刺胞動物モデル生物Clytia hemisphaericaを用いたin vivoでの上皮創傷治癒の特徴付け

1.動物文化 ゼブラフィッシュシステムでは、顕微鏡スライド上のClytiaポリープコロニーと人工海水(ASW)中のメデューサを18°Cに維持し、ポリープコロニー用の2 Lゼブラフィッシュタンクとメデューサエ用のカスタムメイド5 L疑似クライゼルタンクを使用します(補足図1)51。ASWは、脱イオン化(DI)H2O中の4%インスタントオーシャンからなる。 51に記載のように、2〜3日齢のアルテミアを動物に毎日給餌する。注:腸から視野に放出される破片が少ないため、動物に最近給餌されていない場合、創傷治癒のイメージングが容易になります。 必要に応じて、1 LのASWで満たされた2 Lのビーカーにコロニーを一晩入れて、確立されたポリープコロニーから赤ちゃんメデューサを収集します。すべての創傷治癒実験に2〜3週齢のメスのメデューサを使用してください。Clytiaの繁殖は、他の場所で詳細に説明されています51。 2.傷 細胞内および細胞間に微小創傷を作成する(20-500μm2)先端をハサミで切断して、より大きな開口部(直径0.5〜0.7 cm)を作成して、修正されたトランスファーピペットを作成します。注意: ピペットの開口部は、動物への損傷を避けるために十分な幅でなければなりません。 改造したトランスファーピペットを使用して、メデューサを窪みのスライドに置き、メデューサの傘を上に向けて、動物を覆うのに十分なASWを使用します。 すぐに動物と画像の上にカバーガラスを置きます(画像の説明については以下を参照してください)。カバーガラスはメソグレアを圧迫し、圧縮された組織のリバウンドは細胞をわずかに離す力を生み出します52。これは、各細胞間のギャップと一部の細胞内の損傷としてすぐに現れます(図1B、B’、図2、および図3A-C)。 小さな上皮創傷の作成 (0.02-0.125 mm2)改造トランスファーピペット(上記)を使用して、メデューサ外傘を上に向けてメデューサをくぼみスライドに置きます。 200 μLのピペットチップを使用して、メデューサの表面をそっと引っ掻きます。穏やかな引っかき傷はまた、基底膜に裂け目を作成する可能性があり、それはすぐに明らかになります22。イメージング用のカバーガラスで動物を覆います。あるいは、カバーガラスの配置は、引っかき傷がなくても小さな上皮創傷を作成するのに十分な場合があります(図1C、C ‘、図2、および図3A-C)。注:メデューサの表面を傷つけるときは、ECMが損傷し、不規則な表面を作成するため、押し下げないでください—不規則な表面を移動する上皮細胞は焦点を合わせるのがより困難です。 大きな上皮創傷を作成する(0.5-0.9 mm2)マイクロピペットプラーとガラス毛細管を使用してマイクロ注射針を作ります(ステップ5.2)。空のマイクロインジェクションニードルをマイクロマニピュレーターに取り付けられたマイクロインジェクターホルダーに入れます。開口部が約20〜40μmになるように針の先端を切ります。注:大きな上皮創傷用の切断針は、実験間の一貫性を高めるために保管および再利用できます。 マイクロインジェクターのホールド圧力をゼロに設定し、排出圧力を約20PSIに設定します。マイクロインジェクターを2秒の空気パルスを供給するように設定します。注意: 排出圧力は、針の開口部の直径に基づいて調整する必要がある場合があります(つまり、小さいチップはより高い圧力を使用し、大きなチップはより低い圧力を使用します)。 解剖スコープのステージ上のくぼみスライドに傘を上に向けてメデューサを置き、動物を覆うのに十分なASWを使用します。マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロインジェクションの針先を水面のすぐ上になるように調整します。これを行うには、チップを慎重に水に浸し(水がピペットチップに入る場合があります)、メデューサの上皮表面に近づくように引っ込めます。注意: 先端は、メデューサの1つの象限に配置する必要があります。メデューサの放射状運河は、メデューサベルを4つの異なる象限に分割します。象限をターゲットにすると、生殖腺と橈骨管が創傷領域から除外されるため、よりクリーンなイメージングが得られます。 インジェクターのスタートを押して空気をパルスします。先端の幅に応じて、同じ場所でパルスを2〜4回繰り返します。チップが大きいほど、必要なパルスは少なくなります。注意: 空気の脈動によって引き起こされる水/メデューサのくぼみが見えるはずです。 大きな傷を画像化するために、負傷した動物をカバーガラスで覆います(図1D、D ‘)。 上皮創傷治癒を画像化するために、以下のステップ(セクション3)に従ってください。 図1:Clytia medusaの無傷で傷ついた外傘上皮層。(A)クリティアメデューサの体の漫画のグラフィック。(A’)上から見た無傷のメデューサ外傘上皮。(B)青の上皮細胞を持つ単一細胞の微小創傷(赤いギザギザの形)の漫画。(B’) 単一細胞の微小創傷。(C)小さな上皮創傷(赤いギザギザの形)の漫画。(C’) 小さな上皮創傷。(D)大きな上皮創傷(赤いギザギザの形)の漫画。(D’) 大きな上皮創傷。画像はすべてDIC顕微鏡を用いて得られた。スケールバー (A’-C’): 50 μm.スケールバー(D’):100μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:複数のサイズの傷と損傷した基底膜。 典型的な小さな傘上皮創傷が示され、辺縁細胞から形成されるラメリポディアを示す標識が示されている。さらに、上皮細胞内および上皮細胞間の微小創傷が見られる。創傷の上部にある小さな基底膜の裂け目に注意してください。 動画4 は、この傷の治癒を示しています。スケールバー:50μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 3.上皮創傷治癒のイメージング 顕微鏡がケーラー照明53用に位置合わせされていること、および微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡54用に正しく設定されていることを確認してください。上皮細胞は、標準的な光学系ではほとんど見えません(図3D、E)。 フォーカスを傘に合わせます。これは薄い層ですが、六角形のセルは透明でなければなりません。注:外傘とサブ傘は、垂直繊維で支えられた厚いメソグレアで区切られています。サブアンブレラ細胞は、放射状管と同じ焦点面にあります。最初にサブアンブレラ層に焦点を合わせた場合は、外傘が見つかるまでメソグレアと垂直繊維を通してゆっくりとフォーカスを調整します。 画像化する傷を手動で識別します。大きな傷の場合は、10倍の対物レンズを使用してください。小さな創傷や単細胞創傷の場合は、20倍の対物レンズを使用してください。 画像をムービーとしてリアルタイムで収集するプログラム、または一定の間隔で一連の画像を収集するプログラムを起動します。進行状況を監視して、創傷領域が視野から外れていないこと、および目的の細胞に焦点が合っていることを確認します。単細胞創傷は1分以内に閉じる。したがって、映画で彼らの閉鎖をイメージしてください。 小さな傷の細胞動態の詳細をキャプチャするには、約10秒ごとに画像を収集します。小さな傷の閉鎖は、サイズに応じて20〜50分かかります。 時間の経過とともにスライドから水分が蒸発すると動物の死や細胞の破裂につながるため、密封されていないスライドを45分以上画像化しないでください。 より長い観察のために、蒸発を減らすためにワセリンでカバーガラスの周りを密封してください。注意: 一部のメデューサはスライド上で脈動し、イメージングを妨げる場合があります。この場合、ASWでpH 7.5に調整された1%エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸(トリカイン)の1:10希釈に動物をマウントすることは、効果的な麻酔薬として機能し、1時間の時間枠での治癒に明らかな効果はありません。しかし、トリカインに数時間放置すると動物は死にます。 図3:外傘上皮に小さな傷を作る。(A) 200μLのピペットチップで傘をやさしく引っ掻き、小さな上皮創を作ります。 (B) カバーガラスを配置するだけで、小さな上皮創傷を作成するのに十分な場合があります。 (C) うつ病スライドに取り付けられたメデューサ。( D )DIC光学系を使用しない小さな上皮創傷画像および (E) DIC光学系を使用。スケールバー:50 μm この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 4. 分析 画像ファイルの準備注: 画像ファイルを処理するには、更新された BioFormat プラグインで FIJI/ImageJ を使用します。画像スタックを登録する前に、スケールを正しいピクセル/ミクロンの比率に設定します。 解析>縮尺を設定します。これは、下流の解析で実際のサイズ測定値を抽出するために必要です。 多くの場合、動物は顕微鏡のスライド上でわずかに漂います。したがって、動画のドリフトをなくすには、FIJIプラグインのSIFTとのリニアスタックアライメントを使用して画像を登録します。 SIFTによる線形スタックアライメント>登録>プラグイン。 登録したスタックを.aviファイルとして保存します。 ファイル>AVI>保存… ポップアップで、フレームレートを設定し(ここではアニメーション化された数字は10 fpsに設定されています)、[ OK]をクリックします。この出力を使用して、創傷治癒分析を実行します。 創傷領域の分析FIJI / ImageJのなげなわツールを使用して、セルの端をトレースして傷の輪郭を描きます。 コマンド +Mまたは CTRL +Mで輪郭を描いた傷の領域を測定します。 10フレームごとに創傷面積測定を繰り返します。次に、FIJI / ImageJからの測定値をPrism 9を使用してプロットできます(図4)。 図4:小さな上皮創傷の創傷領域の分析。(A)10分にわたる小さな上皮創傷治癒の例。 (B)21分にわたる異なる上皮創傷治癒の例。A、Bの紫色の輪郭は、FIJI / ImageJのなげなわツールを使用した創傷領域の測定値に匹敵します。(C)Aにおける創傷面積の経時的な正規化された減少。(D)Bにおける創傷面積の経時的な正規化された減少。(E)14の小さな創傷の経時的な創傷面積の平均減少。n = 14。SEMの平均±を中心としたエラーバー。 スケールバー:50 μm この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 5.メソグレア注射 注射皿の作成PDMS基剤と硬化剤とを組み合わせてポリジメチルシロキサン(PDMS)を、硬化剤1重量部に対して塩基10部の割合で調製する。激しくかき混ぜて、ベースと硬化剤を完全に混合します。 気泡を除去するには、混合物を真空チャンバーに15分間入れます。マイクロ遠心チューブキャップ付きの60mmペトリ皿に混合物を注ぎ、金型を所定の位置に保持します。すぐに金型をチューブキャップに45°傾けて置き、所定の位置にテープを貼ります。金型は、3つの積み重ねられたオフセットガラススライドを接着して、最終的な射出皿に隆起を作成します。 皿全体、型、および混合物を60°Cのオーブンに2時間入れて、エラストマーを硬化させます。完成した射出皿の型を取り外します。 マイクロピペット牽引微小電極プーラーを使用して、引っ張りプログラムを設計します。高速でワンステッププログラムを使用します。熱はガラスRAMPテスト結果55、56とほぼ同じです。得られたマイクロピペットに、長く一貫したテーパーがないか確認してください。注意: 外径1.0mm、内径0.75mm、長さ10cmの薄肉ガラスホウケイ酸キャピラリーを使用してください。 染料や薬の注射マイクロインジェクションニードルを作ります(上記のように)。 メデューサに注射するための過剰量の染料または薬物を入れた長いピペットチップを使用して、マイクロインジェクションニードルを埋め戻します。注:Clytiaの場合、 DMSO濃度が高いと創傷治癒が妨げられるため、ジメチルスルホキシド(DMSO)をASWで<1:100希釈に保つ必要があります。.透明な溶液を注入する場合は、ファストグリーンFCF溶液(ASW中の0.1%ファストグリーンFCFの1:100希釈)を加えて、注入された液体を視覚化できます。 上記のように改造されたトランスファーピペットを使用して、サブアンブレラを上に向けてメデューサを、動物を覆うのに十分なASWを備えたPDMS注射皿に入れます(図5C)。解剖スコープのステージに皿を置きます。注:過剰なASWを制限すると、メデューサが皿の中を泳ぐのを防ぎ、より成功した注射を可能にします。 マイクロインジェクションの針先に焦点を合わせ、メデューサ近くの水中に進めます。マイクロマニピュレーターを使用して、針が曲がって折れるまで皿に押し込みます。この先端開口部は約10〜20μmです。注意: この針は、その日の同じ染料/薬物注射に繰り返し使用できます。毎日新鮮なチップを使用し、別々の染料/薬に使用することをお勧めします。 マイクロマニピュレーターを使用して、外傘に穴を開けることなく、針の先端をサブアンブレラを通してメソグレアに挿入します。注意: 上皮のしわ/折り畳みが目立ちます。針がメデューサに挿入されると、折り目/折り畳みは停止します。 マイクロインジェクターで、保持圧力をゼロに設定し、吐出圧力を≤20PSIに設定します。1つまたは2つの象限に注入し、それぞれにその象限の領域の約1/4の染料または薬物のスポットを充填します。注:メデューサのサイズに応じて、シングルインジェクションスポットでは大容量または少量が適切です。メデューサをいっぱいにすると、上皮に極度の損傷を与え、さらには動物を死に至らしめます。 注入される染料または薬物に応じて、動物は新鮮なASWのビーカーに入れられ、染料または薬物の拡散とインキュベーションが可能になります。 イメージングを行うには、改造トランスファーピペットを使用してメデューサをうつ病スライドに取り付け、傘が上を向くように動物を配置します(図5)。注射された試薬の効果をテストするために、この段階で動物を負傷させることができます。 図5:ECMに染料または薬物を導入するための注射セットアップ。(A) インジェクションのセットアップ。( B) マイクロインジェクション針の向きを示す注射セットアップのクローズアップ(皿内の動物に対して約45°の角度)。 (C) 注射用の少量のASW中のメデューサによるシリコーン注射皿のクローズアップ。 (D) ファストグリーンFCFを搭載したマイクロインジェクションニードルが、サブアンブレラを通ってメデューサの中層に入ります。 (E) マウントされたメデューサへのファストグリーンFCFのポストインジェクション。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。