Quantificazione delle modificazioni post-traduzionali degli istoni globali utilizzando la citometria a flusso intranucleare nella microglia cerebrale di topo isolata

Tutti i protocolli per la cura degli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali dell’Università della British Columbia in conformità con le linee guida del Consiglio canadese per la cura degli animali. 1. Digestione cerebrale per l’isolamento della microglia Figura 1: Diagramma di flusso semplice del protocollo. I topi vengono prima perfusi per via transcardiaca con HBSS e il cervello viene sezionato. Il cervello viene quindi dissociato attraverso la digestione chimica e l’interruzione meccanica per ottenere un omogenato a singola cellula. La frazione arricchita immunitaria viene raccolta tramite gradiente di densità discontinuo, dopodiché le cellule vengono colorate per P2RY12. Le cellule colorate sono 1) ordinate tramite la selezione cellulare attivata fluorescente (FACS) per portare all’analisi dell’RNA o all’analisi delle proteine a valle e/o 2) fissate, permeabilizzate e colorate per le proteine intranucleari. Il livello proteico è quantificato in base all’intensità mediana della fluorescenza nel canale di interesse determinata dalla citometria a flusso. Le caselle colorate in blu fanno parte della fase 1 del protocollo) Digestione cerebrale per l’isolamento della microglia. I riquadri colorati in rosso fanno parte della fase 2 del protocollo) Colorazione a flusso intranucleare per l’analisi dell’espressione proteica. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Preparazione dei reagentiNOTA: Se si pianifica un’estrazione per raccogliere sia l’RNA che le cellule per l’analisi HPTM, fare riferimento alla sezione 1.7.1 per le modifiche che includono gli inibitori della trascrizione e della traduzione. Tuttavia, questo non è necessario se si valuta solo il segnale proteico, poiché le cellule sono in gran parte quiescenti quando vengono mantenute sul ghiaccio.Tampone FACS (Fluorescence activated Cell Sorting) (20 mL per campione): sciogliere l’albumina sierica bovina (BSA) in 1x soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) per creare una soluzione BSA al 2%. Sciogliere l’EDTA ad una concentrazione finale di 1 mM nella soluzione di BSA al 2%. Filtrare: sterilizzare con un filtro da 0,2 μm e conservare a 4 °C per un massimo di 1 settimana prima dell’uso. Tampone di digestione (1 mL per campione): Ricostituire un flaconcino di papaina in HBSS a una concentrazione finale di 20 U/mL in 1 mM di L-cisteina con 0,5 mM di EDTA. Attivare a 37 °C per un minimo di 10 minuti o fino al momento di digerire il tessuto. Poco prima dell’uso, aggiungere DNasi I alla soluzione di papaina attivata fino a una concentrazione finale di 200 U/mL. Prepararlo il giorno dell’esperimento e non conservarlo. Soluzione isotonica a gradiente di densità (5,5 mL per campione): Aggiungere 10x HBSS al mezzo a gradiente di densità fredda fino a una concentrazione finale di 1x HBSS, ottenendo una densità finale di 1,117 g/mL. Frullare per almeno 30 secondi prima dell’uso. Mettere sul ghiaccio fino all’uso. Soluzione con gradiente di densità al 37% (4 mL per campione): aggiungere il gradiente di densità isotonica a 1x HBSS per ottenere una concentrazione finale del 37% con una densità finale di 1,043 g/mL. Aggiungere 20 μL di rosso fenolo per ogni mL di gradiente di densità del 37% per creare una soluzione rosa per la visualizzazione durante la stratificazione. Vortice per almeno 30 s prima dell’uso. Mettere sul ghiaccio fino all’uso. Soluzione con gradiente di densità al 70% (2 mL per campione): Aggiungere il gradiente di densità isotonico a 1x HBSS per ottenere una concentrazione finale del 70% con una densità finale di 1,082 g/mL. Aggiungere 5 μL di blu tripano per ogni mL di terreno con densità al 70% per ottenere una soluzione blu per la visualizzazione durante la stratificazione. Vortice per almeno 30 s prima dell’uso. Mettere sul ghiaccio fino all’uso. Perfusione e dissezione cerebraleNOTA: Il protocollo di perfusione è simile a quello di Posel et al. che presenta una rappresentazione video della toracotomia del topo, della perfusione transcardica e della rimozione del cervello21. In questo caso, utilizziamo topi adulti C57BL/6J maschi e femmine (10-15 settimane, 20-30 g), ma questo protocollo può essere utilizzato per eseguire una toracotomia per qualsiasi topo. Tutte le procedure sugli animali devono essere approvate dal comitato etico istituzionale prima di condurre gli esperimenti.Anestesia del topo: anestetizzare i topi con il 4% di isoflurano in ossigeno al 100% fino a oltre il piano dell’anestesia chirurgica, che può essere confermato con un pizzicamento del dito del piede o una mancanza di riflesso dopo aver pizzicato saldamente il piede del topo. Posiziona il topo sulla schiena e fissa saldamente le sue quattro zampe nella tavola di dissezione chirurgica posta inclinata in un vassoio di plastica, assicurandoti che il naso sia fissato al cono nasale in isofluorano. Dopo il trasferimento, assicurarsi che l’animale abbia ancora superato il piano chirurgico dell’anestesia prima di procedere. Toracotamia del topo: afferrare e sollevare la pelle addominale usando una pinza e praticare un’incisione poco profonda attraverso la pelle e la parete addominale per esporre lo xifoide senza danneggiare l’aorta discendente o gli organi sottostanti. Afferrare lo xifoide con una pinza e praticare incisioni laterali sotto la gabbia toracica per esporre il diaframma e il fegato. Eseguire tagli accurati e poco profondi attraverso il diaframma lungo la lunghezza della gabbia toracica usando forbici sottili e attraverso la gabbia toracica usando forbici per tessuti e fissare lo sterno alla stazione chirurgica vicino alla testa del topo per esporre il cuore e i polmoni per la perfusione transcardiaca. Perfusione transcardica: preparare una pompa peristaltica e collegare un ago da 26,5 G a un’estremità del tubo. Adescare il tubo per la procedura inserendo un’estremità del tubo in una fiala di 1x HBSS freddo e accendendo la pompa per riempire completamente il tubo con 1x HBSS. Mentre si tiene il cuore con una pinza smussata, inserire la punta di un ago da 26,5 G con il tubo di perfusione attaccato nel ventricolo sinistro del cuore e praticare una piccola incisione nell’atrio destro. Accendere la pompa di perfusione per perfondere con cura il topo a una velocità di ~2-4 mL/min con almeno 15-20 mL di HBSS 1x freddo.NOTA: Una perfusione completa è spesso indicata quando il fegato inizia a pulire il sangue e diventa dello stesso colore del cuore. Rimozione del cervello: decapitare il topo usando forbici da dissezione dei tessuti e praticare un’incisione sulla linea mediana del cuoio capelluto dal collo al naso. Staccare i lembi di pelle ai lati per esporre il cranio e rimuovere il tessuto e le ossa in eccesso all’estremità caudale del cranio con forbici da dissezione. Fai scorrere con cautela una lama delle forbici sotto il cranio nel forame magno con il lato affilato rivolto verso l’osso e taglia con cura la linea mediana verso il naso. Fai dei tagli laterali sia alla base del cranio che vicino al naso usando le forbici da dissezione. Usando una pinza sottile, fai vivere il cranio dalla linea mediana verso l’esterno per rompere i pezzi del cranio ed esporre il cervello. Sollevare delicatamente il cervello con una spatola e posizionarlo su carta assorbente. Dissezione cerebrale: posizionare il cervello su un pezzo di carta assorbente per dissezione bagnata con 1x HBSS sopra una capsula di Petri chiusa riempita di ghiaccio. Rimuovere il cervelletto e dividere in due gli emisferi cerebrali usando una lametta pulita. Rimuovi il tronco encefalico, lo striato e la materia bianca da ciascun emisfero, mantenendo intatto l’ippocampo e la corteccia sovrastante. Trasferire gli emisferi contenenti corteccia isolata e tessuto ippocampale in una provetta da 15 mL con 5 mL di HBSS 1x freddo e mantenere il ghiaccio.NOTA: È importante eseguire le dissezioni il più rapidamente possibile in modo che il tessuto rimanga freddo con non più di 2 minuti tra la decapitazione e il posizionamento finale del tessuto sezionato in 1x HBSS su ghiaccio. Se si isolano le microglia da più animali, i cervelli possono essere conservati su ghiaccio in 1x HBSS per ~ 1 ora prima di procedere con l’elaborazione dell’intera coorte di animali per la digestione, ecc. Digestione e omogeneizzazione del cervelloDissociazione meccanica e chimica: Mettere il tessuto cerebrale di ciascun topo e 1 ml di tampone di digestione in singole piastre di Petri su ghiaccio. Usando una lama di bisturi pulita, tagliare accuratamente il cervello in piccoli pezzi (<1 mm). Tagliare la punta da una pipetta di trasferimento di plastica e trasferire con cura ciascuno dei cervelli tritati in pozzetti separati all’interno di una piastra da 24 pozzetti su ghiaccio. Coprire la piastra con pellicola flessibile trasparente e incubare su ghiaccio per 30 min.NOTA: Se tritato correttamente, il tessuto cerebrale assomiglia all’aglio ben tritato. Omogeneizzazione a spruzzo: Trasferire la soluzione cerebrale digerita da ciascun pozzetto in singoli omogeneizzatori in vetro da 7 mL su ghiaccio, ciascuno riempito con 5 ml di tampone FACS freddo. Far sbucare delicatamente ogni cervello con il pestello sciolto (A), circa 30-40 volte, fino ad ottenere una sospensione unicellulare. Dopo aver schiacciato con il pestello A, inzuppare delicatamente con il pestello stretto (B) 3-4 volte per garantire una sospensione a cellula singola.NOTA: Non spingere il pestello per più di 3/4 verso il basso per evitare di schiacciare il tessuto sul fondo dell’omogeneizzatore. La soluzione finale dovrebbe essere opaca e lattiginosa.NOTA: Se si digeriscono più cervelli in un singolo esperimento, cronometrare il trasferimento del cervello nel tampone FACS in modo che ogni campione rimanga nel tampone di digestione solo per 30 minuti. Una digestione eccessiva può provocare la scissione delle proteine di superficie, riducendo il legame e il segnale degli anticorpi a valle. Ottenimento di un frammento arricchito di immunitàStabilire il gradiente di densità: trasferire l’omogenato da ciascun cervello in provette di polipropilene separate da 15 mL e aggiungere 2,125 mL di gradiente di densità isotonica e completare a 8,5 mL con tampone FACS per ciascuno per ottenere una concentrazione finale del gradiente di densità del 25%. Capovolgere delicatamente le provette da 15 ml 20 volte per mescolare accuratamente. Utilizzando una pipetta di trasferimento a graduazione stretta, sottoporre delicatamente 4 mL di gradiente di densità del 37% a ciascuna provetta, facendo molta attenzione a stabilire strati puliti. Cambiare le pipette di trasferimento e sottoporre delicatamente 2 mL di gradiente di densità al 70% (Figura 2A). Trasferire in una centrifuga raffreddata a 4 °C e centrifugare a 500 x g per 20 minuti con la rampa di frenatura impostata a zero. Raccolta di frammenti immunoarricchiti: utilizzando pipette di trasferimento pulite, aspirare delicatamente la mielina dalla parte superiore del volume nella provetta da 15 ml utilizzando una pipetta di trasferimento pulita ed eliminare. Raccogliere con cautela il frammento superiore del gradiente di densità in una provetta di polipropilene pulita da 15 mL utilizzando una pipetta di trasferimento. Raccogliere con cura il frammento arricchito di immunità (1,5 mL sopra e 1,5 mL sotto il punto in cui si incontrano gli strati di gradiente di densità del 70% e del 37%) in una nuova provetta di polipropilene da 15 mL (Figura 2B). Aggiungere 10 mL di tampone FACS al campione immunoarricchito per diluire il mezzo a gradiente di densità e capovolgere delicatamente la provetta 20 volte per mescolare accuratamente.NOTA: Poiché le cellule tendono ad attaccarsi ai lati della provetta, assicurarsi di raccogliere tutte le cellule del campione durante le fasi di raccolta facendo girare lentamente la pipetta lungo i lati della provetta durante la raccolta del liquido. Pellettare le cellule nel campione immunoarricchito centrifugando le provette da 15 mL in una centrifuga a 4 °C a 500 x g per 10 minuti con il freno della rampa in discesa impostato a zero. Subito dopo la fine della centrifuga, rimuovere con cura il surnatante, lasciando circa 300 μL di liquido nella provetta da 15 mL, facendo attenzione a non disturbare il pellet (che potrebbe non essere visibile). Raccogliere il surnatante in un’altra provetta da 15 mL per assicurarsi che le cellule siano state pellettate nello spin (scartare questa frazione una volta effettuata la verifica con la conta cellulare del pellet risospeso). Dopo aver risospeso il pellet cellulare nel volume di 300 μL utilizzando una pipetta P1000, contare le cellule con un ematotometro per stimare la resa cellulare totale. Figura 2: Ottenimento del frammento arricchito di immunità mediante gradiente di densità discontinuo. (A) L’omogenato cerebrale è realizzato al 25% di densità media, sottostante 4 mL di densità al 37% di colore rosa medio tramite rosso fenolo e 2 ml di densità 70% di colore blu medio tramite blu tripano. (B) Dopo la centrifugazione, le frazioni si sono separate. La microglia si trova all’interfaccia dei frammenti di terreno con densità del 37% e del 70%. Il frammento di mielina si trova nella parte superiore della provetta da 15 mL e verrà scartato. Il frammento superiore viene raccolto come backup nel caso in cui la rotazione non riesca e non viene recuperata alcuna cella. In tal caso, il gradiente può essere ripetuto utilizzando questa frazione. La frazione immunitaria arricchita viene raccolta a valle. La frazione inferiore contenente i globuli rossi rimane nella provetta e viene scartata. (C) Figura esemplificativa raffigurante strati completi. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Colorazione degli anticorpi extracellulariBlocco: Trasferire le cellule su una piastra a 96 pozzetti a fondo tondo su ghiaccio e centrifugare a 500 x g con freno per pellettizzare le cellule. Rimuovere rapidamente il surnatante nel lavandino muovendo la piastra per smaltire il surnatante, lasciando intatto il pellet cellulare sul fondo del pozzetto. Risospendere le cellule in 50 μL di tampone FACS con reagente bloccante il recettore FC CD16/32 anti-topo utilizzando una pipetta P200 (concentrazione finale 10 μg/mL, fattore di diluizione 1:50) per prevenire il legame non specifico degli anticorpi ai monociti o ad altre cellule portatrici di FcR. Incubare per 10 minuti con ghiaccio. Colorazione degli anticorpi: Preparare il volume appropriato di una miscela master 2x contenente P2RY12- Alloficocianina (APC; fattore di diluizione 1:50, concentrazione 4 μg/mL per una concentrazione finale del pozzetto di 1:100, concentrazione 2 μg/mL) e colorante viola 525 vivo morto (fattore di diluizione 1:50 per una concentrazione finale del pozzetto di 1:100). Aggiungere 50 μL della miscela master colorante alla sospensione cellulare (ottenuta dopo il blocco di cui al punto 1.5.1) e incubare la piastra per 30 minuti al buio su ghiaccio.NOTA: Per questo protocollo, presentiamo la colorazione delle cellule con P2RY12. In primo luogo, P2RY12 è un marcatore omeostatico per la microglia che può essere sottoregolato in determinati contesti patologici. Ad esempio, i topi modello di Alzheimer 5XFAD hanno abbassato i livelli di P2RY12, il che potrebbe renderli difficili da identificare22. I coloranti alternativi che possono essere utilizzati per l’isolamento includono Tmem119, Cd11b e CD4523. In secondo luogo, il fluorocromo coniugato APC può essere regolato per adattarsi al pannello di anticorpi desiderato. Tuttavia, la scelta di un fluorocromo brillante, come APC o PE, contribuirà a garantire che le popolazioni positive e negative siano facilmente distinguibili24. Dopo la colorazione, aggiungere 200 μL di tampone FACS direttamente a ciascun pozzetto per lavare le cellule. Centrifugare a 500 x g a 4 °C per rimuovere il surnatante sfiorando. Risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS con una pipetta P200, centrifugare a 500 x g a 4 °C e sbattere la piastra per rimuovere il tampone dai pozzetti. Preparazione dei controlli di flusso: prima della colorazione, separare i volumi necessari di cellule da ciascun campione dopo il blocco al punto 1.5.1 per i controlli di flusso richiesti.NOTA: I controlli di flusso sono necessari per ogni esperimento per stabilire le porte. I controlli di flusso possono essere prelevati da un animale aggiuntivo o da una frazione di ciascuno dei pozzi sperimentali. Quando si suddividono le celle, assicurarsi di assegnare un numero sufficiente di celle per controllo, poiché sono necessarie 10.000-30.000 celle per controllo per stabilire i gate con un’elevata confidenza.Ci sono tre controlli di flusso rilevanti: nessuna macchia, morti vivi e controllo dell’isotipo P2RY12. Per il controllo antimacchia, non aggiungere alcun anticorpo. Nel controllo dell’isotipo P2RY12, trattare le cellule con un colorante di vitalità (1:100) e un anticorpo di controllo dell’isotipo coniugato ad APC (1:100). Per preparare il controllo dei morti vivi, aliquotare le cellule in un pozzetto separato e spostare metà del volume della cellula in una provetta da 500 μL. Mettere la provetta da 500 μL nel congelatore a -80 °C per 5 minuti, quindi metterla in un incubatore a 37 °C per 5 minuti per uccidere le cellule. Riportare l’aliquota delle cellule morte nel pozzetto di controllo dei morti vivi e colorare con un colorante di vitalità legante l’ammina su viola 525 (fattore di diluizione 1:100) per contrassegnare le cellule morte.NOTA: Il protocollo è scritto per la colorazione delle piastre con un metodo flick per la rimozione del surnatante. Tuttavia, ciò richiede che il surnatante venga rimosso immediatamente dopo il completamento della rotazione e il colpo deve essere eseguito con forza sufficiente per rimuovere rapidamente il surnatante senza disturbare il pellet. In alternativa, per la colorazione è possibile utilizzare provette prive di RNAsi/DNasi da 1,5 mL, con le seguenti modifiche: Trasferire le cellule in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e pellet a 800 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante con pipette. Suggerimento: Per una maggiore rapidità, una pipetta di trasferimento da 5 mL con puntale P200 è in grado di aspirare il surnatante in modo rapido e preciso. Durante l’aspirazione, controllare la presenza di pellet. Se il pellet non è visibile, lasciare 50 μL di surnatante e regolare i calcoli di conseguenza. Quando si eliminano gli anticorpi, aggiungere ulteriore FACS per aumentare la diluizione degli anticorpi (1000 μL invece di 200 μL) per tenere conto della rimozione incompleta del surnatante. A seconda del citometro, utilizzare le provette da 1,5 mL per lo smistamento, riducendo la quantità di forniture necessarie. Smistamento FACS per microgliaPreparazione: Risospendere ogni pozzetto in 200 μL di tampone FACS con una pipetta P200 e trasferire in provette di selezione a flusso etichettate e aggiungere il tampone FACS per un totale di 500 μL per una concentrazione di circa 5 x 105 eventi per mL. Conservare su ghiaccio al buio fino all’analisi. Preparare le provette post-sort aggiungendo 100 μL di tampone FACS come cuscino per le cellule in provette prive di RNAsi da 1,5 mL. Impostazioni del citometro: Ordina le cellule su un selezionatore di cellule con citometria a flusso impostato con l’ugello da 100 μm. Ordina le celle usando 18-20 psi. Gating: sul citometro, gate per la dimensione della cellula utilizzando l’area side-scatter (SSC) rispetto all’altezza della diffusione diretta (FSC) utilizzando il controllo senza macchia per aiutare a distinguere i detriti, mettere SSC-A su un asse logaritmico per visualizzare una popolazione cellulare e gate da vicino per selezionare le cellule (gate S1; Figura 3). Per rimuovere eventuali doppiette, tracciare FSC-H vs FSC-W e gate strettamente attorno alla popolazione cellulare rimuovendo eventuali detriti e doppiette (gate S2). Utilizzando il controllo dell’isotipo P2RY12, esaminare le cellule nel canale APC e impostare il gate per l’autofluorescenza per determinare le cellule P2RY12+. Utilizzando i controlli senza macchia e morti vivi, cancello per le cellule che non sono fluorescenti su viola 525 nm come cellule vive. Ordinamento: Tracciare il colore viola 525 nm rispetto all’APC e determinare la popolazione che è P2RY12+ e vive in base agli FMO (MG). Ordinare tali cellule nella provetta di smistamento post-selezione etichettata (Figura 3). La percentuale di ordinamento finale è di circa il 50% degli eventi totali, con la maggior parte della perdita totale dell’evento dovuta alla rimozione dei detriti nel gate S1 (~70% degli eventi sono celle; Tabella 1). Isolamento e analisi dell’RNAInibitori della trascrizione e della traduzione: se si pianifica l’estrazione dell’RNA, per eliminare il rischio di isolamento delle firme trascrittomiche associate, includere inibitori della traduzione e della trascrizione nelle fasi del tampone. Preparare il cocktail di inibitori come descritto da Marsh et al. che includa actinomicina D, anisomicina e triptolide25.Preparazione dell’inibitore: Ricostituire le scorte di inibitore e conservare come segue: Ricostituire l’actinomicina D in dimetilsolfossido (DMSO) a 5 mg/mL e conservare a -20 °C. Ricostituire il triptolide in DMSO a 10 mM e conservare a -20 °C, al riparo dalla luce. Ricostituire l’anisomicina in DMSO a 10 mg/mL e conservare a 4 °C, al riparo dalla luce. Conservare tutte le scorte di inibitori per non più di 1 mese dopo la ricostituzione. Modifiche del tampone: Aggiungere gli inibitori in quattro diversi tamponi nel protocollo come segue: Quando si esegue la perfusione transcardica, preparare HBSS con actinomicina D (5 μg/mL, 1:1000 da stock) e triptolide (10 μM, 1:1000 da stock). Dopo la perfusione, trasporta i cervelli in laboratorio in HBSS contenente actinomicina D (5 μg/mL, 1:1000 da magazzino), triptolide (10 μM, 1:1000 da magazzino) e anisomicina (27,1 μg/mL, 1:368,5 da magazzino). Preparare il tampone FACS con actinomicina D (5 μg/mL, 1:1000 da magazzino), triptolide (10 μM, 1:1000 da magazzino) e anisomicina (27,1 μg/mL, 1:368,5 da magazzino). Preparare il tampone di digestione con actinomicina D (5 μg/mL, 1:1000 da magazzino), triptolide (10 μM, 1:1000 da magazzino) e anisomicina (27,1 μg/mL, 1:368,5 da magazzino). Preparare il tampone di lavaggio post-selezione, con HBSS contenente actinomicina D (5 μg/mL, 1:1000 da magazzino), triptolide (10 μM, 1:1000 da magazzino) e anisomicina (27,1 μg/mL, 1:368,5 da magazzino).NOTA: Quando si aggiungono gli inibitori, assicurarsi di aggiungerli immediatamente prima dell’uso e proteggere eventuali tamponi preparati dalla luce durante l’uso. Evitare il gelo-disgelo delle soluzioni madri. Lavaggi post-sorteggio: poiché le cellule sono state smistate in provette prive di RNasi da 1,5 mL in tampone FACS, che interferiscono con l’isolamento dell’RNA, è necessario lavare le cellule. Centrifugare le cellule a 1000 x g a 4 °C per 5 minuti e rimuovere il surnatante, lasciando circa 50 μL di liquido. Aggiungere 200 μL di 1x HBSS contenente actinomicina D (5 μg/mL, 1:1000 dalla cella), triptolide (10 μM, 1:1000 dalla riserva) e anisomicina (27,1 μg/mL, 1:368,5 dalla riserva) e mescolare accuratamente. Ripetere la centrifuga e rimuovere il surnatante lasciando 50 μL di liquido (lavaggio 1). Aggiungere 200 μL di tampone di lavaggio post-selezione, mescolare accuratamente e ripetere la centrifuga e rimuovere il surnatante lasciando 25 μL di liquido (lavaggio 2). Estrazione dell’RNA: per l’isolamento dell’RNA dalle cellule microgliali, utilizzare un kit di isolamento dell’RNA a basso input per rese di RNA elevate e coerenti e punteggi RIN superiori a 9 (vedere di seguito e la tabella dei materiali per le raccomandazioni sui prodotti). Al pellet cellulare, aggiungere 350 μL del tampone di lisi del kit consigliato + β-mercaptoetanolo (1:100) e mescolare bene.NOTA: Se necessario, il protocollo può essere sospeso a questo punto. I campioni possono essere conservati nel tampone di lisi a -80 °C fino all’estrazione dell’RNA. Se si estrae l’RNA dopo la conservazione, scongelare il lisato su ghiaccio e procedere con le istruzioni specifiche del kit per l’isolamento. Trasferire il lisato nel trituratore cellulare a colonna (vedere la tabella dei materiali per le raccomandazioni sui prodotti) e centrifugare alla massima velocità a 4 °C per 2 minuti. Eluire in un minimo di 14 μL di acqua priva di RNasi e determinare la concentrazione in base alle esigenze. L’RNA può essere utilizzato per qualsiasi applicazione a valle dopo questo punto. Figura 3: Strategia di gating per l’ordinamento del flusso. Gli eventi sono controllati per le dimensioni delle celle su SSC-A rispetto a FSC-H (S1). Quindi, le cellule vengono controllate per essere singoletti su FSC-H rispetto a FSC-W (S2). Le cellule singoletto sono ordinate come vive se negative su Comp-FL8-A::405-526-52 (colorazione viola 525 viva morta) e come P2RY12+ se positive su Comp-FL32-A::640-671_30 (P2RY12-APC) utilizzando il controllo dell’isotipo P2RY12. Le cellule sono etichettate come MG e ordinate sia se vive che P2RY12+. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. POPOLAZIONE RECINTATA Frequenza del genitore Frequenza del totale Contare Visualizzazione del materiale S1 68.10% 68.10% 162186 S2>S1 93.59% 63.70% 151707 P2Ry12+ (670+) > S2 > S1 83.05% 52.90% 125986 Live (525-) > S2 > S1 92.78% 59.10% 140752 MG (P2RY12+ Live) >S2>S1 78.96% 50.30% 119794 Tabella 1: Esempio di tabella di derivazione con percentuali di gating e numeri di eventi previsti. 2. Colorazione a flusso intranucleare per l’analisi dell’espressione proteica NOTA: A questo punto è possibile iniziare altri tipi di cellule, questo protocollo viene testato con cellule in coltura, comprese le cellule HEK293, le cellule simili alla microglia BV2 e la microglia umana derivata da IPSC. Fissazione e colorazione delle celluleNOTA: Per il seguente protocollo, utilizzare un kit di colorazione intracellulare ottimizzato per la colorazione nucleare. Vedere Tabella dei materiali per consigli sui prodotti.Aliquote di cellule colorate extracellulari della sezione 1.5.2 in una piastra a 96 pozzetti (5 x 104- 1 x 106 cellule). Centrifugare le celle per 5 minuti a 500 x g a 4 °C e sfiorare per rimuovere il tampone FACS.NOTA: Per ottenere dati con un’elevata confidenza dei livelli mediani, è necessario utilizzare un minimo di 10.000 cellule per pozzetto. Sebbene non esista un massimo raccomandato, è meglio mantenere costante il numero di cellule durante l’esperimento per garantire che non vi sia alcun effetto significativo di diversi coefficienti di variazione (CV). Fissazione e permeabilizzazione: aggiungere 200 μL di concentrato fisso 1x e miscelare delicatamente con la pipetta P200 per risospendere le cellule. Incubare al buio per 45-60 min. Centrifugare la piastra per 5 minuti a 500 x g a temperatura ambiente (RT) e agitare per eliminare il surnatante.NOTA: Se necessario, il protocollo può essere sospeso a questo punto. Dopo aver scartato il surnatante, sospendere nuovamente le cellule in un tampone di conservazione a lungo termine per le cellule immunitarie (vedere la tabella dei materiali per le raccomandazioni sui prodotti). I campioni possono essere conservati a 4 °C per 12-18 ore, protetti dalla luce e ricoperti da una pellicola trasparente per proteggere l’evaporazione del tampone. Aggiungere 200 μL di tampone di permeabilizzazione 1x a ciascun pozzetto e pipettare con un P200 da miscelare. Centrifugare la piastra per 5 minuti a 500 x g a RT e agitare per eliminare il surnatante. Ripetere il lavaggio del tampone di permeabilizzazione per un totale di 3 volte. Preparazione dei controlli di flusso: suddividere il volume di cellule da ciascun campione per i controlli di flusso richiesti (sono sufficienti 10.000-30.000 cellule per pozzetto di controllo).Per preparare il controllo antimacchia, fissare le cellule antimacchia del tipo o dell’aliquota delle cellule non colorate in un pozzetto separato che non riceverà alcun anticorpo. Per preparare il controllo della fluorescenza meno uno (FMO), aliquote di cellule per ciascuno degli anticorpi sul pannello tranne quello in quel canale. Per i canali pertinenti, includere l’anticorpo di controllo dell’isotipo nell’FMO per il gating. Ad esempio, in un pannello contenente P2RY12-APC e H3K27Ac-AlexaFluor568, dovrebbero essere presenti due FMOS: (1) l’APC-FMO che contiene solo H3K27Ac-AlexaFluor568 e l’anticorpo di controllo dell’isotipo P2RY12 e (2) il 568-FMO che contiene solo P2RY12-APC e il controllo dell’isotipo primario e 568 secondario.NOTA: Questo protocollo viene presentato per testare un singolo HPTM, tuttavia è possibile stabilire pannelli che contengono molti HPTM coniugati a diversi fluorofori. Colorazione con anticorpi primari: aggiungere 50 μL di tampone di permeabilizzazione 1x con la concentrazione appropriata di anticorpo primario in ciascun pozzetto. Incubare per 30 minuti a RT al buio. Lavare 2 volte con 200 μL di 1x tampone di permeabilizzazione.NOTA: La concentrazione di anticorpi utilizzati per ciascun HPTM è inclusa nella Tabella dei materiali. La concentrazione viene determinata testando diverse concentrazioni degli anticorpi su cellule in coltura trattate con uno stimolante che causerebbe un aumento drammatico, ad esempio un inibitore HDAC per i segni di acetilazione e assicurandosi che sia le cellule non trattate che quelle trattate fossero ben all’interno dell’intervallo di rilevamento (al di sopra del controllo dell’isotipo e al di sotto dell’intervallo di rilevamento massimo del citometro). La concentrazione ottimale di anticorpi per gli HPTM dovrebbe avere un’intensità fluorescente mediana media nel canale del fluoroforo compresa tra 5 x 104 e 1 x 105. Colorazione secondaria degli anticorpi: bloccare con 200 μL di tampone di permeabilizzazione 1x con siero d’asina normale (NDS) al 2% per 10 minuti a RT. Girare per 5 minuti a 500 x g a RT e agitare per rimuovere il surnatante. Aggiungere 50 μL di tampone di permeabilizzazione 1x con NDS al 2% e la concentrazione appropriata di anticorpo secondario e incubare per 30 minuti a RT al buio. Aggiungere 200 μL di tampone di permeabilizzazione 1x ai pozzetti da diluire, centrifugare la piastra per 5 minuti a 500 x g a RT e sbattere per scartare il surnatante. Celle di lavaggio 2x con 200 μL di 1x tampone di permeabilizzazione.NOTA: Se necessario, sospendere il protocollo a questo punto. Risospendere le cellule in 200 μL di tampone di conservazione a lungo termine per cellule immunitarie con pipetta P200 (vedere la tabella dei materiali per le raccomandazioni) e conservare a 4 °C per 12-24 ore al riparo dalla luce. Preparazione per la citometria a flusso: centrifugare la piastra per 5 minuti a 500 x g a RT e sbattere per eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS utilizzando una pipetta P200 per la citometria a flusso. Sigillatura con pellicola trasparente per il trasporto al citometro. Citometria a flussoPer analizzare il pannello anticorpale proposto, assicurarsi che il citometro sia dotato di almeno quattro laser, tra cui viola (405 nm), blu (488 nm), giallo (561 nm) e rosso (633 nm). Il citometro necessita di filtri per rilevare FITC (blu-525 nm), KRO (viola-525 nm), PE (giallo-585 nm) e APC (rosso-660 nm). Aggiungere altri anticorpi a seconda del citometro scelto. Calibrazione e standardizzazione: all’inizio di ogni esperimento, eseguire le perle fluorescenti arcobaleno e regolare la tensione del tubo fotomoltiplicatore (PMT) fino a quando i picchi delle microsfere non sono paragonabili ai valori target eseguiti per gli esperimenti precedenti. Questo metodo di standardizzazione consente di adattarsi alla deriva delle apparecchiature nel tempo. Compensazione: dopo che la tensione e il guadagno PMT sono stati impostati per l’esperimento, utilizzare le perle di compensazione catturate dall’anticorpo per stabilire la matrice di compensazione per il pannello di anticorpi. Questo calcolo assicurerà che i fluorofori non contribuiscano alle variazioni di segnale in altri canali. Ciò è sempre più necessario quando si esegue il multiplexing di più anticorpi. Dimensione gating: in un dot plot, tracciare SSC-A su log rispetto a FSC-H su lineare. Escludere i detriti e selezionare la dimensione della cella utilizzando il gate S1. Selezionare per le celle singoletto in un grafico a punti di FSC-W rispetto a FSC-H e gate come S2. (Figura 4). Definizione delle porte del fluoroforo: utilizzando l’FMO pertinente per ciascun canale del fluoroforo, stabilire le porte per determinare qual è un segnale positivo in ciascun canale utilizzando istogrammi a parametro singolo (Figura 4). Misurazione dei campioni: registrare attentamente i campioni utilizzando la strategia di gating stabilita. Identificare la microglia utilizzando il segnale P2RY12+, determinare l’espressione della proteina nei rispettivi canali solo per la microglia. Analisi dei dati di citometria a flussoStabilire le porte di analisi: utilizzando i passaggi precedenti per il citometro sull’interfaccia utente del software di analisi, utilizzare le stesse porte utilizzate per la registrazione per l’analisi. Ottenere i valori MFI utilizzando il software di analisi della citometria a flusso (vedere la tabella dei materiali per le raccomandazioni): ricapitolare la strategia di gating del citometro per l’analisi del flusso. Utilizzando la funzione di aggiunta di statistiche, selezionare la mediana per la popolazione di interesse (ad esempio, 568+) sull’altezza del canale compensata. Utilizzando l’editor di tabelle, esportare i valori mediani di intensità fluorescente (MFI) per i rispettivi canali in un foglio di calcolo per procedere con l’analisi statistica (Tabella 2).NOTA: Il file supplementare S1 include dati di esempio da topi iniettati con lipopolisaccaridi (LPS) e soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e un file di analisi di esempio con la strategia di gating e i valori MFI. Analisi dei valori di MFI per il cambiamento di ripiegamento della proteina: dopo aver ottenuto i valori di MFI, calcolare il cambiamento di ripiegamento dell’MFI rispetto alla popolazione di controllo o non trattata (Equazione 1). Il cambiamento di piega dell’MFI riflette il cambiamento di piega nei livelli di proteine. Utilizzando i valori di variazione della piega, valutare la variazione di espressione e calcolare la significatività statistica utilizzando un test t o ANOVA.Equazione 1 Figura 4: Strategia di gating per la valutazione delle IFM proteiche. Gli eventi vengono controllati prima per le dimensioni delle celle su SSC-A rispetto a FSC-H (S1). Le cellule vengono quindi controllate per singoletti su FSC-H vs FSC-W (S2). Le cellule singoletto vengono quindi identificate come microglia dal segnale P2RY12-APC (APC+) con il gate stabilito in base alla fluorescenza in un controllo APC-FMO che contiene un anticorpo di controllo dell’isotipo. Le celle vengono quindi controllate per il segnale H3K27Ac-AlexaFluor568 su Comp-FL5-A::Y610-mCherry. L’intensità fluorescente delle cellule 610+ è determinata come proxy per l’espressione proteica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.