JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

אפיון ריפוי פצעי אפיתל in vivo באמצעות אורגניזם המודל הקנידרי Clytia hemisphaerica

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/65081
, ,
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology,The University of Chicago

Summary

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת פצעים באפיתל של מדוזה חיה של Clytia hemisphaerica וריפוי פצעים ברזולוציה גבוהה in vivo. בנוסף, מוצגת טכניקה להחדרת צבעים ותרופות להפרעות לתהליכי איתות בתאי האפיתל ובמטריצה החוץ תאית במהלך ריפוי פצעים.

Abstract

כל איברי בעלי החיים, מהעור, דרך העיניים ועד המעיים, מכוסים ביריעות של תאי אפיתל המאפשרים להם לשמור על הומאוסטזיס תוך הגנה עליהם מפני זיהום. לכן, אין זה מפתיע כי היכולת לתקן פצעים אפיתל הוא קריטי לכל metazoans. ריפוי פצעי אפיתל בבעלי חוליות כרוך בתהליכים חופפים, כולל תגובות דלקתיות, וסקולריזציה ואפיתל מחדש. ויסות תהליכים אלה כרוך באינטראקציות מורכבות בין תאי אפיתל, תאים שכנים והמטריצה החוץ תאית (ECM); ה-ECM מכיל חלבונים מבניים, חלבוני בקרה ומולקולות קטנות פעילות. מורכבות זו, יחד עם העובדה שלרוב בעלי החיים יש רקמות אטומות ואק”מ בלתי נגיש, מקשה על ריפוי פצעים בבעלי חיים חיים. עבודה רבה על ריפוי פצעי אפיתל מתבצעת אפוא במערכות תרבית רקמה, עם סוג תא אפיתל יחיד מצופה כשכבה אחת על מטריצה מלאכותית. Clytia hemisphaerica (Clytia ) מספק השלמה ייחודית ומרגשת למחקרים אלה, ומאפשר ריפוי פצע אפיתל להיחקר בחיה שלמה עם ECM אותנטי. אפיתל אקטודרמלי של Clytia הוא שכבה אחת של תאי אפיתל קשקשיים גדולים, המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ ניגוד מפריע דיפרנציאלי (DIC) בבעלי חיים חיים. היעדר פיברובלסטים נודדים, כלי דם או תגובות דלקתיות מאפשר לנתח את האירועים הקריטיים באפיתל מחדש in vivo. ניתן לנתח ריפוי של סוגים שונים של פצעים, כולל מיקרו-פצעים חד-תאיים, פצעי אפיתל קטנים וגדולים ופצעים הפוגעים בקרום המרתף. במערכת זו ניתן לראות היווצרות למליפודיה, התכווצות מיתרי ארנק, מתיחת תאים ונדידת תאים קולקטיבית. יתר על כן, סוכנים פרמקולוגיים ניתן להציג באמצעות ECM כדי לשנות אינטראקציות תא:ECM ותהליכים תאיים in vivo. עבודה זו מציגה שיטות ליצירת פצעים בקליטיה חיה, לכידת סרטי ריפוי, וחקירת מנגנוני ריפוי על ידי מיקרו-הזרקת ריאגנטים לתוך ECM.

Introduction

יריעות של תאי אפיתל מכסות את פני השטח החיצוניים של כל המטזואנים, מרפדות איברים פנימיים ומחלקות את גוף החיה לתאים נפרדים. האפיתל גם מפריד את הגוף הפנימי מהסביבה החיצונית ומגן עליו מפני נזק וזיהום. לפיכך, הופעתן של שכבות אפיתל הייתה חלק מהותי באבולוציה של בעלי חיים רב-תאיים, ושכבות אפיתל נראות בכל בעלי החיים, החל מבעלי חוליות וכלה במטזואנים הבסיסיים ביותר1. האפיתל של איברים מסוימים הוא חד-שכבתי יחיד, כגון בשקי האוויר של הריאה, בכלי הדם ובמעיים2, כמו גם באפידרמיס של חסרי חוליות כגון פלנריה וקנידריאן3. ברקמות אחרות, כגון עור4 וקרנית5 של בעלי חוליות, האפיתל מרובד, כלומר יש שכבות מרובות של תאי אפיתל2. בכל המקרים, שכבת האפיתל הבסיסית ביותר מוצמדת לקרום המרתף, יריעת חלבון היוצרת אזור מיוחד של המטריצה החוץ תאית (ECM)6,7,8.

פרצות באפיתל חייבות להיות מתוקנות במהירות כדי ליצור מחדש יריעת אפיתל רציפה. נזק לאפיתל מתרחש במהלך תהליכים טבעיים, כגון שפיכת תאי אפיתל במעיים,9,10 וכתוצאה מדלקת או טראומה פיזית. כאשר תא אפיתל יחיד ניזוק, הוא חייב לתקן את עצמו או להיות מסולק כדי לאפשר לתאים הסובבים אותו להיצמד זה לזה ולסגור את החור11,12. בפצעים הגדולים מגודלו של תא בודד, תאי אפיתל חייבים לנוע כדי להגיע זה לזה ולתקן את היריעה13. זה יכול להיות מושג על ידי התפשטות תאים אם הפערים קטנים או עשוי לדרוש נדידה של תאי אפיתל משולי הפצע כדי לסגור את פער הפצע; תהליך אחרון זה נקרא אפיתל מחדש14,15. ברקמות עובריות, תאי אפיתל מתפשטים ונודדים לסגור פצעים או נמשכים על פני הרווח על ידי התכווצות של כבלי אקטומיוזין הנוצרים בין התאים בשולי הפצע, במנגנון הדומה לחוט ארנק16. ברקמות בוגרות רבות, אפיתל מחדש כרוך בנדידה של יריעות תאים קוהרנטיות, שם התאים שומרים על הצמתים שלהם עם תאים שכנים14,17,18. ברקמות אחרות, קשרי תאים:תאים מפורקים ותאי אפיתל מתנהגים יותר כמו תאים מזנכימליים, נעים באופן מתואם אך עצמאי לאזור הפצע במהלך אפיתל מחדש 14,19,20,21.

תנועות תאי אפיתל מווסתות על ידי אינטראקציות מורכבות בין התאים הנודדים ובין התאים לבין ECM. בעוד שיש כמות עצומה של ספרות ניסיונית העוסקת במנגנונים של הפעלת פצעים של תאי אפיתל ונדידה לאחר מכן, הרבה עדיין נותר לגלות. לדוגמה, האות הראשוני שמפעיל תאי אפיתל לנדוד בתגובה לפצע לא זוהה בוודאות 22, וגם לא לגמרי מובן כיצד אקטין נפרס מחדש כדי ליצור למליפודיה בצד תאי האפיתל הקרוב ביותר לפצע 22,23,24,25,26,27. נדידת תאים קולקטיבית דורשת שיתוף מידע מתאים בפצע עם תאים דיסטליים לפצע, ומסלול התקשורת עדיין אינו ברור28. Cell:cell junctions and cell:ECM attachments חייבים להיות מפורקים ומתוקנים כאשר תאים בגיליון מסדרים את עצמם מחדש, אך רגולציה של תהליך זה אינה מובנת היטב 14,29. התקדמות בשאלות אלה ואחרות חשובה לא רק כבעיה ביולוגית בסיסית, אלא גם בגלל המשמעות הקלינית של ריפוי פצעים נכון. מחלות הפוגעות ביכולתם של תאי אפיתל לנדוד כראוי גורמות לפצעים כרוניים; דוגמה לכך היא המחלה הגנטית Epidermolysis bullosa, שבה גנים המעורבים בחיבור תאי האפיתל ל- ECM עוברים מוטציה, וכתוצאה מכך עור שביר שמתקלף ושלפוחיות. אפיתל מחדש נפגע גם ברקמות הזדקנות טבעית30,31. לכן הבנה טובה יותר חיונית לפיתוח התערבויות לשיפור תוצאות ריפוי הפצעים.

נדידת תאי אפיתל בריפוי פצעים נחקרה הן בגישות מבחנה והן באורגניזמים מודל. רוב המחקרים על ריפוי פצעים ומנגנוני נדידת תאים בוצעו בתרבית רקמה, שבה מונושכבות מסוג תא אפיתל יחיד גדלות על מצע המחליף את ECM. חד-שכבות תאים נשרטות או גדלות עם שבלונות כדי ליצור רווחים של צורות וגדלים ספציפיים ולאחר מכן נצפו32,33,34. מודל המבחנה מאפשר הדמיה אידיאלית של התנהגות התא, כמו גם הזדמנות לשנות את איכויות המצע, לחשוף תאים לתרופות ולגורמים אביוטיים וביוטיים ולהדביק תאים במבנים המבטאים או מדכאים גנים שונים בעלי עניין. עם זאת, גישה רדוקציוניסטית זו עלולה להיכשל בללכוד כמה מהפרמטרים החשובים המעורבים בהתנהגות תאי אפיתל בהקשר in vivo, כולל תקשורת בין סוגי תאים שונים ואירועי איתות המתרחשים ב- ECM11. מודלים In vivo מספקים את ההקשר האותנטי של פצע, עם סוגי תאים מרובים, מסלולי איתות חופפים ו- ECM35 מורכב. מודל אחד כזה למחקרי ריפוי פצעים הוא עכבר19, שבו ההתקדמות האחרונה אפשרה לחוקרים לצפות בתאי אפידרמיס במהלך ריפוי פצעים בעובי מלא בבעלי חיים36. עם זאת, העכבר ומערכות in vivo אחרות מציבות אתגרים לחקר אפיתל מחדש. ראשית, היתרון הגדול של התבוננות בהתנהגות התא בהקשר טבעי מאוזן על ידי המורכבות של האירועים החופפים זמנית המתרחשים במהלך ריפוי פצעים בחוליות, כולל קרישת דם, גיוס תאי חיסון ודלקת, גיוס פיברובלסטים ודה-התמיינות תאים, וסקולריזציה מחדש ועיצוב מחדש של ECM. יתר על כן, רקמות אטומות מקשות על הדמיה. מערכות האפידרמיס של זחלי דרוזופילה ודגי זברה 37,38 התגברו על חלק מהקשיים הללו בגלל פשטותם היחסית 39.

המעבדה שלנו הציגה לאחרונה מודל חדש לחקר ריפוי פצעי אפיתל: צורת המדוזה (מדוזות) של Clytia hemisphaerica (Clytia)40. קליטיה היא אורגניזם מודל מתפתח עם גנום 41 מרוצף ומבואר במלואו, תעתיק RNAseq42 של תא בודד, ופרוטוקולים לשינוי גנום (מוטגנזה וטרנסגנזה)43,44,45. קנידארים הם אחת השושלות העתיקות ביותר שקיימות שיש להם שכבות אפיתל, כך שהבנת ריפוי פצעים קנידאריים מספקת תובנות לגבי מסלולי האבות שהבטיחו שלמות אפיתל. עבור אותם מסלולים שנשמרו לאורך עץ החיים, Clytia מציעה מערכת חדשה ומלהיבה לחקר דינמיקה של תאי אפיתל והרגולציה התפקודית של ריפוי פצעים in vivo.

האפיתל המכסה את פני השטח העליונים של Clytia medusa (exumbrella) הוא חד-שכבה של תאי אפיתל שקופים וקשקשיים שרוחבם כ-50 מיקרומטר ועובי 1-2 מיקרומטר (איור 1). הם מחוברים ל-ECM שנקרא mesoglea – ה”מדוזה” של המדוזות. המזוגליאה דומה בהרכבה ל-ECM שנמצא אצל בעלי חיים אחרים 46,47,48 כולל בעלי חוליות, יש לו קרום מרתף 40, והוא שקוף לחלוטין. שכבת האפיתל במדוזה Clytia ניתנת לשריטה או לפציעה בקלות (ראה להלן). הפשטות והשקיפות של האפיתל וה-ECM מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של התאים ותנועותיהם במהלך הריפוי. לאחרונה, Kamran et al. אפיינו את ריפוי פצעים קטנים באפיתל Clytia בפירוט40. הוכח כי ריפוי בקליטיה מתרחש באמצעות זחילת תאים מבוססת למליפודיה, התפשטות תאים ונדידת תאים קולקטיבית, כמו גם סגירת חוט ארנק האופיינית יותר למערכות עובריות (אם כי נראתה בעבר במבנים של בעלי חיים בוגרים כגון הקרנית49). ריפוי פצעי קליטיה הוא מהיר ביותר, כפי שנראה במערכות אחרות שאין בהן תגובה דלקתית40,50. הריפוי ב-Clytia exumbrella תלוי לחלוטין בתנועות של תאי האפיתל הקיימים – אין תאים שמתרבים או נודדים דרך ה-ECM לאתר הפצע (סרט משלים 1). כל הממצאים הללו מצביעים על כך שקליטיה היא מערכת מודל שימושית לחקר ריפוי פצעי אפיתל. ואכן, קלות ההדמיה של תאי אפיתל בקליטיה במהלך ריפוי פצעים הובילה לגילוי כי למליפודיה של תאי אפיתל מתרחבת ומתפשטת על פני אזורים של ECM חשוף כל עוד יש קרום מרתף שלם; אם קרום המרתף ניזוק, ריפוי אפיתל עובר למנגנון מיתרי ארנק40. זו הייתה ההדגמה הראשונה של מנגנון העומד בבסיס ההחלטה לסגור על ידי זחילה מבוססת למליפודיה לעומת סגירת חוט ארנק, תוך הדגשת החשיבות של אינטראקציות ספציפיות בין תאים ל-ECM בריפוי ובהתבוננות בתאים בהקשר הטבעי שלהם.

להלן מתוארים פרוטוקולים ליצירה והדמיה של מיקרו-פצעים חד-תאיים, פצעים קטנים שנסגרים בעיקר על-ידי התפשטות תאים, ופצעים גדולים שדורשים נדידת תאים קולקטיבית כדי להיסגר. יתר על כן, מתואר פרוטוקול להחדרת מולקולות קטנות לתאי ECM ואפיתל, המאפשר הפרעות ניסיוניות של מסלולי בקרה משוערים של ריפוי פצעים.

Protocol

1. תרבות בעלי חיים שמרו על מושבות פוליפ קליטיה על מגלשות מיקרוסקופ ומדוזות במי ים מלאכותיים (ASW) בטמפרטורה של 18°C במערכת דגי זברה, עם מכלי דגי זברה בנפח 2 ליטר למושבות פוליפ ומיכלי פסאודו-קרייזל 5 ליטר בהתאמה אישית למדוזה (איור משלים 1)51. ASW מורכב מ-4% אוקיינוס מיידי בדה-יוניזציה (DI) H2O. האכילו את בעלי החיים מדי יום בארטמיה בת 2-3 ימים כמתואר51.הערה: הדמיית ריפוי פצעים קלה יותר אם בעלי החיים לא הוזנו לאחרונה, מכיוון שיש פחות פסולת המשתחררת מהמעיים לשדה הראייה. אספו מדוזה לתינוקות ממושבות הפוליפ המבוססות לפי הצורך על ידי הנחת מושבות בכד 2 L מלא ב- 1 L של ASW למשך הלילה. השתמשו במדוזה נשית בת 2-3 שבועות לכל ניסויי ריפוי הפצעים. התפשטות קליטיה תוארה בפירוט במקום אחר51. 2. פציעה יצירת מיקרו-פצעים בתוך ובין תאים (20-500 מיקרומטר2)צור פיפטת העברה שונה על ידי חיתוך הקצה עם מספריים כדי ליצור פתח גדול יותר (0.5-0.7 ס”מ קוטר).הערה: הפתח בפיפטה צריך להיות רחב מספיק כדי למנוע נזק לחיה. באמצעות פיפטת ההעברה השונה, הניחו את המדוזה על מגלשת דיכאון כאשר מדוזה exumbrella פונה כלפי מעלה, עם מספיק ASW כדי לכסות את החיה. הניחו מיד את הכיסוי מעל החיה והתמונה (ראו בהמשך תיאור ההדמיה). הכיסוי דוחס את המזוגליאה, והריבאונד של הרקמה הדחוסה יוצר כוח שדוחף מעט את התאים זה מזה52 . זה מופיע מיד כרווחים בין כל תא ונזק בתוך חלק מהתאים (איור 1B,B’, איור 2 ואיור 3A-C). יצירת פצעי אפיתל קטנים (0.02-0.125 מ”מ2)באמצעות פיפטת העברה שונה (כנ”ל), מניחים את המדוזה על מגלשת דיכאון כאשר אקסמטריית המדוזה פונה כלפי מעלה. בעזרת קצה פיפטה של 200 μL, מגרדים בעדינות את פני השטח של המדוזה. גירוד עדין יכול גם ליצור קרעים בקרום המרתף, אשר נראים בקלות22. כסו את בעל החיים בתלוש כיסוי להדמיה. לחלופין, מיקום הכיסוי מספיק לפעמים כדי ליצור פצעי אפיתל קטנים אפילו בלי לגרד (איור 1C,C’, איור 2 ואיור 3A-C).הערה: אין ללחוץ כלפי מטה בעת גירוד פני השטח של המדוזה, מכיוון שהדבר פוגע ב- ECM ויוצר משטח לא סדיר – תאי אפיתל הנודדים על משטח לא סדיר קשה יותר לשמור על מיקוד. יצירת פצעי אפיתל גדולים (0.5-0.9 מ”מ2)צור מחט מיקרו-הזרקה באמצעות מושך מיקרופיפטה וצינור נימי זכוכית (שלב 5.2). הניחו את מחט המיקרו-הזרקה הריקה במחזיק מיקרו-מזרק המודבק למיקרומניפולטור. חותכים את קצה המחט כך שהפתח הוא כ 20-40 מיקרומטר.הערה: ניתן לאחסן מחטים חתוכות עבור פצעי אפיתל גדולים ולעשות בהן שימוש חוזר כדי להגביר את העקביות בין ניסויים. הגדר את לחץ האחיזה על המיקרו-מזרק לאפס, והגדר את לחץ הפליטה לכ- 20 PSI. הגדר את המיקרו-מזרק כך שיספק פולס אוויר של 2 שניות.הערה: ייתכן שיהיה צורך לכוונן את לחץ הפליטה בהתבסס על קוטר פתח המחט (כלומר, קצוות קטנים יותר ישתמשו בלחץ גבוה יותר, בעוד שקצוות גדולים יותר ישתמשו בלחץ נמוך יותר). הניחו את המדוזה עם המטרייה הפונה כלפי מעלה על מגלשת דיכאון על הבמה של היקף ניתוח, עם מספיק ASW כדי לכסות את החיה. באמצעות המיקרומניפולטור, התאם את קצה מחט המיקרו-הזרקה כך שיהיה ממש מעל המים. כדי לעשות זאת, בזהירות לטבול את קצה לתוך מים (מים עשויים להיכנס קצה פיפטה), ולאחר מכן למשוך אותו כך שהוא קרוב למשטח האפיתל של המדוזה.הערה: יש למקם את החוד מעל רביע אחד של המדוזה. התעלות הרדיאליות של המדוזה מחלקות את פעמון המדוזה לארבעה רבעים נפרדים. התמקדות ברביע תביא להדמיה נקייה יותר, מכיוון שהגונדות והתעלות הרדיאליות אינן נכללות באזור הפצע. דופק אוויר על ידי לחיצה על התחל על המזרק. חזור על הדופק באותה נקודה פעמיים עד ארבע פעמים, בהתאם לרוחב הקצה. טיפים גדולים יותר דורשים פחות פולסים.הערה: כניסה במים/מדוזה הנגרמת על ידי דופק האוויר צריכה להיות גלויה. כסו את החיה הפצועה בכיסוי להדמיית פצעים גדולים (איור 1D,D’). בצע את השלבים הבאים (סעיף 3) להדמיית ריפוי פצע אפיתל. איור 1: שכבת אפיתל אקסמטריה שלמה ופצועה ב-Clytia medusa. (A) גרפיקה מצוירת של גוף Clytia medusa. (א’) אפיתל שלם medusa exumbrella במבט מלמעלה. (B) קריקטורה של מיקרו-פצעים חד-תאיים (צורות אדומות ומשוננים) עם תאי אפיתל בכחול. (ב’) מיקרו-פצעים חד-תאיים. (C) קריקטורה של פצע אפיתל קטן (צורה משוננת אדומה). (ג’) פצע אפיתל קטן. (D) קריקטורה של פצע אפיתל גדול (צורה משוננת אדומה). (ד’) פצע אפיתל גדול. כל התמונות הושגו באמצעות מיקרוסקופ DIC. פסי קנה מידה ב (A’-C’): 50 מיקרומטר. סרגל קנה מידה ב- (D’): 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: פצעים מרובים וקרום מרתף פגוע. מוצג פצע אפיתל אקסמטריה קטן טיפוסי, עם תוויות המציינות למליפודיה הנוצרת מתאים שוליים. בנוסף, microwounds בתוך ובין תאי אפיתל נראים. שימו לב לקרע הקטן בקרום המרתף בחלק העליון של הפצע. סרט 4 מראה ריפוי של פצע זה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 3. הדמיה ריפוי פצע אפיתל ודא כי המיקרוסקופ מיושר עבור הארה קוהלר53 וכי הוא הוגדר כראוי עבור מיקרוסקופ ניגודיות מפריעה דיפרנציאלית (DIC)54. תאי אפיתל הם כמעט בלתי נראים באופטיקה סטנדרטית (איור 3D,E). התאם את המוקד ל- exumbrella. למרות שמדובר בשכבה דקה, תאים משושים צריכים להיות ברורים.הערה: exumbrella ו subumbrella מופרדים על ידי mesoglea עבה הנתמך על ידי סיבים אנכיים. התאים התת-מטריים נמצאים באותו מישור מוקד כמו התעלות הרדיאליות. אם מתמקדים תחילה בשכבת התת-מטרייה, התאימו את המיקוד באיטיות דרך המזוגליאה והסיבים האנכיים עד למציאת האקסמטריה. זיהוי ידני של פצע לצורך הדמיה. עבור פצעים גדולים, השתמש במטרה של פי 10. עבור פצעים קטנים יותר ופצעים חד-תאיים, השתמש במטרה של פי 20. הפעל תוכנית שאוספת תמונות כסרט בזמן אמת או שאוספת סידרה של תמונות במרווחי זמן קבועים. עקוב אחר ההתקדמות כדי לוודא שאזור הפצע אינו נסחף אל מחוץ לשדה הראייה ושהתאים המעניינים נשארים ממוקדים.פצעים חד-תאיים נסגרים תוך דקה; לכן, דמיינו את הסגירה שלהם עם סרט. כדי ללכוד פרטים על דינמיקת תאים עבור פצעים קטנים, אסוף תמונות בערך כל 10 שניות. סגירת פצעים קטנים אורכת 20-50 דקות בהתאם לגודל. אל תדמיינו את המגלשות הלא אטומות במשך יותר מ-45 דקות, מכיוון שאידוי המים מהמגלשה לאורך זמן מוביל למוות של בעלי חיים ולקרע של התאים. להשגחה ארוכה יותר, אטמו סביב הכיסוי עם וזלין כדי להפחית את האידוי.הערה: חלק מהמדוזה עלולה לפעום בשקופית, מה שמפריע להדמיה. במקרה זה, הרכבה של בעלי חיים בדילול 1:10 של 1% אתיל 3-אמינובנזואט מתאן-סולפונט (טריקאין), מותאם ל-pH 7.5, ב-ASW משמשת כהרדמה יעילה ואין לה השפעה נראית לעין על ריפוי במסגרת זמן של שעה אחת. עם זאת, החיות ימותו אם יישארו במשך מספר שעות בטריקאין. איור 3: יצירת פצע קטן באפיתל exumbrellar. (A) גירוד עדין של האקסמטריה עם קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר ליצירת פצע אפיתל קטן. (B) לעיתים די בהנחת הכיסוי כדי ליצור פצעי אפיתל קטנים. (C) מדוזה רכובה על מגלשת דיכאון. (D ) תמונת פצע אפיתל קטן ללא אופטיקת DIC ו -(E) עם אופטיקת DIC. פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 4. ניתוח הכנת קובצי תמונההערה: כדי לעבד את קובצי התמונה, השתמש ב- FIJI/ImageJ עם תוספי BioFormat מעודכנים.קבעו את קנה המידה ליחס הנכון של פיקסלים למיקרון לפני רישום אוסף התמונות; נתח > הגדרת קנה מידה. זה הכרחי לחילוץ מדידות גודל בפועל בניתוחים במורד הזרם. לעתים קרובות, החיה נסחפת מעט על שקופית המיקרוסקופ; לכן, כדי למנוע סחף בסרטים, רשום את התמונות באמצעות יישור מחסנית ליניארית של תוסף FIJI עם SIFT. תוספים > רישום > יישור מחסנית ליניארי עם SIFT. שמור את הערימה הרשומה כקובץ .avi. קובץ > שמירה בשם > AVI… בחלון הקופץ, הגדר את קצב המסגרות (האיורים המונפשים כאן מוגדרים ל- 10 fps) ולחץ על OK. השתמש בפלט זה כדי לבצע ניתוח ריפוי פצעים. ניתוח אזור הפצעבעזרת הכלי לאסו ב- FIJI/ImageJ, שרטט את הפצע על-ידי מעקב אחר קצות התא. מדוד את אזור הפצע שתואר זה עתה באמצעות Command +M או CTRL+M. יש לחזור על מדידת שטח הפצע כל 10 פריימים. לאחר מכן ניתן לשרטט את המדידות מ-FIJI/ImageJ באמצעות פריזמה 9 (איור 4). איור 4: ניתוח אזור הפצע בפצעי אפיתל קטנים. (A ) דוגמה לריפוי פצע אפיתל קטן במשך 10 דקות. (B) דוגמה לריפוי פצע אפיתל אחר במשך 21 דקות. קווי המתאר הסגולים ב-A,B דומים למדידות של אזורי פצעים באמצעות הכלי לאסו ב-FIJI/ImageJ. (ג) הפחתה מנורמלת של אזור הפצע לאורך זמן ב-A. (D) הפחתה מנורמלת של אזור הפצע לאורך זמן ב-B. (E) הפחתה ממוצעת של שטח הפצע לאורך זמן עבור 14 פצעים קטנים. n = 14. קווי שגיאה מרוכזים סביב ממוצע ± SEM. פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 5. זריקות מזוגליאליות יצירת צלחת הזרקההכן פולידימתילסילוקסאן (PDMS) על ידי שילוב בסיס PDMS וסוכן ריפוי, ביחס של 10 חלקים בסיס ל 1 סוכן ריפוי חלק לפי משקל. מערבבים במרץ לערבוב מלא של הבסיס וחומר הריפוי. כדי להסיר בועות, לשים את התערובת בתא ואקום במשך 15 דקות. יוצקים את התערובת לצלחת פטרי 60 מ”מ עם מכסי צינור מיקרוצנטריפוגה כדי להחזיק את התבנית במקומה. מניחים מיד את התבנית על מכסי הצינור בשיפוע של 45 מעלות ומדבקים במקום. התבנית מורכבת משלוש שקופיות זכוכית מוערמות, אופסט המודבקות זו לזו ליצירת רכסים בצלחת ההזרקה הסופית. הכניסו את כל התבשיל, התבנית והתערובת לתנור בטמפרטורה של 60°C למשך שעתיים כדי לרפא את האלסטומר. מוציאים את התבנית לצלחת הזרקה שהושלמה. משיכת מיקרופיפטהבאמצעות מושך מיקרואלקטרודות, תכנן תוכנית משיכה. השתמש בתוכנית חד-שלבית עם מהירות גבוהה. החום הוא בערך תוצאת בדיקת RAMP זכוכית55,56. בדוק micropipettes המתקבל עבור tapers עקבי ארוך.הערה: השתמש בנימי בורוסיליקט דקים מזכוכית קיר בקוטר חיצוני של 1.0 מ”מ, בקוטר פנימי של 0.75 מ”מ ובאורך של 10 ס”מ. הזרקת צבעים וסמיםלעשות מחט microinjection (כנ”ל). מלאו את מחט המיקרו-הזרקה בעזרת קצה פיפטה ארוך עם נפח עודף של צבע או תרופה להזרקה למדוזה.הערה: עבור Clytia, dimethyl sulfoxide (DMSO) צריך להישמר בדילול <1:100 עם ASW, כמו ריכוזי DMSO גבוהים יותר לעכב ריפוי פצע. אם מזריקים תמיסה ברורה, ניתן להוסיף תמיסת FCF ירוקה מהירה (דילול 1:100 של 0.1% FCF ירוק מהיר ב- ASW) כדי להמחיש את הנוזל המוזרק. באמצעות פיפטת העברה שונה כפי שלמעלה, הניחו מדוזה כאשר תת-המטריה פונה כלפי מעלה לתוך צלחת הזרקת PDMS עם מספיק ASW כדי לכסות את החיה (איור 5C). מניחים את המנה על הבמה של היקף ניתוח.הערה: הגבלת ASW עודף מונעת מהמדוזה לשחות בצלחת ומאפשרת זריקות מוצלחות יותר. התמקדו בקצה מחט המיקרו-הזרקה וקדמו אותה למים ליד המדוזה. בעזרת המיקרומניפולטור, לחץ על המחט לתוך הצלחת עד שהיא מתכופפת ונשברת. פתח חוד זה הוא כ 10-20 מיקרומטר.הערה: ניתן להשתמש במחט זו שוב ושוב עבור אותן זריקות צבע/תרופה באותו יום. מומלץ להשתמש בטיפ טרי בכל יום ולצבעים/תרופות נפרדות. באמצעות micromanipulator, להכניס את קצה המחט דרך subumbrella לתוך mesoglea מבלי לנקב את exumbrella.הערה: קימוט/קיפול של האפיתל יהיה מורגש. ברגע שהמחט מוחדרת למדוזה, הקמט/קיפול מפסיק. במיקרו-מזרק, הגדר את לחץ האחיזה לאפס ואת לחץ הפליטה ל- ≤20 PSI. יש להזריק לרביע אחד או שניים, ולמלא כל אחד מהם בכתם צבע או סם בערך 1/4 משטח הרביע.הערה: בהתאם לגודל המדוזה, נפחים גדולים או קטנים יותר מתאימים בנקודות הזרקה בודדות. מילוי יתר של המדוזה גורם לנזק קיצוני לאפיתל ואף למוות של החיה. תלוי איזה צבע או סם מוזרקים, בעלי חיים מוכנסים לתוך של ASW טרי כדי לאפשר צבע או פיזור סמים ודגירה. לצורך הדמיה, הרכיבו את המדוזה על מגלשת שקע באמצעות פיפטת העברה שעברה שינוי, ומקמו את החיה כך שהאקסמטריה פונה כלפי מעלה (איור 5). בעלי חיים יכולים להיפצע בשלב זה כדי לבחון את ההשפעה של מגיב מוזרק. איור 5: מערך הזרקה להחדרת צבעים או תרופות ל-ECM. (א) מערך הזרקה. (B) תקריב של מערך ההזרקה המראה את כיוון מחט המיקרו-הזרקה (זווית של כ-45° ביחס לחיה בצלחת). (C) תקריב של צלחת הזרקת הסיליקון עם המדוזה בכמות קטנה של ASW להזרקה. (D) מחט מיקרו-הזרקה עמוסה ב-FCF ירוק מהיר הנכנסת למזוגליאה של המדוזה דרך תת-המטריה. (E) לאחר הזרקה של FCF ירוק מהיר במדוזה רכובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Representative Results

בהתאם לפרוטוקולים לעיל, צולמו מיקרו-פצעים חד-תאיים, פצעים קטנים ופצעים גדולים. ערימות רשומות של קובצי תמונה נשמרו כקובצי .avi. בסרט 1 אפשר לראות מיקרו-פצעים נסגרים בין התאים ובתוכם (איור 1 ואיור 2). Lamellipodia קטנים נצפים במהלך הסגירה, ואחריו התכווצות וריפוי. פסולת נשללת ומשוחררת למים. הריפוי מסתיים תוך דקה או פחות. בסרטים 2 ו-3, פצעים קטנים בצורות שונות נרפאים באמצעות היווצרות למליפודיה, הרחבה של מגעים למליפודיאליים והתפשטות תאים בשולי הפצע, כפי שתואר קודם לכן40 (איור 1 ואיור 2). תאים בשכבות מאחורי תאי השוליים אינם משתתפים בריפוי פצעים בגודל כזה וגם אין נדידת תאים קולקטיבית. סגירה מהירה ומתקדמת של פערי אפיתל מלווה בהתכווצות רקמות לאורך תפר הפצע החדש שנוצר40. קצב הריפוי המנורמל של שני הפצעים האלה, המתבטא כאחוז מהשטח המקורי לאורך זמן, מוצג (איור 4C,D). בעוד שקיימת שונות מסוימת בדינמיקה של סגירת פצעים, ממוצע אחוזי סגירת השטח לאורך זמן עבור 14 פצעים בצורות שונות בטווח של 0.02-0.125 מ”מ2 מאפשר לבסס עקומה ממוצעת לריפוי פצעים בחיות שלא טופלו (איור 4E). נזק לקרום המרתף נראה בבירור כאשר הוא מתרחש (איור 2). בסרט 4, תאים בשולי פצע קטן שבו יש נזק לקרום המרתף מתפשטים סביב האזור הפגוע, וסגירת הפער מסתיימת עם כיווץ חוט ארנק. אם הרקמה מיובשת או פגומה מכדי לתקן, תנועות התאים יכולות להיפסק, או שכל גיליון התאים יכול להתפוצץ (סרט 5 וסרט 6). זה קורה בדרך כלל לאחר תקופות ארוכות של הדמיה (45 דקות או יותר). אם התפוצצות התא מתרחשת בשלב מוקדם של ההדמיה, הדגימה מושלכת. כפי שניתן לראות בסרט 7, פצעים גדולים מחלימים בכמה שלבים. ראשית, קצה הפצע הופך חלק וסדיר עקב התכווצויות בשוליים, כפי שדווח קודם לכן57. לאחר מכן, נראה כי למליפודיה נוצרת מהתאים בשולי הפצע, כאשר למליפודיה נעה קדימה כדי למקסם את המגע עם למליפודיה סמוכה. מעקב אחר הגרעינים בתאים בשולי הפצע ובכמה שכבות מאחורי תאי השוליים מראה כי פערים גדולים נסגרים על ידי נדידת תאים קולקטיבית40. תאים לעולם אינם מתנתקים אלא נעים יחד כגיליון. הכנסת צבעים וחומרים פרמקולוגיים יכולה להיות כלי רב עוצמה לניתוח מנגנונים ביולוגיים. חומרים רבים אינם נכללים בקליטיה (לא מוצג), כנראה בגלל שכבת הריר שמצפה את פני השטח של החיה. עם זאת, ניתן להשתמש במיקרו-הזרקה כדי להחדיר מולקולות ישירות לתוך ה-ECM, לשבש את מבנה ה-ECM או להפריע לפעילות הרגולטורית ב-ECM. בנוסף, צבעים ומולקולות אחרות מסוגלים להיכנס לתאי אפיתל מהצד הבסיסי. לדוגמה, איור 6 מראה צביעה גרעינית עם Hoechst, צביעת קרום עם FM1-43, ועיכוב של היווצרות למליפודיה על-ידי ציטוכלסין B לאחר שהריאגנטים האלה מוזרקים במיקרו לתוך ה-ECM. החדרת מולקולות אלה לתאי ה-ECM והאפיתל לפני הפציעה מאפשרת ניסויים הבודקים את השפעת הכלים הפרמקולוגיים על תהליך הריפוי. איור 6: תאי אפיתל של מדוזה לאחר מיקרו-הזרקה של צבעים או חומרים פרמקולוגיים. (A ) תאי אפיתל מוצגים בלוח העליון 5 דקות לאחר ההזרקה עם 20 μM Hoechst (גרעינים) ו-50 μM FM1-43 (ממברנות). (ב,ג) ריפוי פצעים לאחר הזרקה עם בקרת DMSO בקנ “מ 1:1,000 (B) או 100 מיקרומטר ציטוכלסין B (C). פצעים נעשו 15 דקות לאחר ההזרקה. התמונות צולמו 5 דקות לאחר הפציעה. היווצרות של lamellipodia מעוכב על ידי cytochalasin B. ה”סיבים” הנראים לעתים קרובות בין תאים באזור הפצע הם ככל הנראה תוצאה של מתח המותח את קרום המרתף – הם אינם מכתימים בפלואידין (לא מוצג). פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. סרט 1: סרט קיטועי זמן של ריפוי מיקרו-פצעים בתא יחיד. הזמן שחלף: 20 שניות. קצב פריימים: 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה. סרט 2: סרט קיטועי זמן של ריפוי פצע אפיתל קטן. זמן שחלף: 9 דקות 54 שניות. קצב פריימים: 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה. סרט 3: סרט קיטועי זמן של ריפוי פצע אפיתל קטן. פצע זה גדול יותר וצורתו אינה סדירה יותר מהפצע בסרט 2. זמן שחלף: 20 דקות 54 שניות. קצב פריימים: 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה. סרט 4: סרט קיטועי זמן של פצע קטן ומיקרו-פצע המרפא עם קרע בקרום המרתף. Lamellipodia התפשט סביב קרע קרום המרתף, אם כי הם יכולים להתקדם על פני שאר ECM. ברגע שהאזור של הפצע עם הנזק לקרום המרתף מוקף, התכווצות חוט ארנק מושכת תאים מעל האזור. זמן שחלף: 19 דקות 4 שניות. קצב פריימים: 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה. סרט 5: תאים גוססים בפצע אפיתל קטן. מוות תאי נגרם ככל הנראה כתוצאה מהתייבשות החיה. זמן שחלף: 4 דקות 24 שניות. קצב פריימים: 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה. סרט 6: פצע אפיתל קטן לא מצליח להשלים את הריפוי. זמן שחלף: 42 דקות 32 שניות. קצב פריימים: 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה. סרט 7: ריפוי פצע אפיתל גדול. זמן שחלף: 25 דקות 29 שניות. קצב פריימים: 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה. איור משלים 1: סכמות ממד מיכל קליטיה. הדמיה תלת מימדית של מיכלי Clytia בהתאמה אישית. (A) מבט מלפנים ומאחור. (B) מבט מהצד. החיתוך ביצירה המוצגת בירוק מכוסה ברשת ניילון. מים נכנסים למיכל ישירות מעל הרשת, סוחפים את הרשת ויוצרים זרם מעגלי. מים יוצאים מהמערכת דרך החור בחלק הסופי המוצג בכחול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. סרט משלים 1: מטריצה חוץ-תאית אצלולרית בקליטיה. Z-stack של Clytia נלקח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. המחסנית מתמקדת תחילה באקסמטריה ולאחר מכן סורקת כל 10 מיקרומטר דרך ה-ECM אל אנדודרם הצלחת ותת-המטריה. תמונות המשתמשות ב-DIC (משמאל) ובצביעה גרעינית Hoechst (מימין) מדגימות את המחסור בתאים ב-ECM. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

כאן, המתודולוגיה מוצגת עבור הדמיה פצעים in vivo ב Clytia, אורגניזם מודל חדש יחסית של חסרי חוליות40,43,58. ישנם מספר גורמים שהופכים מערכת זו לכלי מחקר ייחודי ורב עוצמה, להבדיל ממודלים אחרים המשמשים לחקר ריפוי פצעים ואפיתל מחדש. ראשית, האפיתל החד-שכבתי מחובר ל-ECM שקוף, ולכן דומה למבחני תרביות רקמה חוץ גופית (איור 1, איור 2, איור 3, איור 4). כמו במבחני מבחנה, ניתן לצלם תאים ברזולוציה גבוהה. עם זאת, שלא כמו בתרבית רקמות, קיימת סביבה תאית אותנטית ו- ECM, כך שניתן לראות ריפוי פצעים בהקשר של אירועי איתות מורכבים המתרחשים בחיה פצועה חיה. שנית, Clytia חסר תגובות דלקתיות, פיברובלסטים נודדים, כלי דם ודם. זה מאפשר את תהליך אפיתל מחדש להיחקר in vivo בהיעדר אירועים חופפים המתרחשים בבעלי חיים בוגרים מורכבים יותר במהלך ריפוי פצעים59. שלישית, ה-ECM הוא אצלולרי (סרט משלים 1) וגדול, ומאפשר גישה נוחה באמצעות מחט מיקרו-הזרקה (איור 5 ואיור 6). באמצעות גישה זו, חוקרים יכולים לבחון את ההשפעה של ריאגנטים פרמקולוגיים המפריעים למבנה ECM או איתות על ריפוי פצעים in vivo. ריאגנטים יכולים גם להיות הציג לתוך תאי אפיתל, ואת ההשפעות שלהם על ריפוי פצע in vivo ניתן להעריך. רביעית, קיימים פרוטוקולים ליצירת מוטנטים ובעלי חיים טרנסגניים במערכת קליטיה42,43,44,45. לכן ניתן לראות ריפוי פצעים In vivo בבעלי חיים עם ביטוי מוגבר/מופחת של גנים מעניינים.

ישנם מספר שלבים קריטיים בטכניקה זו. ראשית, כפי שמוצג באיור 3, יש צורך להשתמש במיקרוסקופ שמוגדר כראוי למיקרוסקופ DIC מאחר שתאי האפיתל השטוחים והשקופים כמעט בלתי נראים במיקרוסקופ אור סטנדרטי. חשוב גם לפתח את המיומנות לפצוע בעלי חיים בעדינות, כך שהאפיתל ייפגע מבלי לעקור את ה- ECM. מגע עדין דומה נחוץ להזרקה זעירה של חומרים לתוך ה-ECM, מכיוון שנזק נרחב לבעל החיים במהלך ההזרקה עלול לפגוע בניתוח מאוחר יותר של ריפוי פצעים. אמנם יש עקומת למידה לטכניקות אלה, אפילו תלמידים מתחילים שולטים בהן במהירות במעבדת מלאמי. ואכן, פרוטוקולים אלה שימשו להדגמת נדידת תאים בקורסי מעבדה לתואר ראשון באוניברסיטת שיקגו.

להדמיה אופטימלית, חשוב שהחיה לא תזוז ואזור הפצע הנבחר לא ייסחף משדה הראייה. אם בעלי חיים פועמים, הטיפול בטריקאין כמתואר יעיל מאוד. עבור היסחפות, לעתים קרובות יש צורך למקם מחדש את הדגימה באופן ידני. ניתן לבטל תנועות אלה מהסרט הסופי באמצעות פונקציית הרישום ב- FIJI/ImageJ.

מגבלה במערכת זו היא שלא ניתן ליצור פצעים זהים, שכן פצעים משתנים הן בצורתם והן בגודלם בשיטות המתוארות כאן. לכן, זה יכול להיות קשה לכמת את הקצב המדויק של סגירת פצע או נדידת תאים. סמני מיקום כגון גרגרי פחמן נדבקים ל-ECM החשוף בחיה פצועה וניתן להשתמש בהם כדי למדוד את קצב נדידת התאים הקולקטיבית בפצעים גדולים (לא מוצג). עבור ניתוח סגירת פצעים קטנים, אפילו עם גודל וצורה משתנים של פצע, קיים טווח מוגבל של שיעורי סגירה בקרב פצעים בגודל זה (איור 4). לכן ניתן לזהות כמותית את ההשפעות של ריאגנטים פרמקולוגיים מניעים או דכאניים.

בעוד שעבודה זו מתארת אפיון ריפוי פצעים באמצעות מיקרוסקופ DIC בלבד, ניתן להשתמש באותן גישות כדי לדמיין ריפוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי. כדי לסייע בכך, קיימים פרוטוקולים ליצירת בעלי חיים טרנסגניים שבהם חלבונים תאיים וחוץ-תאיים שונים מסומנים באופן פלואורסצנטי. הדמיה במקביל עם DIC ופלואורסצנציה, בשילוב עם הפרעה של ריפוי פצעים באמצעות חומרים פרמקולוגיים או קווים מוטנטיים, תהיה גישה רבת עוצמה להבנת מנגנונים העומדים בבסיס תהליך ריפוי הפצע באפיתל.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

E.E.L.L. נתמך על ידי מענק מהקרן הלאומית למדע PRFB 2011010. ברצוננו להודות לצויושי מומוז ואוולין הוליסטון על עזרתם להקים את מושבות קליטיה שלנו, לז’אן-בטיסט ריינייה על איסוף תמונות ריפוי המיקרו-פצעים, להארי קירייזס על בניית מיכלי הפסאודו-קרייזל, ולאליזבת באלדו על שמירת בית הגידול של קליטיה. איור 1B נוצר באמצעות BioRender.com.

Materials

20500 ACE EKE Microscope Fiber Optic Light Source Kramer Scientific Corporation
AxioCam 506 mono ZEISS 426557-0000-000-MA285
Capillary tubes World Precision Instruments TW1004
Cytochalasin B Abcam ab143482
Depression slides Amscope BS-C12
DMR with DIC options and fluorescence halogen lamp Leica
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma Aldrich E10521-10G
Fast Green FCF Thermo Scientific A16520-06
FM1-43 Biotium 70022 Excitation/Emission: 480/598 nm 
Hoechst 33342 Thermo Scientific 62249 Excitation/Emission: 361/497 nm 
imageJ NIH
Microloader tips (0.5-10 μL /2-20 μL) Eppendorf 930001007
Micromanipulator World Precision Instruments 3301R / M3301L
Microscope Cover Glass (22X40-1.5) Fisherbrand 12-544-BP
Petri Dish (60 mm x 15 mm) Fisherbrand FB085713A
PicoNozzle v2 World Precision Instruments 5430-ALL
Pipette puller Sutter Instrument Co P-97
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments PV820
Polycarbonate vacuum, desiccator Bel-art F42025-0000
Prism 9 GraphPad
STEMI Sv11 Dissection scope ZEISS STEMI SV11
SYLGARD 184 Dow Silicones 1024001
Transfer pipettes Fisherbrand 13-711-7M
Z-Hab mini system Pentair
ZEN Microscopy software Zeiss
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tyler, S. Epithelium-the primary building block for metazoan complexity. Integrative and Comparative Biology. 43 (1), 55-63 (2003).
  2. Kurn, H., Daly, D. T. Histology, Epithelial Cell. StatPearls. , (2022).
  3. Schempp, C., Emde, M., Wölfle, U. Dermatology in the Darwin anniversary. Part 1: Evolution of the integument. Journal of the German Society of Dermatology. 7 (9), 750-757 (2009).
  4. Lopez-Ojeda, W., Pandey, A., Alhajj, M., Oakley, A. M. Anatomy, Skin (Integument). StatPearls. , (2022).
  5. Bukowiecki, A., Hos, D., Cursiefen, C., Eming, S. A. Wound-healing studies in cornea and skin: parallels, differences and opportunities. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1257 (2017).
  6. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  7. Hynes, R. O. The evolution of metazoan extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 196 (6), 671-679 (2012).
  8. Fidler, A. L., et al. Collagen IV and basement membrane at the evolutionary dawn of metazoan tissues. eLife. 6, 24176 (2017).
  9. Bullen, T. F., et al. Characterization of epithelial cell shedding from human small intestine. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 86 (10), 1052-1063 (2006).
  10. Watson, A. J. M., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
  11. Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 237-263 (2011).
  12. Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Single cell wound repair. BioArchitecture. 1 (3), 114-121 (2011).
  13. Fenteany, G., Janmey, P. A., Stossel, T. P. Signaling pathways and cell mechanics involved in wound closure by epithelial cell sheets. Current Biology. 10 (14), 831-838 (2000).
  14. Pastar, I., et al. Epithelialization in wound healing: a comprehensive review. Advances in Wound Care. 3 (7), 445-464 (2014).
  15. Rousselle, P., Braye, F., Dayan, G. Re-epithelialization of adult skin wounds: Cellular mechanisms and therapeutic strategies. Advanced Drug Delivery Reviews. 146, 344-365 (2019).
  16. Bement, W. M., Forscher, P., Mooseker, M. S. A novel cytoskeletal structure involved in purse string wound closure and cell polarity maintenance. The Journal of Cell Biology. 121 (3), 565-578 (1993).
  17. Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. Collective Cell migration: a mechanistic perspective. Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).
  18. Li, L., He, Y., Zhao, M., Jiang, J. Collective cell migration: Implications for wound healing and cancer invasion. Burns & Trauma. 1 (1), 21-26 (2015).
  19. Bornes, L., Windoffer, R., Leube, R. E., Morgner, J., van Rheenen, J. Scratch-induced partial skin wounds re-epithelialize by sheets of independently migrating keratinocytes. Life Science Alliance. 4 (1), 202000765 (2021).
  20. Theveneau, E., Mayor, R. Collective cell migration of epithelial and mesenchymal cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (19), 3481-3492 (2013).
  21. Haensel, D., Dai, X. Epithelial-to-mesenchymal transition in cutaneous wound healing: where we are and where we are heading. Developmental Dynamics. 247 (3), 473-480 (2018).
  22. Cordeiro, J. V., Jacinto, A. The role of transcription-independent damage signals in the initiation of epithelial wound healing. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (4), 249-262 (2013).
  23. Abreu-Blanco, M. T., Watts, J. J., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Cytoskeleton responses in wound repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (15), 2469-2483 (2012).
  24. Klarlund, J. K., Block, E. R. Free edges in epithelia as cues for motility. Cell Adhesion & Migration. 5 (2), 106-110 (2011).
  25. Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends in Cell Biology. 25 (7), 398-407 (2015).
  26. Niethammer, P. The early wound signals. Current Opinion in Genetics & Development. 40, 17-22 (2016).
  27. Jacinto, A., Martinez-Arias, A., Martin, P. Mechanisms of epithelial fusion and repair. Nature Cell Biology. 3 (5), 117-123 (2001).
  28. Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
  29. Gupta, S., Yap, A. S. How adherens junctions move cells during collective migration. Faculty Reviews. 10, 56 (2021).
  30. Blair, M. J., Jones, J. D., Woessner, A. E., Quinn, K. P. Skin structure-function relationships and the wound healing response to intrinsic aging. Advances in Wound Care. 9 (3), 127-143 (2020).
  31. Falanga, V., et al. Chronic wounds. Nature Reviews. Disease Primers. 8 (1), 50 (2022).
  32. Liang, C. -. C., Park, A. Y., Guan, J. -. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  33. Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
  34. Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (41), 15988-15993 (2007).
  35. Masson-Meyers, D. S., et al. Experimental models and methods for cutaneous wound healing assessment. International Journal of Experimental Pathology. 101 (1-2), 21-37 (2020).
  36. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  37. Tsai, C. -. R., Wang, Y., Galko, M. J. Crawling wounded: molecular genetic insights into wound healing from Drosophila larvae. The International Journal of Developmental Biology. 62 (6-7-8), 479-489 (2018).
  38. Richardson, R., et al. Adult zebrafish as a model system for cutaneous wound-healing research. The Journal of Investigative Dermatology. 133 (6), 1655-1665 (2013).
  39. Erickson, J. R., Echeverri, K. Learning from regeneration research organisms: The circuitous road to scar free wound healing. Developmental Biology. 433 (2), 144-154 (2018).
  40. Kamran, Z., et al. In vivo imaging of epithelial wound healing in the cnidarian Clytia hemisphaerica demonstrates early evolution of purse string and cell crawling closure mechanisms. BMC Developmental Biology. 17 (1), 17 (2017).
  41. Chari, T., et al. Whole-animal multiplexed single-cell RNA-seq reveals transcriptional shifts across Clytia medusa cell types. Science Advances. 7 (48), (2021).
  42. Weissbourd, B., et al. A genetically tractable jellyfish model for systems and evolutionary neuroscience. Cell. 184 (24), 5854-5868 (2021).
  43. Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8 (1), 11734 (2018).
  44. Houliston, E., Leclère, L., Munro, C., Copley, R. R., Momose, T. Past, present and future of Clytia hemisphaerica as a laboratory jellyfish. Current Topics in Developmental Biology. 147, 121-151 (2022).
  45. Schmid, V., et al. The extracellular matrix (mesoglea) of hydrozoan jellyfish and its ability to support cell adhesion and spreading. Hydrobiologia. 216 (1), 3-10 (1991).
  46. Day, R. M., Lenhoff, H. M. Hydra mesoglea: a model for investigating epithelial cell-basement membrane interactions. Science. 211 (4479), 291-294 (1981).
  47. Zhang, X., et al. The collagens of hydra provide insight into the evolution of metazoan extracellular matrices. The Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6792-6802 (2007).
  48. Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin ‘purse string’ filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111 (22), 3323-3332 (1998).
  49. Arenas Gómez, C. M., Sabin, K. Z., Echeverri, K. Wound healing across the animal kingdom: Crosstalk between the immune system and the extracellular matrix. Developmental Dynamics. 249 (7), 834-846 (2020).
  50. Lechable, M., et al. An improved whole life cycle culture protocol for the hydrozoan genetic model Clytia hemisphaerica. Biology Open. 9 (11), (2020).
  51. Casares, L., et al. Hydraulic fracture during epithelial stretching. Nature Materials. 14 (3), 343-351 (2015).
  52. Wayne, R. Chapter 4 – Bright-Field Microscopy. Light and Video Microscopy (Third Edition). , 95-116 (2019).
  53. Murphy, D. B., Davidson, M. W. . Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging: Second Edition. , (2012).
  54. . Micropipette Techniques for Electrophysiology Available from: https://www.sutter.com/micropipette/cookbook.html (2022)
  55. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller). Journal of Visualized Experiments. (20), e939 (2008).
  56. Klarlund, J. K. Dual modes of motility at the leading edge of migrating epithelial cell sheets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 15799-15804 (2012).
  57. Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: a jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
  58. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: a cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).

Tags

Epithelial Wound HealingClytia HemisphaericaIn VivoLive ImagingMicro-woundsScratch WoundsMicroinjectionCell MigrationCell SpreadingExtracellular MatrixCell Cytoplasm

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lee, E. E. L., Watto, E., Malamy, J. Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica. J. Vis. Exp. (192), e65081, doi:10.3791/65081 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image