JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Productie van menselijke neurogenine 2-induceerbare neuronen in een driedimensionale suspensie bioreactor

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/65085
, , , , , , , , ,
1Fraunhofer Project Center for Stem Cell Process Engineering,Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering IBMT, 2Bioneer A/S, 3Fraunhofer UK Research Ltd, Technology and Innovation Centre, 4Fraunhofer Institute for Biomedical Engineering IBMT, 5Department of Molecular and Cellular Biotechnology,Saarland University, 6Facultad de Ciencias del Mar,Universidad Católica del Norte

Summary

Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in een benchtop 3D-suspensie bioreactor.

Abstract

De afleiding van neuronale afstammingscellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC’s) markeerde een mijlpaal in hersenonderzoek. Sinds hun eerste komst zijn protocollen voortdurend geoptimaliseerd en worden ze nu op grote schaal gebruikt in onderzoek en medicijnontwikkeling. De zeer lange duur van deze conventionele differentiatie- en rijpingsprotocollen en de toenemende vraag naar hoogwaardige hiPSC’s en hun neurale derivaten verhogen echter de behoefte aan de adoptie, optimalisatie en standaardisatie van deze protocollen voor grootschalige productie. Dit werk presenteert een snel en efficiënt protocol voor de differentiatie van genetisch gemodificeerde, doxycycline-induceerbare neurogenine 2 (iNGN2)-tot expressie brengende hiPSC’s in neuronen met behulp van een benchtop driedimensionale (3D) suspensie bioreactor.

Kortom, eencellige suspensies van iNGN2-hiPSC’s mochten binnen 24 uur aggregaten vormen en neuronale afstammingsverbintenis werd geïnduceerd door de toevoeging van doxycycline. Aggregaten werden gedissocieerd na 2 dagen inductie en cellen werden ofwel gecryopreserveerd of opnieuw geplateerd voor terminale rijping. De gegenereerde iNGN2-neuronen drukten al vroeg klassieke neuronale markers uit en vormden complexe neuritische netwerken binnen 1 week na replating, wat wijst op een toenemende volwassenheid van neuronale culturen. Samenvattend wordt een gedetailleerd stapsgewijs protocol voor de snelle generatie van hiPSC-afgeleide neuronen in een 3D-omgeving verstrekt dat een groot potentieel heeft als uitgangspunt voor ziektemodellering, fenotypische high-throughput medicijnscreenings en grootschalige toxiciteitstests.

Introduction

Neurologische aandoeningen zijn wereldwijd de belangrijkste oorzaak van invaliditeit1. Een op de zes mensen wordt getroffen en de incidentie blijft stijgen. De daarmee gepaard gaande financiële last voor samenlevingen en hun gezondheidszorgstelsels is enorm. In een evaluatie van 30 Europese landen in 2010 werden de jaarlijkse kosten in verband met psychische en neurologische aandoeningen geraamd op 800 miljard euro2. De toenemende sociaaleconomische last vraagt om effectieve behandelingsstrategieën, en hoewel ons begrip van ziektepathofysiologie aanzienlijk is toegenomen, is de vertaling naar klinieken vaak onvoldoende. Over het algemeen neemt slechts 12% van de geneesmiddelen deel aan klinische onderzoeken, waarvan meer dan 80% faalt in latere stadia, voornamelijk als gevolg van ondoelmatigheid of onverwachte toxiciteit 3,4. De redenen zijn divers, maar de beperkte overdraagbaarheid van dierproeven in preklinische stadia naar proeven bij mensen is steeds meer naar voren gekomen5. Menselijke in vitro cel- en weefselmodellen kunnen de kloof van interspecies translatie overbruggen, en vooruitgang in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) technologie heeft in dit opzicht een groot potentieel. hiPSC’s worden veel gebruikt in fundamenteel onderzoek en delen essentiële kenmerken met embryonale stamcellen (hESCs), zoals een bijna onbeperkte zelfvernieuwingscapaciteit en het vermogen om te differentiëren in alle drie de kiemlagen6, terwijl ethische zorgen in verband met embryovernietiging worden omzeild.

De afleiding van neuronale cellen uit hESCs, en later hiPSC’s, markeerde een mijlpaal in hersenonderzoek. Initiële differentiatieprotocollen waren gebaseerd op de toepassing van groeifactoren die kritische stappen nabootsen tijdens embryogenese, waarvan de meeste betrekking hebben op dubbele SMAD-remming in suspensie of adherente culturen 7,8,9. Volwassen neuronen zijn met succes gegenereerd, maar verschillende nadelen van deze protocollen belemmeren nog steeds hun brede gebruik bij de ontwikkeling van geneesmiddelen, zoals de lage opbrengst en hoge batch-to-batch variabiliteit van gegenereerde neuronen, evenals de uitgebreide werklast in verband met lange kweektijden. Verbeteringen zijn bereikt door de geforceerde expressie van transcriptiefactoren die kritisch betrokken zijn bij neurogenese, en leden van de neurogenine (NGN) familie, in het bijzonder NGN2, zijn geïdentificeerd als effectieve drivers10. De lentivirale gemedieerde ectopische expressie van NGN2 in hiPSC’s versnelde de vroege stadia van neuronale differentiatie aanzienlijk en induceerde het lot van neuronale cellen binnen slechts 1 week11. Daaropvolgende terminale rijping in coculturen met astrocyten leverde functionele neuronen op in hoge zuiverheid en hoeveelheid met reproduceerbare eigenschappen. Site-directed gene-editing van de adeno-associated virus integration site 1 (AAVS1) safe-harbor locus werd vervolgens toegepast om hiPSC-lijnen te creëren met een stabiele en doxycycline-induceerbare expressiecassette voor NGN212,13, waardoor ongewenste bijwerkingen van lentivirale toediening werden geminimaliseerd.

De robuuste en efficiënte differentiatie van doxycycline-induceerbare neurogenine 2 (iNGN2) neuronen heeft een groot potentieel voor high-throughput fenotypische geneesmiddelenscreenings en toxiciteitstests10,14,15; en er is aanzienlijke vooruitgang geboekt in bioprocessing in het afgelopen decennium met de implementatie van bioreactoren voor een schaalbare celuitbreiding en differentiatie16,17,18,19. De meeste differentiatieprotocollen zijn echter geoptimaliseerd voor aanhangende culturen en vertaling naar een driedimensionale (3D) omgeving vereist vaak essentiële aanpassingen. Onlangs is het succesvolle gebruik van een benchtop 3D-bioreactor met verminderde schuifspanningsfuncties gemeld voor de uitbreiding van hiPSC’s en voor de reproduceerbare differentiatie in hepatocyten, cardiomyocyten en neuronen20. Hier wordt een gedetailleerd protocol voor de generatie en karakterisering van iNGN2-neuronen verstrekt met behulp van de identieke benchtop 3D-bioreactor.

Protocol

OPMERKING: Alle celmanipulaties, evenals kweekschalen en mediumpreparaten, moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. De laminaire stromingskap moet vóór gebruik en na verwerking grondig worden gereinigd door alle oppervlakken af te vegen met 70% ethanol. Het beschreven protocol is geoptimaliseerd voor neuronale differentiaties in een CERO 3D Incubator en Bioreactor (hierna benchtop bioreactor genoemd). Deze benchtop bioreactor biedt vier sleuven voor gespecialiseerde bioreactorbuizen, elk met een maximale capaciteit van 50 ml. Temperatuur- en CO2-niveaus worden continu geregeld en teeltparameters (bijv. rotatiesnelheid en tijd) worden voor elke buis afzonderlijk geregeld. Alle aspiratiestappen zijn uitgevoerd met behulp van een afzuigpipet en vacuümpomp, tenzij anders vermeld. 1. Kweken en uitbreiden van hiPSC’s OPMERKING: De gemanipuleerde doxycycline-induceerbare NGN2 hiPSC-lijn BIONi010-C-13 wordt in dit protocol gebruikt. Het hier aangeboden uitbreidingsprotocol is geoptimaliseerd voor petrischalen van 6 cm, maar alternatieve kweekformaten kunnen indien gewenst worden gebruikt. Bedek 6 cm petrischalen met keldermembraanmatrix verdund in koude Dulbecco’s gemodificeerde Eagle’s medium (DMEM)/F12 (-/-) in een eindconcentratie van 0,083 mg/ml/10 cm2. Incubeer de gecoate gerechten bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten.OPMERKING: Een gedetailleerd protocol voor de bereiding van keldermembraanmatrixoplossing is te vinden in de instructies van de fabrikant. hiPSC’s kunnen worden gekweekt op alternatieve extracellulaire matrices voor expansie. Ontdooi gecryopreserveerde hiPSC’s volgens de EBiSC Cell line User Protocol21 in feedervrij iPSC-onderhoudsmedium + 10 μM ROCK-remmer (Y-27632). Een zaaidichtheid van 1 × 106 levensvatbare cellen per schaal van 60 mm wordt aanbevolen. Verander het medium de volgende dag naar feedervrij iPSC-onderhoudsmedium zonder ROCK-remmer en voer dagelijkse mediaveranderingen uit. Begin met passaging wanneer de hiPSC-culturen een samenvloeiing van 60% -80% bereiken. Controleer op gedifferentieerde gebieden en reinig de kolonies handmatig als het gebied groter is dan 5%.OPMERKING: Ongedifferentieerde hiPSC’s verschijnen als ronde cellen met een prominente nucleolus en minder cytoplasma. Platte en dicht opeengepakte kolonies worden vroeg na het ontdooien of passeren gevormd. Voorbeeldige brightfield-beelden van hiPSC-culturen zijn weergegeven in figuur 1. Meer informatie is te vinden in de EBiSC Cell line User Protocol21. Bereid voor het passeren van de keldermembraan matrix-gecoate gerechten en feedervrij iPSC-onderhoudsmedium voor. Zuig het medium uit hiPSC-culturen en spoel de cellen 2x met 0,5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) in 1x Dulbecco’s fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) zonder Ca 2+ en Mg2+ (DPS [-/-], zie Tabel met materialen). Verwijder het supernatant en voeg 2 ml 0,5 mM EDTA in 1x DPBS (-/-) toe aan de petrischaaltjes van 6 cm. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 3 minuten in de couveuse. Zuig 1,5 ml van de EDTA-oplossing aan en ga door met incubatie gedurende 3-5 minuten. Tik zachtjes op de gerechten om celloslating te vergemakkelijken.OPMERKING: Controleer het loskoppelen door visuele beoordeling. hiPSC-kolonies moeten na 5 minuten beginnen los te komen, maar een langere incubatietijd kan nodig zijn bij hogere confluente hiPSC-culturen. Als de kolonies niet loskomen, verhoog dan de incubatietijd tot 10 minuten, maar overschrijd dit tijdsbestek niet. Voeg 5 ml feedervrij iPSC-onderhoudsmedium toe aan de petrischaaltjes van 6 cm en resuspensie de kolonies voorzichtig 2x met een serologische pipet van 10 ml of met behulp van pipetpunten met brede boring. Breng de cellen over in een buis van 15 ml.OPMERKING: hiPSC’s zijn zeer gevoelig voor mechanische belasting; Meervoudige resuspensie moet dus worden vermeden. De uiteindelijke celsuspensie moet bestaan uit kleine koloniefragmenten (50-200 μm). Zuig het supernatant uit de gecoate kweekschalen en bereid 4 ml feedervrij iPSC-onderhoudsmedium per schaal van 6 cm. Breng kleine koloniefragmenten over naar de vers bereide kweekgerechten in gesplitste verhoudingen van 1:10 tot 1:40 en kweek bij 37 °C en 5% CO2 met dagelijkse mediawisselingen.OPMERKING: Kleine kolonies moeten zich binnen 1 of 2 uur na het passeren hechten. Figuur 1: Morfologie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcelculturen . (A,B) HiPSC-culturen van goede kwaliteit met verschillende samenvloeiingen met verdichte hiPSC-kolonies met een homogene morfologie en gedefinieerde randen. (C) hiPSC-cultuur met opkomende clusters van gedifferentieerde cellen rond de kolonieranden (onderbroken witte lijn). Schaalbalk = 200 μm. Afkorting: hiPSC = door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 2. Voorteelt van hiPSC’s in het benchtop bioreactorsysteem (dag-2) OPMERKING: Begin met voorteelt wanneer de hiPSC-culturen een samenvloeiing bereiken tussen 60% en 80%. Controleer de hiPSC-kolonies op gedifferentieerde gebieden. Tijdens deze voorteeltfase worden de hiPSC’s gedurende 2 dagen in feedervrij iPSC-onderhoudsmedium gehouden. Bereid de kweekmedia, bestaande uit feedervrij iPSC-onderhoudsmedium en 10 μM ROCK-remmer (Y-27632). Zuig het medium volledig uit de hiPSC’s en spoel de cellen voorzichtig af met 1x DPBS (-/-) tweemaal. Voeg 2,0 ml voorverwarmde trypsine-EDTA-oplossing toe aan de petrischaaltjes van 6 cm en incubeer de cellen gedurende 3 minuten bij 37 °C in de couveuse. Tik zachtjes op de gerechten om celloslating te vergemakkelijken of incubeer 1-2 minuten langer. Resuspendie van de cellen in 5 ml feedervrij iPSC-onderhoudsmedium + ROCK-remmer per schaal. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml of 50 ml en meng voorzichtig door pipetteren om celsingularisatie te garanderen. Bepaal de celnummers in 100 μL celsuspensie met behulp van een geautomatiseerde celteller zoals eerder beschreven20. Breng het overeenkomstige volume voor 15 × 106 cellen per bioreactorbuis over in een buis van 50 ml. Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten op 300 × g . Zuig het supernatant op en resuspendien de cellen in 2 ml feedervrij iPSC-onderhoudsmedium + ROCK-remmer. Vul elke buis van 50 ml met 18 ml medium (celzaaidichtheid van 0,75 × 106 cellen / ml). Doseer de celsuspensie in de bioreactorbuizen (20 ml per buis). Plaats de buizen in het bioreactorsysteem. Stel de volgende teeltparameters in: 2 s rotatieperiode, 60 rpm rotatiesnelheid, geen roerpauze, 37 °C en 5% CO2 voor een onbeperkte duur20. Start het teeltprogramma via de bioreactordisplay. Verander de media de volgende dag. Laat de aggregaten gedurende ~5 min bezinken in de bioreactorbuizen. Zuig het supernatant voorzichtig op.OPMERKING: Laat de aggregaten niet langer dan 10 minuten bezinken, omdat ze aan elkaar kunnen blijven plakken en een heterogene aggregaatsuspensie kunnen opbouwen. Het wordt aanbevolen om ~ 5 ml kweekmedium in de bioreactorbuis te laten. Voeg 15 ml vers feedervrij iPSC-onderhoudsmedium zonder ROCK-remmer per buis toe en zet de teelt voort in de benchtop-bioreactor gedurende 24 uur. 3. Differentiatie van hiPSC’s in vroege neuronen (dag 0) Bereid neurobasaal medium (NBM): 50% DMEM / F-12 met gestabiliseerd L-alanyl-L-glutaminedipeptide, 50% neurobasaal medium, 0,5x serumvrij supplement (50x), 0,5x serumvrij supplement op basis van Bottenstein’s N-1-formulering (100x), 0,5x gestabiliseerd L-alanyl-L-glutaminedipeptide, 0,5x MEM niet-essentiële aminozurenoplossing (100x), 500 nM natriumpyruvaat (100 mM), 50 nM 2-mercaptoethanol (50 mM), 0,025% humane insulineoplossing en 5 U / ml penicilline-streptomycine.OPMERKING: NBM moet worden bewaard bij 4 °C en kan maximaal 2 weken worden gebruikt. Start neuronale differentiatie door doxycycline (DOX) toe te voegen aan de hiPSC-culturen. Laat hiervoor de aggregaten bezinken in de bioreactorbuizen. Zuig het supernatant voorzichtig uit de cellen, laat ~ 5 ml in de buis achter en voeg 35 ml neuraal inductiemedium (NIM) toe, bestaande uit NBM en 2 μg / ml DOX.OPMERKING: Omdat DOX lichtgevoelig is, wordt het aanbevolen om het licht uit te schakelen tijdens het werken. Plaats de buizen terug in de benchtop bioreactor en ga verder met de teelt. Voer elke dag gedurende 2 dagen mediawijzigingen uit, zoals beschreven in stap 3.2.OPMERKING: Na 4 dagen in suspensiecultuur kunnen de aggregaten worden gedissocieerd en vroege neuronen worden gecryopreserveerd of direct opnieuw worden geplateerd voor terminale rijping. 4. Cryoreservatie van vroege neuronen (dag 2) OPMERKING: Cryoreservatie is niet vereist en niet kritisch voor het differentiatieproces, maar wordt ten zeerste aanbevolen omdat grote voorraden vroege neuronen kunnen worden geproduceerd en opgeslagen voor latere rijping en analyses. Laat de aggregaten bezinken in de buis van de bioreactor. Zuig het supernatant aan zoals eerder beschreven. Breng de aggregaten over in een steriele buis van 15 ml of 50 ml en spoel de aggregaten 2x voorzichtig af met 1x DPBS (-/-). Zuig het supernatant voorzichtig zoveel mogelijk aan zonder de aggregaten te verstoren. Voeg 2-5 ml voorverwarmd celdissociatie-enzym toe, afhankelijk van de pelletgrootte, en incuber de cellen gedurende ongeveer 10 minuten bij 37 °C in een waterbad. Suspensie de gesedimenteerde aggregaten voorzichtig elke 2 minuten totdat de aggregaten dissociëren.OPMERKING: Een bijna homogene celsuspensie moet worden verkregen na 7-10 minuten incubatie. Voeg het drievoudige volume voorverwarmd NBM-medium toe en resuspensie de cellen voorzichtig om celsingularisatie te garanderen. Bepaal de celnummers en breng het overeenkomstige volume voor cryopreservatie over in een buis van 15 ml of 50 ml.OPMERKING: Een celdichtheid van 5-10 × 106 cellen/ml vriesmedium wordt aanbevolen. Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten op 300 × g . Zuig het supernatant op en resuspensie de celpellet voorzichtig in het overeenkomstige volume vriesmedium dat 10% dimethylsulfoxide (DMSO) bevat. Aliquot de celsuspensie in geschikte injectieflacons voor cryopreservatie (1 ml/injectieflacon). Breng de injectieflacons onmiddellijk over in een voorgekoelde, langzame vriescontainer gevuld met 2-propanol en plaats de container een nacht op -80 °C. Plaats de injectieflacons de volgende dag op -150 °C voor langdurige opslag.OPMERKING: De vloeibare 2-Propanol is licht ontvlambaar en kan oogbeschadiging veroorzaken bij contact. Blijf uit de buurt van hitte en draag beschermende handschoenen en een bril. 5. Rijping van hiPSC-afgeleide neuronen in monolaagculturen Bereid poly-L-ornithine / laminine-gecoate kweekschalen voor de langdurige teelt van hiPSC-afgeleide neuronen.Verdun de poly-L-ornithine stockoplossing tot 0,001% in 1x DPBS (-/-) en bedek de gerechten een nacht bij 4 °C of gedurende 4 uur bij 37 °C. Zuig de poly-L-ornithine oplossing aan en was de platen eenmaal met 1x DPBS (-/-). Verdun de laminineoplossing in 1x DPBS (-/-) tot een eindconcentratie van 10 μg/ml en incubeer de gerechten gedurende een nacht bij 4 °C of gedurende 4 uur bij 37 °C.OPMERKING: Een volume van 0,1-0,15 ml per cm 2 wordt aanbevolen voor de coatingprocedures en 0,2 ml per cm2 voor alle respectieve wasstappen. Alternatieve coatingsubstraten kunnen worden gebruikt, maar mogelijke effecten op celaanhechting en rijping moeten worden geëvalueerd. Ontdooi de gecryopreserveerde cellen. Plaats hiervoor de cryovial in een waterbad (ingesteld op 37 °C) en draai het gedurende ongeveer 1 minuut, totdat een klein klompje bevroren celsuspensie overblijft. Breng de celsuspensie voorzichtig druppelsgewijs over in een buis van 15 ml die is voorbereid met 10 ml voorverwarmde NBM. Spoel de cryovial af met 1 ml NBM en breng de celsuspensie over in de identieke buis van 15 ml. Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten op 300 × g . Zuig het supernatant aan en voeg 1-2 ml NIM toe, aangevuld met 10 μM ROCK-remmer. Resuspendeer de celkorrel voorzichtig en bepaal de celnummers. Zuig de resterende laminine-oplossing uit de gecoate celkweekschalen en zaai de cellen met een zaaidichtheid van 1 × 105 cellen/cm2 in NIM aangevuld met 10 μM ROCK-remmer. Schakel het medium na 24 uur over naar NIM zonder ROCK-remmer. Voer dagelijkse mediumveranderingen uit gedurende 4 dagen. Na deze eerste fase van NGN2-inductie, laat de DOX weg en kweek de cellen in NBM, met halve mediaveranderingen 2x per week totdat het gewenste stadium van rijping is bereikt.OPMERKING: Co-kweek van iNGN2-neuronen met astrocyten wordt aanbevolen om de celoverleving, hechting, volwassenheid en elektrische activiteit te verhogen 13,22. 6. Karakterisering van hiPSC-afgeleide neuronen OPMERKING: Differentiatie in neuronale derivaten kan worden geëvalueerd met behulp van de volgende technieken. Immunocytochemie en beeldvormingZuig het medium op uit de van hiPSC afgeleide neuronen en was de cellen eenmaal met 1x DPBS met Ca 2+ en Mg2+ (+/+).OPMERKING: Pipetteer voorzichtig, bij voorkeur op de randen van de put, omdat cellen heel gemakkelijk van het oppervlak kunnen loskomen. Een volume van 0,2 ml per cm2 wordt aanbevolen voor alle wasstappen om een volledige dekking van cellen met 1x DPBS (+/+) te garanderen. Fixeer de neuronale cellen met behulp van een fixatieoplossing met 4% paraformaldehyde in DPBS (+/+) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT). Een volume van 0,1 ml per cm2 wordt aanbevolen.OPMERKING: Paraformaldehyde (4%) in DPBS is een gevaarlijke en huidirriterende oplossing met acute toxiciteit en potentiële carcinogeniteit. Blijf uit de buurt van hitte, draag beschermende handschoenen en een bril, vermijd inademing en gebruik de oplossing alleen in een geventileerde omgeving. Spoel de cellen voorzichtig 2x in 1x DPBS (+/+) en ga verder met kleuren.OPMERKING: Vaste cellen kunnen in DPBS (+/+) bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand worden bewaard tot verdere verwerking. Zuig de DPBS (+/+) op uit monsters. Permeabiliseer de cellen en blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen met 1x DPBS (+/+) met 1% BSA en 0,2% Triton-X-100 gedurende 60 minuten bij RT.OPMERKING: Een volume van 0,2 ml per cm2 wordt aanbevolen. Verwijder het supernatant en incubeer de cellen ‘s nachts bij 4 °C, met respectievelijke primaire antilichamen verdund in kleuringsbuffer (1x DPBS [+/+] met 1% BSA) (zie tabel met materialen). Zorg ervoor dat de cellen volledig bedekt zijn met een oplossing.OPMERKING: Een volume van 0,1-0,15 ml per cm2 wordt aanbevolen. Zuig de kleurbuffer aan en spoel de cellen 3x af in 1x DPBS (+/+). Verdun de overeenkomstige secundaire antilichamen (zie materiaaltabel) in kleuringsbuffer bij een eindconcentratie van 1:1.000. Incubeer de cellen in verdunde antilichaamoplossing gedurende 1 uur bij RT in het donker. Zorg ervoor dat de cellen volledig bedekt zijn met een oplossing.OPMERKING: Een volume van 0,1-0,15 ml per cm2 wordt aanbevolen. Zuig de secundaire antilichaamoplossing op en spoel de cellen 2x in 1x DPBS (+/+). Contrakleur de kernen met 4’,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), verdund in DPBS (+/+) gedurende 5 minuten bij RT.OPMERKING: Een werkvolume van 0,1-0,15 ml per cm2 wordt aanbevolen. Spoel de cellen 2x af in 1x DPBS (+/+). Bewaar de cellen in DPBS (+/+) bij 4 °C tot beeldvorming.OPMERKING: Brightfield imaging is geschikt om morfologische veranderingen en neurietuitgroei te volgen. Bovendien kan stereotiepe markerexpressie worden beoordeeld door fluorescentiemicroscopie. Terwijl ongedifferentieerde hiPSC’s OCT 3/4 en NANOG tot expressie brengen, kunnen bèta-III-tubuline (TUBB3) en microtubule geassocieerd eiwit 2 (MAP2) dienen als neuronale markers voor het visualiseren van neurieten en axonen. Het neuritische netwerk kan verder worden beoordeeld door de neurietlengte te bepalen in brightfield- of fluorescerende beelden. Genexpressieanalyses door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR)Zuig het medium aan en spoel de cellen eenmaal in 1x DPBS (-/-).OPMERKING: Een volume van 0,2 ml per cm2 wordt aanbevolen. Voeg koude RNA-lysisbuffer toe en oogst de cellen door te krabben. Isoleer het RNA met behulp van een geschikte kolomgebaseerde kit en bepaal de RNA-concentraties met UV-fotospectrometrie. Genereer cDNA met behulp van 250 ng totaal RNA en een geschikte kit voor reverse transcriptie. Bereid moleculaire baken qPCR-reacties voor die 2,5 ng cDNA in tweevoud bevatten. Gebruik een geschikte mastermix en bijbehorende primertesten20 (zie materiaaltabel). Voer de qPCR uit door 45 cycli aan te brengen met primergloeien bij 60 °C gedurende 20 s. Normaliseer relatieve genexpressieniveaus tot het gemiddelde van de huishoudgenen GAPDH, HPRT1 en GUSB. Pas de ΔΔCt-methode23 toe, met ongedifferentieerde hiPSC’s als kalibrator.

Representative Results

Tijdens de eerste stappen worden aanhangende culturen van hiPSC’s losgemaakt, gesingulariseerd en in suspensie overgebracht (figuur 2). Aggregaten worden binnen 24 uur gevormd en groeien continu in omvang. Na 2 dagen transgeninductie kunnen vroege neuronen worden gecryopreserveerd voor volgende experimenten. De aanhoudende proliferatie tijdens de eerste dagen in suspensie levert een toename van het aantal cellen op, die zijn hoogtepunt bereikt na 2 dagen inductie (figuur 3A, B). Samen met de proliferatie beginnen aggregaten te groeien. Ten opzichte van dag 0 vertoont de diameter een toename van 50% op dag 2 en is bijna verdubbeld op dag 5 (figuur 3D). Hoewel een toenemende diameter de toevoer van voedingsstoffen in de aggregaten beperkt, wordt de levensvatbaarheid van cellen niet beïnvloed op dag 2 of op dag 5 van differentiatie (figuur 3C). Een langdurige teelt gedurende meer dan 4 dagen in suspensie verbetert de celopbrengst echter niet verder, omdat de aggregaten steeds resistenter worden tegen enzymatische singularisatie (figuur 3B). Bij cryopreservatie worden dag 2-cellen ontdooid en verguld op poly-L-ornithine (PLO)-laminine-gecoate schalen voor terminale rijping. Over het algemeen hechten cellen zich na het ontdooien heel goed en beginnen ze al vroeg neurieten uit te breiden. Het temporele genexpressieprofiel, evenals immunocytochemische kleuring voor de neuronale markers TUBB3 en MAP2, bevestigt de neuronale celidentiteit (figuur 4A, B). Naast stijgende niveaus van TUBB3 en MAP2, zijn neuronale culturen verrijkt met microtubule-geassocieerde eiwit tau-transcripten (MAPT), coderend voor een neuronaal eiwit dat betrokken is bij axonstabilisatie, en vertonen een gelijktijdige afname in de expressie van de pluripotentie-regulerende transcriptiefactor POU5F1. Bovendien wordt binnen de eerste week na het ontdooien een dicht neuritisch netwerk gevormd (figuur 4C). Deze morfologische veranderingen, in combinatie met het transcriptionele profiel, suggereren een toenemende rijping van de neuronale culturen. Figuur 2: Generatie van hiPSC-afgeleide iNGN2-neuronen met behulp van een benchtop bioreactor. (A) Schematisch overzicht van het differentiatieparadigma, met de nadruk op de belangrijkste stappen van celkweek. (B-F) Brightfieldbeelden visualiseren (B) hiPSC’s en (C,D) de vorming van aggregaten in de benchtop bioreactor. (E,F) iNGN2-neuronen breiden neurieten uit en ondergaan morfologische veranderingen tijdens differentiatie. Schaalbalk = 100 μm. Afkortingen: BMM = keldermembraanmatrix; iPSC-MM = iPSC-onderhoudsmedium; PLO = poly-L-ornithine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Celopbrengst en levensvatbaarheid tijdens aggregaatvorming en groei. (A) Brightfield-afbeeldingen tonen de vorming van aggregaten binnen 2 dagen na kweek in de benchtop-bioreactor, evenals de toename van de aggregaatgrootte in de loop van de tijd. Schaalbalk = 500 μm. (B) Kwantificering van de celopbrengst en (C) levensvatbaarheid over het differentiatieverloop. Staafdiagrammen geven het gemiddelde + SD weer van vier onafhankelijke experimenten. (D) De diameter, indicatief voor de grootte van aggregaten, werd semi-automatisch bepaald met behulp van de open-source software ImageJ (versie 1.53). Eerst werden brightfield-beelden omgezet in binaire afbeeldingen en vervolgens verder beoordeeld met behulp van de analyse-deeltjestool, waarbij de volgende parameters werden toegepast: grootte > 2.500 μm2, circulariteit 0,45-1, randen uitsluiten en gaten opnemen. Horizontale lijnen geven het gemiddelde ± SD van vijf onafhankelijke differentiaties aan. Enkele stippen vertegenwoordigen het gemiddelde van individuele differentiatie-experimenten met ten minste 20 aggregaten per tijdspunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Karakterisering van hiPSC-afgeleide iNGN2 neuronen. Temporeel genexpressieprofiel voor de neuronale genen TUBB3, MAP2 en MAPT, evenals het pluripotente stamcel-geassocieerde gen POU5F1. Relatieve expressieniveaus werden genormaliseerd naar de referentiegenen GAPDH, HPRT1 en GUSB. Ongedifferentieerde hiPSC’s (dag-2) werden gekozen als kalibrator. De geometrische symbolen geven de gemiddelde ± SD van vier onafhankelijke differentiaties aan. (B) Representatieve beelden van iNGN2-neuronen op dag 7 na het ontdooien (dag-2 + 7), gekleurd voor bèta-III-tubuline (TUBB3, magenta) en microtubuli-geassocieerd eiwit 2 (MAP2, cyaan). Celkernen werden tegengekleurd met DAPI. Schaalbalken = 100 μm. (C) Evaluatie van het neuritische netwerk in brightfieldbeelden van neuronale culturen na ontdooiing. De totale lengte van neurieten werd bepaald in een gebied van 930,82 × 698,11 μm2 met behulp van ImageJ (versie 1.53). Na het aanpassen van de helderheid en het contrast werden de beelden omgezet in 8-bits afbeeldingen en werden de kleuren omgekeerd. Neurieten werden vervolgens geskeletiseerd en vervolgens geanalyseerd met behulp van de ImageJ-plug-ins ‘Skeletonize’ en ‘Analyze Skeleton’, respectievelijk. De totale lengte van neurieten werd gedeeld door het aantal soma’s in het gebied van belang om de gemiddelde neurietlengte / cel op te leveren. Staafdiagrammen geven het gemiddelde + SD weer van drie onafhankelijke experimenten. Afkortingen: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Van de ectopische expressie van de neuronale transcriptiefactor NGN2 is eerder aangetoond dat het vroege stadia van neuronale differentiatie versnelt en neuronale afstammingsverbintenis induceert in hiPSC’s binnen 1 week na cultivatie12,13,20. Dit werk beschrijft een gedetailleerd protocol voor de differentiatie van gen-bewerkte BIONi010-C-13 hiPSC’s in iNGN2-neuronen met behulp van een benchtop bioreactor.

De CERO 3D-bioreactor is een bioreactor met een laag volume met vier sleuven voor gespecialiseerde buizen, elk met een maximale capaciteit van 50 ml. Temperatuur- en CO2-niveaus worden continu geregeld en teeltparameters (bijv. rotatiesnelheid en tijd) worden voor elke buis geregeld, waardoor gebruikers onafhankelijk van elkaar verschillende differentiatiebenaderingen parallel kunnen uitvoeren. Geïntegreerde golfbrekers op de binnenbuiswand zorgen voor een verstoring van het medium met een lage schuifspanning en houden 3D-aggregaten in suspensie tijdens gecontroleerde rotatie. Beperkte toegang tot voedingsstoffen, evenals afgedwongen 3D-cel-cel en cel-extracellulaire matrix (ECM) interacties, kunnen de cellulaire differentiatie en het gedrag aanzienlijk beïnvloeden24,25,26,27.

Het kweken van cellen als 3D-aggregaten in suspensie verhoogt deze celinteracties, waardoor de in vivo omgeving van weefsel of organen beter wordt nagebootst28. De gelijktijdige verstoring van het medium reguleert de aggregaatgrootte als gevolg van mechanische wrijving, verbetert de gasuitwisseling en vermindert de gradiënt van voedingsstoffen en afval in de buis, terwijl fysiologische relevante gradiënten in de aggregaten behouden blijven 29,30,31,32,33,34. Hoewel mediumwissels handmatig worden uitgevoerd, verlaagt de benchtop bioreactor de arbeids- en bedrijfskosten in vergelijking met statische kweekkolven. De bioreactor biedt ook verschillende voordelen ten opzichte van volledig geautomatiseerde roertankbioreactoren, omdat het waaiervrije ontwerp de hydrodynamische schuifspanning aan het aggregaatoppervlak vermindert, waardoor niet alleen de celoverleving wordt verbeterd, maar ook de effecten van schuifspanning op gevoelige iPSC’s, celdifferentiatie en functie35,36,37,38.

Verticale wielbioreactoren, waarin cellen worden geagiteerd door een grote verticale waaier, evenals schommelende bewegingsbioreactoren met behulp van opgeblazen kweekzakken die aan een gemotoriseerd platform zijn bevestigd, vertegenwoordigen alternatieve 3D-ophangplatforms. Hoewel overmatig getest voor de teelt van hiPSC’s 17,18,19,39,40, is er weinig bekend over hun toepasbaarheid in neuronale differentiatiebenaderingen, en rapporten zijn beperkt tot de succesvolle uitbreiding van zoogdier- en menselijke neurale voorlopercellen in roertankbioreactoren 41,42,43,44, met een zeldzaam aantal studies gericht op rijping44,45. Over het algemeen bieden geautomatiseerde 3D-ophangplatforms het voordeel van volledig geautomatiseerde en computergestuurde mediumwisselingen, waardoor variaties in hantering worden verminderd en het risico op besmetting wordt geminimaliseerd. Bovendien kunnen voedingsparameters zoals lactaat- en glucoseconcentratie continu worden gecontroleerd. Het opzetten van deze systemen vereist echter vaak een aanzienlijke initiële investering, laboratoriumruimte en de opleiding van gekwalificeerd personeel. De benchtop bioreactor is een compact en eenvoudig te gebruiken alternatief voor het kweken van cellen in suspensie, maar biedt geen gelijktijdige monitoring van voedingsstoffen.

Zoals in de meeste protocollen die worden gebruikt voor het kweken van cellen in 3D-suspensieplatforms, vertegenwoordigt de initiële vorming van aggregaten een kritieke stap. hiPSC’s worden gekweekt als hechtende monolagen en vervolgens overgebracht als eencellige suspensies naar een 3D-omgeving. Om celverlies in dat stadium te minimaliseren, moeten verschillende aspecten worden overwogen. Het ontwerp van de buizen met de geïntegreerde golfbrekers betekent dat een minimaal kweekvolume van 10 ml per buis vereist is om een optimale mediumverstoring te garanderen. Het kritische volume mag daarom op de lange termijn niet worden onderboden. Bovendien wordt een startzaaidichtheid van 7,5 miljoen cellen per 10 ml kweekvolume en een rotatiesnelheid van 60 tpm sterk aanbevolen om op korte termijn stabiele aggregaten te vormen, hoewel aanpassingen nodig kunnen zijn, afhankelijk van de cellijn.

Na het overbrengen van hiPSC’s in suspensie moeten aggregaten binnen 24 uur worden gevormd. De eerste mediumverandering is van cruciaal belang, omdat de aggregaten klein zijn en mogelijk niet goed tot rust komen. De tijd voor de sedimentatie van aggregaten kan worden verlengd, maar mag niet langer zijn dan 10 minuten, omdat aggregaten op een heterogene manier kunnen gaan klonteren en groeien. Tijdens aspiratie moet een minimaal kweekvolume van 5 ml in de buis worden achtergelaten en moeten eventuele verstoringen van het medium worden vermeden. Niettemin is een verlies van cellen en aggregaten te verwachten tijdens de beginfasen. Celtellingen wijzen op een constante celopbrengst gedurende de eerste 2 dagen in cultuur, wat aangeeft dat de hoge proliferatieve capaciteit van hiPSC’s het initiële celverlies compenseert. Eenmaal in suspensie leidt de zachte teelt en verstoring tot homogeen aggregaten die na verloop van tijd beginnen te groeien.

Neuronale differentiatie werd uitgevoerd volgens een eerder gepubliceerd protocol op basis van doxycycline-geïnduceerde NGN2-overexpressie13, en de individuele stappen werden geoptimaliseerd voor een 3D-cultivatie. De neuronale transcriptiefactor NGN2 is een goed beschreven driver in neuronale differentiatie en versnelt neuronale inductie significant11,13,46. Terwijl conventionele patronen met gedefinieerde groeifactoren enkele weken tot maanden 7,8,9 duren, induceert NGN2-expressie het lot van neuronale cellen binnen enkele dagen. Naast de verkorte teelttijd is het protocol niet afhankelijk van dure groeifactoren of coatingmatrices voor de initiële suspensiecultuur, waardoor de teeltkosten extra worden verlaagd.

Bovendien onthulde een directe vergelijking van de NGN2-gedreven generatie van onrijpe neuronen in adherente en suspensieculturen een 1,36-voudige toename van cellen na 4 dagen in cultuur met behulp van de benchtop bioreactor20, terwijl het volume medium dat nodig is voor de generatie van 1 miljoen cellen naar verwachting zal worden gehalveerd. Het gebruik van de benchtop bioreactor voor het genereren van iNGN2-neuronen kan daarom gunstig zijn, omdat een groter aantal cellen kan worden geproduceerd met een lagere verwerkingstijd en kosten. In lijn met eerdere rapporten werd neuronale afstammingsverbintenis al vroeg waargenomen. Na 2 dagen NGN2-inductie was een diepgaande expressie van klassieke neuronale markers zoals TUBB3, MAP2 en MAPT duidelijk, die de toepasbaarheid van de benchtop bioreactor voor neuronale inductie ondersteunden. Volgens dit protocol kunnen ongeveer 6,2 miljoen onrijpe iNGN2-neuronen worden verkregen uit 1 miljoen hiPSC’s binnen 4 dagen na kweek. De uitvoercapaciteit kan echter variëren tussen batches en is afhankelijk van het volume van de suspensiecultuur bij het zaaien.

Om de opbrengst verder te verhogen werd de teelttijd met 3 extra dagen verlengd; Hoewel de aggregaten groter werden, werden ze ook zeer compact en konden ze niet goed worden gedissocieerd voor cryopreservatie of replating. Ondanks de vooruitgang in 3D-cultuurbenaderingen, zijn adherente 2D-neuronale culturen nog steeds de gouden standaard voor functionele analyses zoals micro-elektrode-arrays of calciumbeeldvorming. Celsingularisatie is dus een belangrijke voorwaarde voor een homogeen verdeeld neuronaal monolaag en neuritisch netwerk. Sterkere mechanische loslating van de cellen of agressieve dissociatiereagentia kunnen worden gebruikt om singularisatie te garanderen, maar met potentiële effecten op de levensvatbaarheid van de cel, fysiologie en herbevestigingscapaciteit47,48. Met betrekking tot de behoefte aan afzonderlijke cellen voor verdere analyses en rijping, werden aggregaten na 4 dagen in suspensie gedissocieerd en de (dag 2) iNGN2-neuronen gecryopreserveerd. Post-dooi differentiatie en karakterisering van iNGN2 neuronen bevestigden een toenemende volwassenheid van de neuronale culturen en de vorming van een dicht neuritisch netwerk.

Het meegeleverde protocol levert een hoog aantal iNGN2-neuronen op. Er moet echter rekening worden gehouden met verschillende beperkingen. Zoals voor de meeste suspensiecultuurplatforms, is de overdracht van hiPSC’s van een 2D-adherente cultuur naar een 3D-omgeving van cruciaal belang en vaak geassocieerd met een diepgaand celverlies. Verder wordt significant cel- en aggregaatverlies verwacht tijdens mediaveranderingen. In vergelijking met geautomatiseerde platforms wordt de verwerkingstijd en het besmettingsrisico met behulp van de benchtop bioreactor verhoogd, omdat mediumwissels handmatig moeten worden uitgevoerd. Afgezien van het gebrek aan automatisering, biedt de benchtop bioreactor niet de mogelijkheid om de voedingsstoffen te monitoren, en de maximale capaciteit van 50 ml per buis beperkt het opschalingspotentieel van het protocol. Ten slotte is het belangrijk op te merken dat, hoewel NGN2 de neuronale afstammingsverbintenis versnelt, de duur van terminale rijping niet wordt verkort en nog steeds een langdurige cultuur gedurende enkele weken vereist. Gezien het belang van astrocytische ondersteuning voor neuronale functie, hechting en overleving 49,50,51, moeten co-cultuurbenaderingen worden overwogen en kunnen ze zelfs essentieel zijn voor cultivatie op lange termijn.

Samenvattend werd een 2D-differentiatieprotocol met succes vertaald naar een 3D-omgeving voor de snelle en reproduceerbare generatie van iNGN2-neuronen door een benchtop-bioreactor te implementeren. Het beschreven protocol levert grote hoeveelheden van goede kwaliteit, iPSC-afgeleide neuronen, die kunnen dienen als uitgangspunt voor complexe modeltests, high-throughput medicijnscreenings en grootschalige toxiciteitstests.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het EBiSC2-project heeft financiering ontvangen van de gemeenschappelijke onderneming Innovative Medicines Initiative 2 (JU) in het kader van subsidieovereenkomst nr. 821362. De gemeenschappelijke onderneming ontvangt steun uit het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie en EFPIA. We danken Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters en Vanessa M. Nalewaja voor hun hulp bij immunocytochemische en genexpressieanalyses, evenals Heike Arthen voor haar uitstekende technische ondersteuning. Bovendien bedanken we Stephanie Bur voor het opzetten van het bioreactorprogramma. Figuur 2A is gemaakt met BioRender.com.

Materials

2-Mercaptoethanol 50 mM Gibco  11528926
60 mm Nunclon Delta Surface Nunc 734-2040
Anti-beta III Tubulin antibody [TU-20] (dilution 1:1,000) Abcam   ab7751 
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific   10400745
B-27 Supplement (50x)  Gibco 11530536 serum-free Supplement (50x)
BIONi010-C-13 hiPSC line European Bank for induced pluripotent Stem Cell (EBiSC), BIONEER as Depositor SAMEA103988285 Bioneer is depositor in EBiSC and owner of the hiPSC line.
Biorender  Biorender.com
BSA Cell Culture grade Thermo Fisher Scientific   12330023
CERO 3D Incubator & Bioreactor OLS OMNI Life Science 2800000
CEROtubes Cell culture Tubes 50 mL OLS OMNI Life Science 2800005
Citavi 6 Swiss Academic Software
CryoStor CS10 Stemcell 7930 freezing medium containing 10% DMSO
Cytofix Fixation Solution BD Biosciences  554655 fixation solution containing 4% paraformaldehyde 
DAPI (NUCBLUE FIXED CELL STAIN)  Thermo Fisher Scientific   12333553
Doxycycline hydrochloride (DOX) Sigma-Aldrich D3447
DPBS without Calcium and Magnesium (DPBS -/-)  Gibco 14190250
DPBS with Calcium and Magnesium (DPBS +/+)  Gibco 11580456
DMEM/F12 (-/-) Gibco 21331-020
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement Gibco 31331-028
EVOS XL Core Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific   A21424
GlutaMAX supplement  Gibco  35050-038 stabilized L-alanyl-L-glutamine dipeptid
ImageJ 1.51v  National Institute of Health
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278l
Laminin Merck L2020
MACSQuant Analyzer Miltenyi
MAP2 Monoclonal Antibody (dilution 1: 300) Thermo Fisher Scientific   13-1500 
Matrigel Growth factor reduced, phenol-red free  Corning Life Science  356231 basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Gibco  11140035
MicroAmp Optical Adhesive Film Kit  Thermo Fisher Scientific   10095714
mTeSR1 Stemcell 85850 feeder-free iPSC maintenance medium 
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502-048 serum-free Supplement based on Bottenstein’s N-1 formulation
Neurobasal Medium Gibco 11570556
Nikon Eclipse TS2 Nikon Instruments Europe B.V.
NucleoCounter-NC200 ChemoMetec A/S
Origin 2021 OriginLab
Penicillin-Streptomycin Gibco 11548876
Perm/Wash Buffer  BD Biosciences  554723
Primer assay TUBB3(Hs00801390_s1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay GAPDH (Hs99999905_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay GUSB (Hs99999908_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay HPRT1 (Hs99999909_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay MAP2 (Hs00258900_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay MAPT (Hs00902194_m1) Thermo Fisher Scientific 11620099
Primer assay POU5F1 (Hs04260367_gH) Thermo Fisher Scientific 11620099
Poly-L-ornithine 0.01% Merck P4957
RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit Qiagen 74034 column-based RNA isolation kit
RLT Buffer Qiagen 79216 cell lysis buffer
Sodium Pyruvat (100 mM) Gibco 12539059
StemPro Accutase Gibco 11599686 cell dissociation enzyme
TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX Thermo Fisher Scientific   11380912 qPCR master mix
Triton-X-100 Sigma-Aldrich T8787
TrypLE Select Enzym Gibco 12563-011 Trypsin-EDTA solution
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G
Via1-Cassette ChemoMetec A/S 941-0012
Wide Bore Filtered Pipette Tips Thermo Fisher Scientific 10088880
X20 OPTICAL 96WELL FAST CLEAR REACTION PLATES  Thermo Fisher Scientific 15206343
Y-27632 dihydrochloride, Rho kinase inhibitor (ROCK inhibitor) Abcam ab120129
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feigin, V. L., et al. The global burden of neurological disorders: translating evidence into policy. The Lancet. Neurology. 19 (3), 255-265 (2020).
  2. Olesen, J., Gustavsson, A., Svensson, M., Wittchen, H. -. U., Jönsson, B. The economic cost of brain disorders in Europe. European Journal of Neurology. 19 (1), 155-162 (2012).
  3. Preclinical Development: The Safety Hurdle Prior to Human Trials. American Pharmaceutical Review Available from: https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/187349-Preclinical-Development-The-Safety-Hurdle-Prior-to-Human-Trials (2016)
  4. van Norman, G. A. Phase II trials in drug development and adaptive trial design. JACC. Basic to Translational Science. 4 (3), 428-437 (2019).
  5. van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: part 2: potential alternatives to the use of animals in preclinical trials. JACC. Basic to Translational Science. 5 (4), 387-397 (2020).
  6. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  7. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  8. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  9. Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS One. 8 (3), 59252 (2013).
  10. Hulme, A. J., Maksour, S., St-Clair Glover, M., Miellet, S., Dottori, M. Making neurons, made easy: the use of Neurogenin-2 in neuronal differentiation. Stem Cell Reports. 17 (1), 14-34 (2022).
  11. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  12. Schmid, B., et al. Generation of two gene edited iPSC-lines carrying a DOX-inducible NGN2 expression cassette with and without GFP in the AAVS1 locus. Stem Cell Research. 52, 102240 (2021).
  13. Shih, P. -. Y., et al. Development of a fully human assay combining NGN2-inducible neurons co-cultured with iPSC-derived astrocytes amenable for electrophysiological studies. Stem Cell Research. 54, 102386 (2021).
  14. Chang, C. -. Y., et al. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-based neurodegenerative disease models for phenotype recapitulation and drug screening. Molecules. 25 (8), 2000 (2000).
  15. Silva, M. C., Haggarty, S. J. Human pluripotent stem cell-derived models and drug screening in CNS precision medicine. Annals of the New York Academy of Sciences. 1471 (1), 18-56 (2020).
  16. Elanzew, A., Sommer, A., Pusch-Klein, A., Brüstle, O., Haupt, S. A reproducible and versatile system for the dynamic expansion of human pluripotent stem cells in suspension. Biotechnology Journal. 10 (10), 1589-1599 (2015).
  17. Davis, B. M., Loghin, E. R., Conway, K. R., Zhang, X. Automated closed-system expansion of pluripotent stem cell aggregates in a rocking-motion bioreactor. SLAS Technology. 23 (4), 364-373 (2018).
  18. Kropp, C., et al. Impact of feeding strategies on the scalable expansion of human pluripotent stem cells in single-use stirred tank bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 5 (10), 1289-1301 (2016).
  19. Borys, B. S., et al. Overcoming bioprocess bottlenecks in the large-scale expansion of high-quality hiPSC aggregates in vertical-wheel stirred suspension bioreactors. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 55 (2021).
  20. Kwok, C. K., et al. Scalable expansion of iPSC and their derivatives across multiple lineages. Reproductive Toxicology. 112, 23-35 (2022).
  21. User Protocol for Human induced Pluripotent Stem Cells. EBiSC Available from: https://ebisc.org/docs/ebisc/EBiSC_User_Protocol_for_Human_induced_Pluripotent_Stem_Cells.pdf (2023)
  22. Neyrinck, K., et al. SOX9-induced generation of functional astrocytes supporting neuronal maturation in an all-human system. Stem Cell Reviews and Reports. 17 (5), 1855-1873 (2021).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  25. Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Engineering. Part A. 15 (2), 205-219 (2009).
  26. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  27. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  28. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
  29. Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Effects of hydrodynamics on cultures of mammalian neural stem cell aggregates in suspension bioreactors. Industrial and Engineering Chemical Research. 40 (23), 5350-5357 (2001).
  30. Gerecht-Nir, S., Cohen, S., Itskovitz-Eldor, J. Bioreactor cultivation enhances the efficiency of human embryoid body (hEB) formation and differentiation. Biotechnology and Bioengineering. 86 (5), 493-502 (2004).
  31. Zhao, F., et al. Effects of oxygen transport on 3-d human mesenchymal stem cell metabolic activity in perfusion and static cultures: experiments and mathematical model. Biotechnology Progress. 21 (4), 1269-1280 (2005).
  32. Cimetta, E., Figallo, E., Cannizzaro, C., Elvassore, N., Vunjak-Novakovic, G. Micro-bioreactor arrays for controlling cellular environments: design principles for human embryonic stem cell applications. Methods. 47 (2), 81-89 (2009).
  33. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Engineering. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
  34. Sargent, C. Y., et al. Hydrodynamic modulation of embryonic stem cell differentiation by rotary orbital suspension culture. Biotechnology and Bioengineering. 105 (3), 611-626 (2010).
  35. Liu, N., Zang, R., Yang, S. -. T., Li, Y. Stem cell engineering in bioreactors for large-scale bioprocessing. Engineering in Life Sciences. 14 (1), 4-15 (2014).
  36. Wolfe, R. P., Leleux, J., Nerem, R. M., Ahsan, T. Effects of shear stress on germ lineage specification of embryonic stem cells. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (10), 1263-1273 (2012).
  37. Wolfe, R. P., Ahsan, T. Shear stress during early embryonic stem cell differentiation promotes hematopoietic and endothelial phenotypes. Biotechnology and Bioengineering. 110 (4), 1231-1242 (2013).
  38. Shafa, M., et al. Impact of stirred suspension bioreactor culture on the differentiation of murine embryonic stem cells into cardiomyocytes. BMC Cell Biology. 12 (1), 53 (2011).
  39. Kwok, C. K., et al. Scalable stirred suspension culture for the generation of billions of human induced pluripotent stem cells using single-use bioreactors. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1076-1087 (2018).
  40. Rodrigues, C. A. V., et al. Scalable culture of human induced pluripotent cells on microcarriers under xeno-free conditions using single-use vertical-wheel™ bioreactors. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 93 (12), 3597-3606 (2018).
  41. Gilbertson, J. A., Sen, A., Behie, L. A., Kallos, M. S. Scaled-up production of mammalian neural precursor cell aggregates in computer-controlled suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 94 (4), 783-792 (2006).
  42. Baghbaderani, B. A., et al. Expansion of human neural precursor cells in large-scale bioreactors for the treatment of neurodegenerative disorders. Biotechnology Progress. 24 (4), 859-870 (2008).
  43. Baghbaderani, B. A., et al. Bioreactor expansion of human neural precursor cells in serum-free media retains neurogenic potential. Biotechnology and Bioengineering. 105 (4), 823-833 (2010).
  44. Serra, M., Brito, C., Costa, E. M., Sousa, M. F. Q., Alves, P. M. Integrating human stem cell expansion and neuronal differentiation in bioreactors. BMC Biotechnology. , 82 (2009).
  45. Zhao, S., et al. Generation of cortical neurons through large-scale expanding neuroepithelial stem cell from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 431 (2020).
  46. Pawlowski, M., et al. Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
  47. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
  48. Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2016).
  49. Allen, N. J. Astrocyte regulation of synaptic behavior. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 439-463 (2014).
  50. Verkhratsky, A., Nedergaard, M., Hertz, L. Why are astrocytes important. Neurochemical Research. 40 (2), 389-401 (2015).
  51. Jäkel, S., Dimou, L. Glial cells and their function in the adult brain: a journey through the history of their ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 24 (2017).

Tags

3D Suspension BioreactorHuman Neurogenin 2-inducible NeuronsInduced Pluripotent Stem CellsIPSC CultureNeuronal DifferentiationHigh-throughput ScreeningRapid And Cost-efficient GenerationCardiomyocytesPre-cultivationTrypsinizationCell SingularizationCell CountingCell SuspensionCentrifugationFeeder-free IPSC Maintenance MediumROCK InhibitorBioreactor Cultivation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wihan, J., Karnatz, I., Sébastien, I., Kettenhofen, R., Schmid, B., Clausen, C., Fischer, B., Steeg, R., Zimmermann, H., Neubauer, J. C. Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor. J. Vis. Exp. (193), e65085, doi:10.3791/65085 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image