזציה לגידול תלת ממדי. גורם השעתוק העצבי NGN2 הוא מניע מתואר היטב בהתמיינות עצבית ומאיץ אינדוקציה עצבית באופן משמעותי11,13,46. בעוד שדפוסים קונבנציונליים עם גורמי גדילה מוגדרים אורכים מספר שבועות עד חודשים 7,8,9, ביטוי NGN2 גורם לגורל תאי עצב תוך ימים. בנוסף לקיצור זמן הגידול, הפרוטוקול אינו תלוי בגורמי גדילה יקרים או בציפוי מטריצות לתרבית התרחיף הראשונית, ובכך מוזיל את עלויות הגידול בנוסף.

יתר על כן, השוואה ישירה של דור NGN2 של נוירונים לא בוגרים בתרביות דבק ותרחיף חשפה גידול של פי 1.36 בתאים לאחר 4 ימים בתרבית באמצעות ביוריאקטור20, בעוד נפח התווך הדרוש לייצור של מיליון תאים צפוי להיות חצי חצי. לכן, שימוש בביוריאקטור מסוג benchtop לייצור נוירונים iNGN2 עשוי להיות מועיל, שכן ניתן לייצר מספר גבוה יותר של תאים עם זמן טיפול ועלות נמוכים יותר. בהתאם לדיווחים קודמים, מחויבות לשושלת עצבית נצפתה בשלב מוקדם. לאחר יומיים של השראת NGN2, ניכר ביטוי עמוק של סמנים עצביים קלאסיים כגון TUBB3, MAP2 ו- MAPT, התומכים בתחולת הביוריאקטור הבנצ’טופ להשראת נוירונים. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן להשיג כ-6.2 מיליון נוירוני iNGN2 לא בשלים ממיליון תאי גזע גזעיים (HiPSCs) תוך 4 ימים מהתרבית. עם זאת, קיבולת התפוקה עשויה להשתנות בין אצוות שונות ותלויה בנפח תרבית ההשעיה בעת הזריעה.

כדי להגדיל את היבול עוד יותר, זמן הגידול הוארך ב -3 ימים נוספים; עם זאת, למרות שהאגרגטים נעשו גדולים יותר, הם גם הפכו קומפקטיים מאוד ולא ניתן היה לנתק אותם כראוי לצורך שימור בהקפאה או ציפוי מחדש. למרות ההתקדמות בגישות של תרביות תלת-ממדיות, תרביות נוירונים דו-ממדיות הן עדיין תקן הזהב לניתוחים פונקציונליים כמו מערכי מיקרואלקטרודות או הדמיית סידן. סינגולריזציה של תאים היא לפיכך תנאי מוקדם חשוב עבור מונושכבה עצבית הומוגנית ורשת עצבית. ניתן להשתמש בניתוק מכני חזק יותר של התאים או בריאגנטים קשים של דיסוציאציה כדי להבטיח סינגולריזציה, אך עם השפעות פוטנציאליות על יכולת הקיום של התא, הפיזיולוגיה ויכולת ההתקשרות מחדש47,48. באשר לצורך בתאים בודדים לניתוחים והתבגרות נוספים, הצברים נותקו לאחר 4 ימים בהשעיה, והנוירונים (יום 2) iNGN2 נשמרו בהקפאה. התמיינות ואפיון של נוירונים iNGN2 לאחר הפשרה אישרו בגרות גוברת של התרביות העצביות והיווצרות רשת עצבית צפופה.

הפרוטוקול המסופק מניב מספר גבוה של נוירונים iNGN2. עם זאת, יש לקחת בחשבון מספר מגבלות. באשר לרוב פלטפורמות תרביות ההשעיה, העברת hiPSCs מתרבות דבקה דו-ממדית לסביבה תלת-ממדית היא קריטית וקשורה לעתים קרובות לאובדן תאים עמוק. אובדן משמעותי נוסף של תאים ומצרפיים צפוי במהלך שינויים במדיה. בהשוואה לפלטפורמות אוטומטיות, זמן הטיפול וסיכוני הזיהום באמצעות הביוריאקטור הבנצ’טופ גדלים, מכיוון שיש לבצע שינויים בינוניים באופן ידני. מלבד היעדר אוטומציה, הביוריאקטור אינו מציע את האפשרות לפקח על החומרים המזינים, והקיבולת המקסימלית של 50 מ”ל לכל צינור מגבילה את פוטנציאל השדרוג של הפרוטוקול. לבסוף, חשוב לציין כי למרות ש-NGN2 מאיץ את מחויבות השושלת העצבית, משך ההתבגרות הסופנית אינו מתקצר ועדיין דורש תרבית ארוכת טווח במשך מספר שבועות. בהתחשב בחשיבות התמיכה האסטרוציטית לתפקוד עצבי, התקשרות והישרדות 49,50,51, יש לשקול גישות של תרבות משותפת, ועשויות אפילו להיות חיוניות לטיפוח לטווח ארוך.

לסיכום, פרוטוקול התמיינות דו-ממדי תורגם בהצלחה לסביבה תלת-ממדית לייצור מהיר וניתן לשחזור של נוירוני iNGN2 על ידי יישום ביו-ריאקטור בנצ’טופ. הפרוטוקול המתואר מניב כמויות גבוהות של נוירונים באיכות טובה, שמקורם ב-iPSC, אשר עשויים לשמש כנקודת מוצא לבדיקות מודל מורכבות, בדיקות תרופות בתפוקה גבוהה ומבחני רעילות בקנה מידה גדול.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרויקט EBiSC2 קיבל מימון מיוזמת התרופות החדשניות 2 Joint Undertaking (JU) תחת הסכם מענק מספר 821362. JU מקבל תמיכה מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי ומ- EFPIA. אנו מודים לנדין סמנדזיץ’, הלן ד. מ. המר, ג’ון-מג’ד בלסטרס וונסה מ. נלוואג’ה על עזרתם בניתוחים אימונוציטוכימיים וביטוי גנים, כמו גם להייקה ארת’ן על תמיכתה הטכנית המצוינת. יתר על כן, אנו מודים לסטפני בר על הקמת תוכנית הביוריאקטורים. איור 2A נוצר באמצעות BioRender.com.

Materials

2-Mercaptoethanol 50 mM Gibco  11528926
60 mm Nunclon Delta Surface Nunc 734-2040
Anti-beta III Tubulin antibody [TU-20] (dilution 1:1,000) Abcam   ab7751 
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific   10400745
B-27 Supplement (50x)  Gibco 11530536 serum-free Supplement (50x)
BIONi010-C-13 hiPSC line European Bank for induced pluripotent Stem Cell (EBiSC), BIONEER as Depositor SAMEA103988285 Bioneer is depositor in EBiSC and owner of the hiPSC line.
Biorender  Biorender.com
BSA Cell Culture grade Thermo Fisher Scientific   12330023
CERO 3D Incubator & Bioreactor OLS OMNI Life Science 2800000
CEROtubes Cell culture Tubes 50 mL OLS OMNI Life Science 2800005
Citavi 6 Swiss Academic Software
CryoStor CS10 Stemcell 7930 freezing medium containing 10% DMSO
Cytofix Fixation Solution BD Biosciences  554655 fixation solution containing 4% paraformaldehyde 
DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN)  Thermo Fisher Scientific   12333553
Doxycycline hydrochloride (DOX) Sigma-Aldrich D3447
DPBS without Calcium and Magnesium (DPBS -/-)  Gibco 14190250
DPBS with Calcium and Magnesium (DPBS +/+)  Gibco 11580456
DMEM/F12 (-/-) Gibco 21331-020
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement Gibco 31331-028
EVOS XL Core Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific   A21424
GlutaMAX supplement  Gibco  35050-038 stabilized L-alanyl-L-glutamine dipeptid
ImageJ 1.51v  National Institute of Health
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278l
Laminin Merck L2020
MACSQuant Analyzer Miltenyi
MAP2 Monoclonal Antibody (dilution 1: 300) Thermo Fisher Scientific   13-1500 
Matrigel Growth factor reduced, phenol-red free  Corning Life Science  356231 basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Gibco  11140035
MicroAmp Optical Adhesive Film Kit  Thermo Fisher Scientific   10095714
mTeSR1 Stemcell 85850 feeder-free iPSC maintenance medium 
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502-048 serum-free Supplement based on Bottenstein’s N-1 formulation
Neurobasal Medium Gibco 11570556
Nikon Eclipse TS2 Nikon Instruments Europe B.V.
NucleoCounter-NC200 ChemoMetec A/S
Origin 2021 OriginLab
Penicillin-Streptomycin Gibco 11548876
Perm/Wash Buffer  BD Biosciences  554723
Primer assay TUBB3(Hs00801390_s1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay GAPDH (Hs99999905_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay GUSB (Hs99999908_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay HPRT1 (Hs99999909_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay MAP2 (Hs00258900_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay MAPT (Hs00902194_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay POU5F1 (Hs04260367_gH) Thermo Fisher Scientific 11620099
Poly-L-ornithine 0.01% Merck P4957
RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit Qiagen 74034 column-based RNA isolation kit
RLT Buffer Qiagen 79216 cell lysis buffer
Sodium Pyruvat (100 mM) Gibco 12539059
StemPro Accutase Gibco 11599686 cell dissociation enzyme
TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX Thermo Fisher Scientific   11380912 qPCR master mix
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
TrypLE Select Enzym Gibco 12563-011 Trypsin-EDTA solution
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G
Via1-Cassette ChemoMetec A/S 941-0012
Wide Bore Filtered Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 10088880
X20 OPTICAL 96WELL FAST CLEAR REACTION PLATES  Thermo Fisher Scientific 15206343
Y-27632 dihydrochloride, Rho kinase inhibitor (ROCK inhibitor) Abcam ab120129
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feigin, V. L., et al. The global burden of neurological disorders: translating evidence into policy. The Lancet. Neurology. 19 (3), 255-265 (2020).
  2. Olesen, J., Gustavsson, A., Svensson, M., Wittchen, H. -. U., Jönsson, B. The economic cost of brain disorders in Europe. European Journal of Neurology. 19 (1), 155-162 (2012).
  3. Preclinical Development: The Safety Hurdle Prior to Human Trials. American Pharmaceutical Review Available from: https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/187349-Preclinical-Development-The-Safety-Hurdle-Prior-to-Human-Trials (2016)
  4. van Norman, G. A. Phase II trials in drug development and adaptive trial design. JACC. Basic to Translational Science. 4 (3), 428-437 (2019).
  5. van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: part 2: potential alternatives to the use of animals in preclinical trials. JACC. Basic to Translational Science. 5 (4), 387-397 (2020).
  6. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  7. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  8. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  9. Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS One. 8 (3), 59252 (2013).
  10. Hulme, A. J., Maksour, S., St-Clair Glover, M., Miellet, S., Dottori, M. Making neurons, made easy: the use of Neurogenin-2 in neuronal differentiation. Stem Cell Reports. 17 (1), 14-34 (2022).
  11. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  12. Schmid, B., et al. Generation of two gene edited iPSC-lines carrying a DOX-inducible NGN2 expression cassette with and without GFP in the AAVS1 locus. Stem Cell Research. 52, 102240 (2021).
  13. Shih, P. -. Y., et al. Development of a fully human assay combining NGN2-inducible neurons co-cultured with iPSC-derived astrocytes amenable for electrophysiological studies. Stem Cell Research. 54, 102386 (2021).
  14. Chang, C. -. Y., et al. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-based neurodegenerative disease models for phenotype recapitulation and drug screening. Molecules. 25 (8), 2000 (2000).
  15. Silva, M. C., Haggarty, S. J. Human pluripotent stem cell-derived models and drug screening in CNS precision medicine. Annals of the New York Academy of Sciences. 1471 (1), 18-56 (2020).
  16. Elanzew, A., Sommer, A., Pusch-Klein, A., Brüstle, O., Haupt, S. A reproducible and versatile system for the dynamic expansion of human pluripotent stem cells in suspension. Biotechnology Journal. 10 (10), 1589-1599 (2015).
  17. Davis, B. M., Loghin, E. R., Conway, K. R., Zhang, X. Automated closed-system expansion of pluripotent stem cell aggregates in a rocking-motion bioreactor. SLAS Technology. 23 (4), 364-373 (2018).
  18. Kropp, C., et al. Impact of feeding strategies on the scalable expansion of human pluripotent stem cells in single-use stirred tank bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 5 (10), 1289-1301 (2016).
  19. Borys, B. S., et al. Overcoming bioprocess bottlenecks in the large-scale expansion of high-quality hiPSC aggregates in vertical-wheel stirred suspension bioreactors. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 55 (2021).
  20. Kwok, C. K., et al. Scalable expansion of iPSC and their derivatives across multiple lineages. Reproductive Toxicology. 112, 23-35 (2022).
  21. User Protocol for Human induced Pluripotent Stem Cells. EBiSC Available from: https://ebisc.org/docs/ebisc/EBiSC_User_Protocol_for_Human_induced_Pluripotent_Stem_Cells.pdf (2023)
  22. Neyrinck, K., et al. SOX9-induced generation of functional astrocytes supporting neuronal maturation in an all-human system. Stem Cell Reviews and Reports. 17 (5), 1855-1873 (2021).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  25. Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Engineering. Part A. 15 (2), 205-219 (2009).
  26. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  27. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  28. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
  29. Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Effects of hydrodynamics on cultures of mammalian neural stem cell aggregates in suspension bioreactors. Industrial and Engineering Chemical Research. 40 (23), 5350-5357 (2001).
  30. Gerecht-Nir, S., Cohen, S., Itskovitz-Eldor, J. Bioreactor cultivation enhances the efficiency of human embryoid body (hEB) formation and differentiation. Biotechnology and Bioengineering. 86 (5), 493-502 (2004).
  31. Zhao, F., et al. Effects of oxygen transport on 3-d human mesenchymal stem cell metabolic activity in perfusion and static cultures: experiments and mathematical model. Biotechnology Progress. 21 (4), 1269-1280 (2005).
  32. Cimetta, E., Figallo, E., Cannizzaro, C., Elvassore, N., Vunjak-Novakovic, G. Micro-bioreactor arrays for controlling cellular environments: design principles for human embryonic stem cell applications. Methods. 47 (2), 81-89 (2009).
  33. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Engineering. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
  34. Sargent, C. Y., et al. Hydrodynamic modulation of embryonic stem cell differentiation by rotary orbital suspension culture. Biotechnology and Bioengineering. 105 (3), 611-626 (2010).
  35. Liu, N., Zang, R., Yang, S. -. T., Li, Y. Stem cell engineering in bioreactors for large-scale bioprocessing. Engineering in Life Sciences. 14 (1), 4-15 (2014).
  36. Wolfe, R. P., Leleux, J., Nerem, R. M., Ahsan, T. Effects of shear stress on germ lineage specification of embryonic stem cells. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (10), 1263-1273 (2012).
  37. Wolfe, R. P., Ahsan, T. Shear stress during early embryonic stem cell differentiation promotes hematopoietic and endothelial phenotypes. Biotechnology and Bioengineering. 110 (4), 1231-1242 (2013).
  38. Shafa, M., et al. Impact of stirred suspension bioreactor culture on the differentiation of murine embryonic stem cells into cardiomyocytes. BMC Cell Biology. 12 (1), 53 (2011).
  39. Kwok, C. K., et al. Scalable stirred suspension culture for the generation of billions of human induced pluripotent stem cells using single-use bioreactors. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1076-1087 (2018).
  40. Rodrigues, C. A. V., et al. Scalable culture of human induced pluripotent cells on microcarriers under xeno-free conditions using single-use vertical-wheel™ bioreactors. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 93 (12), 3597-3606 (2018).
  41. Gilbertson, J. A., Sen, A., Behie, L. A., Kallos, M. S. Scaled-up production of mammalian neural precursor cell aggregates in computer-controlled suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 94 (4), 783-792 (2006).
  42. Baghbaderani, B. A., et al. Expansion of human neural precursor cells in large-scale bioreactors for the treatment of neurodegenerative disorders. Biotechnology Progress. 24 (4), 859-870 (2008).
  43. Baghbaderani, B. A., et al. Bioreactor expansion of human neural precursor cells in serum-free media retains neurogenic potential. Biotechnology and Bioengineering. 105 (4), 823-833 (2010).
  44. Serra, M., Brito, C., Costa, E. M., Sousa, M. F. Q., Alves, P. M. Integrating human stem cell expansion and neuronal differentiation in bioreactors. BMC Biotechnology. , 82 (2009).
  45. Zhao, S., et al. Generation of cortical neurons through large-scale expanding neuroepithelial stem cell from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 431 (2020).
  46. Pawlowski, M., et al. Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
  47. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
  48. Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2016).
  49. Allen, N. J. Astrocyte regulation of synaptic behavior. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 439-463 (2014).
  50. Verkhratsky, A., Nedergaard, M., Hertz, L. Why are astrocytes important. Neurochemical Research. 40 (2), 389-401 (2015).
  51. Jäkel, S., Dimou, L. Glial cells and their function in the adult brain: a journey through the history of their ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 24 (2017).

Tags

3D Suspension BioreactorHuman Neurogenin 2-inducible NeuronsInduced Pluripotent Stem CellsIPSC CultureNeuronal DifferentiationHigh-throughput ScreeningRapid And Cost-efficient GenerationCardiomyocytesPre-cultivationTrypsinizationCell SingularizationCell CountingCell SuspensionCentrifugationFeeder-free IPSC Maintenance MediumROCK InhibitorBioreactor Cultivation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wihan, J., Karnatz, I., Sébastien, I., Kettenhofen, R., Schmid, B., Clausen, C., Fischer, B., Steeg, R., Zimmermann, H., Neubauer, J. C. Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor. J. Vis. Exp. (193), e65085, doi:10.3791/65085 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image