オンセクション相関光電子顕微鏡による内因性LC3の超微細構造局在

1. ツールと試薬の準備 注:必要な試薬、バッファー、および溶液の詳細については、 補足ファイル 1 または 12 を参照してください。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、機器、およびソフトウェアに関する詳細については、 材料表を参照してください。 固定剤補足ファイル1に記載されているように、0.2 Mリン酸緩衝液(PB)または0.2 Mパイプ、HEPES、EGTAおよびMgSO4(PHEM)緩衝液を調製し、固定液のベースとして使用します。注:固定剤は、生体物質とのアルデヒド反応によって引き起こされる酸性化を防ぐために、0.1 M PBまたはPHEM緩衝液に日常的に緩衝されています。 パラホルムアルデヒド(PFA)の品質は、サンプルの超微細構造を確実に固定するための鍵となるため、EM グレードの PFA を使用してください。このプロトコールに従うには、高品質の PFA プリルから調製した 16% ストック溶液を使用します( 補足ファイル 1 を参照)。注意:パラホルムアルデヒドは危険な化学物質です(危険有害性情報H228、H301、H302、H311、H314、H315、H317、H318、H331、H332、H335、H341、H350)。PFAを扱うときは、保護具(手袋、白衣、保護メガネ)を着用し、化学フードで作業してください。PFAを含む廃棄物は、研究所のガイドラインと規制に従って収集および処分する必要があります。 10 mL の 0.2 M PB、5 mL の 16% PFA(脱塩水 [dH 2 O])、および 5 mLの dH2O を混合して、4% PFA の固定液を調製します。 オプション:ステップ1.1.3の固定液に0.02%〜0.5%のグルタルアルデヒド(GA)を添加すると、超微細構造の保存は改善されますが、多くの抗体に対するサンプルの抗原性が低下します。注:GA固定が必要な場合は、適切なサプライヤーのEMグレードGAを使用してください。注意: グルタルアルデヒドは危険な化学物質です(危険有害性情報H301、H302、H314、H317、H330、H332、H334、H335、H400、H411)。GAを操作するときは、化学フードで作業し、保護具(手袋、白衣、保護メガネ)を着用してください。 GAを含む廃棄物は、研究所のガイドラインと規制に従って収集および処分する必要があります。 ツールと材料アルミニウム製サンプルホルダーピンの表面を引っ掻き、エタノールで3 x 10分間超音波処理して金属の残留物を除去し、ゼラチン包埋セルブロックをピンに取り付けたときに最適な接着性を確保します。 アルミニウム製サンプルホルダーピンとサンプルを液体窒素(LN2)で保管するのに適した保管キャニスターを使用してください。 マニキュアを使って木の串の先に髪の毛やまつげを1本貼ってマニピュレーターを作ります。 ピックアップループを作成します。直径0.3mmの丸棒に0.3mmの太さのステンレス鋼線を巻き付け、両端をねじり合わせて、一方の端にループを形成します。ねじれた端をピペットチップに挿入します。もう一方の端から木の串を差し込み、接着剤または樹脂で貼り付けます。注意: ピックアップループも市販されています( 材料表を参照)。 グリッド乾燥ループを準備するには、ピックアップループを作るのと同じ手順で、4mmのループ状にステンレス製のワイヤーを作り、接着剤または樹脂で大きなピペットチップに貼り付けます。 formvarなどの薄い支持フィルムを使用してグリッドをコーティングします( 補足ファイル1のプロトコル)。使用する前に、グリッドをカーボンの薄層でコーティングします。注意: すぐに使用できるグリッドは市販されています( 材料表を参照)。Formvarでコーティングされたグリッドは、室温(RT)で無期限に保存できます。カーボンコーティングされたグリッドは、RTで数ヶ月間保管することができます。 13のように、清潔なスライドガラスと大きなカバーガラス(24 mm x 24 mmが幅25 mmのスライドガラスに最適です)を準備します。 2. 固定とサンプル調製 固定ステップ 1.1.3 で調製した固定液(0.1 M PB 中に 4% PFA)を使用します。接着細胞株の場合、6cmの皿で1〜5×106 細胞を培養します。固定液を培地に1:1の比率で添加し、サンプルを室温で5分間インキュベートします。次に、培地固定剤混合物を固定液のみに交換し、室温で2時間インキュベートします。注:正確な細胞数、コンフルエンス、および培養条件は、使用するモデルシステムによって異なる場合があります。 サンプルを0.5% PFA中、0.1 M PB中、4°Cで一晩または最大3〜4週間保存します。注:GAを固定に追加し(ステップ1.1.4を参照)、固定長さを変更して、標本や標識ごとに異なる形態の保存と抗原性の最適なバランスを見つけることができます。詳細については、「14」を参照してください。 サンプル埋め込み固定セルで皿をRTでPBSで3回洗浄します。その後、0.15%グリシンを含むPBSと交換し、室温で10分間インキュベートします。 37°Cに予熱したPBS中の0.15%グリシンを含むPBSを1%ゼラチンに置き換え、1%ゼラチン中の細胞をこすり落として微量遠心チューブに移します。細胞を6,000 × g で1分間、室温で微量遠心分離機でペレット化します。次に、ペレットを乱さずに1%ゼラチンを除去し、37°Cに加温した12%ゼラチンを加えます。 37°Cに予熱したピペットチップまたはガラス製のパスツールピペットで静かにピペッティングして、細胞ペレットを再懸濁します。 37°Cで10分間インキュベートします。次に、細胞を6,000 × g で1分間ペレット化します。ゼラチンを氷上で30分間固化させます。 ゼラチンが埋め込まれた細胞をチューブから取り除くには、ペレットを含むチューブの端をカミソリの刃でチューブの残りの部分から切り取ります。次に、最初のカットに対して垂直に、セルペレットでチューブの端を半分にカットします。 ゼラチン包埋細胞ペレットを含む2本のチューブ末端半分を2.3 Mスクロース中で4°Cで10分間インキュベートします。 これにより、ゼラチンが埋め込まれた細胞ペレットの半分がわずかに収縮し、プラスチックチューブから外れます。注:ゼラチン包埋細胞ペレットは、2.3 Mスクロースが粘性になりすぎたり、ゼラチンが柔らかくなりすぎたりしないように、できるだけ4°Cまたは氷冷に保つ必要があります。次のステップでゼラチン包埋細胞ペレットを操作する際には、一度に1つのサンプルのみで作業し、他のサンプルは氷上に置いておくか、低温(~4°C)の部屋で作業してください。ゼラチン包埋細胞ペレットは、日光、高温の顕微鏡ランプ、またはその他の熱源による過熱を避けてください。 ゼラチンを包埋した細胞ペレットでチューブの半分を2.3 Mスクロースから取り出します。次に、ゼラチンが埋め込まれた細胞ペレットの半分をピンセットでプラスチックチューブの半分から取り除きます。カミソリの刃でペレットを適切なサイズ(~1 mm3)のブロックに手動で切断します。実体解剖顕微鏡を使用して、切断中に被写体を拡大します。 ゼラチン包埋細胞ブロックに2.3 Mスクロースを3〜16時間注入し、4°Cのローター内で端から端まで回転させます。 ゼラチン包埋セルブロックをアルミニウム製サンプルホルダーピンに取り付けます(ステップ1.2.1参照)。ブロックとピンの間に薄い「カラー」を形成するように、ブロックの端の周りに十分な2.3 Mのスクロースを残します。ブロックの上部を覆う2.3 Mスクロースが多すぎないようにします。スナップ凍結して LN2 に保管します。 3. セクショニング トリミング (12 も参照)ゼラチン包埋細胞のブロックが入ったピンをLN2 ストレージから取り出し、-80°Cに設定したクライオミクロトーム内に置きます。 ブロックの前面をトリミングして表面を平らにし、~250 nmの断面を取得します。3 mmのループをピックアップ溶液(1:1 2.3 Mスクロースと2%メチルセルロース)に浸し、ループをミクロトームのクライオチャンバーに挿入し、液滴に氷が形成され始めるまで待ちます(通常は5〜7秒)。次に、液滴をすばやく、しかしそっと押し付けて、すぐに切片を拾います。クライオチャンバーからループを取り外し、液滴が完全に解凍するまで待ってから、スライドガラス上で液滴を押します。 切片のトルイジン青色染色により細胞の配向を確認します。トルイジンブルー溶液( 補足ファイル1参照)をスライドガラスの切片の上に一滴置き、滴の端が乾くまで80°Cの加熱プレートで乾かします。 スライドガラスを加熱プレートから取り外し、トルイジンブルーをdH2Oで静かに洗い流し、適切な廃棄物容器に集めます。 スライドガラスを乾燥させ、シンプルな卓上型光学顕微鏡で切片の細胞配向を確認します。 ナイフの角でサンプルブロック面の側面に50〜100μmを切断することにより、ブロックの側面をトリミングします。サンプルブロック面の4辺をトリミングした後、サンプルホルダーを90°回転させて、突き出た~250 μm x 375 μmの長方形を作成します。前の手順で決定したセルの向きに基づいて、突出領域を選択します。 セクショニングとピックアップクライオミクロトームを-100°Cに冷却します。 突き出た長方形からリボンを切断し、断面は厚さ70〜90 nmで、銀色がかった金色の光沢があります。スティックに髪の毛を付けて、ダイヤモンドナイフの端からセクションを離してガイドし(セクション1.2.3を参照)、長い(2〜5 mm)リボンを作成します。 適切なリボンが形成されたら、切片化を停止してリボンを拾います。3 mmピックアップループを2.3 Mスクロースと2%メチルセルロースを1:1で混合したものに浸し、ループをミクロトームのクライオチャンバーに挿入し、液滴が凍結し始めるまで待ちます(通常は5〜7秒)。次に、液滴をすばやく、しかしそっと押し付けて、すぐに切片を拾います。クライオチャンバーからループを取り外し、液滴が完全に解凍するまで待ってから、準備したグリッドに液滴を押します(ステップ1.2.6)。注:セクションのあるグリッドは、4°Cで数か月間保存できます。 4. ラベリングと光学顕微鏡 ラベリング切片(図1A)を下にして、小皿またはマルチウェルプレートに~1 mLのPBSを置きます。37°Cで30分間インキュベートします。注意: このステップでは、セルの間にあるゼラチンを取り除きます。ゼラチンは切片化後には不要で、残りのプロトコルに干渉します。 パラフィルム上の~75 μLの液滴でグリッドを断面側を下にして処理します( 図1Bを参照)。室温でPBS + 0.15%グリシン洗浄(3 x 2分)から開始します。次に、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)-c + 0.5%魚皮ゼラチン(FSG)をPBS中でブロッキングステップとしてRTで10分間インキュベートします。一次抗体を PBS に 0.1% BSA-c + 0.5% FSG で希釈し、この溶液の ~10 μL 液滴上でグリッドを 1 時間 RT でインキュベートします(図 1C)。 0.1% BSA in PBS 5x at RTでグリッドを洗浄します。次に、二次抗体と4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI;10 μg/mL)をPBS中の0.1% BSA-c + 0.5% FSGで希釈し、この溶液の~10 μLの液滴上でグリッドを室温で30+分間インキュベートします(図1C)。RTでPBSでグリッドを5回洗浄します。注:オプションで、二次抗体をプロテインA(PAG)に結合した5、10、15、または20 nmの金コロイド粒子で標識して、EMで目的のタンパク質を局在化させることができます。これが必要な場合は、ステップ4.1.3の後にRTで20分間、グリッドをPAGとインキュベートします。その後、RTでPBSで5回洗浄します。 複数の一次抗体の同時使用を避け、望ましくない交差反応を防ぐために、異なる動物のIgGに対するPAGの反応性に注意してください。詳細については、「12. 光学顕微鏡用埋込サンプルグリッドを 50% グリセロール (dH 2 O2x 5 min) に室温で浸し、スライドガラスとカバーガラスの間にグリッドを 50% グリセロールで挟み、カバーガラスごとに 1 グリッドを挟み、切片をカバーガラスに面させます (図 1D)。注:グリッドを50%グリセロールに30分以上取り付けたままにしておくと、ラベリングの品質が低下する可能性があります。そのため、一度に2つまたは3つのグリッドを取り付けてイメージングし、それ以外は二次ラベリング溶液に残しておくことをお勧めします。 光学顕微鏡グリッドを挟んだスライドガラスを、自動ステージを備えた広視野顕微鏡に持っていきます。高倍率(63倍または100倍)のオイル対物レンズを選択します。セクションのリボン(の一部)の画像タイルセットを作成します(図1E)。注:一部の二次抗体は、グリッド上、特に切片のひだや裂け目の周囲に蛍光凝集体を形成することがあります。さらに、一部の細胞タイプや組織には自家蛍光構造が含まれています。このような問題が予想される場合は、一次抗体とインキュベートしていないネガティブコントロールグリッドを含めることをお勧めします。 アンマウントとEMコントラストスライドガラスカバーガラスサンドイッチの側面に10 μLの精製水(dH2O)を加え、毛細管現象がガラススライドサンドイッチ界面を満たすのを待ちます。グリセロールに浸漬油を混ぜずにカバーガラスを慎重に取り除きます。ピンセットでグリッドを回収し、室温でdH2O 3xに浸して50%グリセロールを洗い流します。注意: 油はウラニル染色を妨げ、EMコントラストを悪化させる可能性があります。 グリッドの裏側を糸くずの出ないティッシュペーパーで慎重に乾かします。注:サンプルに金コロイド粒子も標識されている場合は、次の手順を実行します:切片を下にしてグリッドをPBS液滴上に置き、室温で2回洗浄します。 室温で5分間、1%GAに後付けします(1.1.4の注意を参照)。室温でPBS 2xで洗浄します。 グリッドを切片側を下にしてdH2O液滴の上に置き、室温で8回洗浄します。 EMで造影剤として切片を染色するには、酢酸ウラニル(UA)、pH 7、室温で5分間インキュベートします(図1F)。 グリッドを配置する前に、氷上の金属板上のパラフィルムに液滴を置いて、UA:メチルセルロース(pH 4)を冷却します。次に、グリッドを氷冷 UA:メチルセルロース、pH 4、2x で洗浄し、氷冷 UA:メチルセルロース、pH 4 で 10 分間インキュベートします(図 1F)。注意: 酢酸ウラニルは危険な化学物質です(危険有害性情報H300、H330、H373、H411)。UAが必要なステップでは、化学フードで作業し、保護具(白衣、手袋、保護メガネ)を着用してください。UAを含む廃棄物は、研究所のガイドラインおよび規制に従って収集および処分します。 グリッド乾燥ループをグリッドの下のUA:メチルセルロース液滴に挿入し、グリッドが液滴12から引き離されるまでゆっくりと持ち上げることにより、グリッドをループアウトします。糸くずの出ない濾紙( 材料表を参照)に~60°の角度(下を向いた部分)でループに触れ、UA:メチルセルロースが吸収されなくなるまで紙に沿ってゆっくりとドラッグして、余分なUA:メチルセルロースを拭き取ります。次に、グリッド付きのループを適切なラックに置き、室温で>10分間乾燥させます(図1G)。 5. エマージング 光学顕微鏡で得られた概要を使用して、透過型電子顕微鏡(TEM;図1H)。光学顕微鏡データセットのROIに注釈を付けます。領域を選択したら、TEMで20,000x-50,000xの倍率で画像タイルセットを取得します。後処理ソフトウェア15,16で画像タイルセットを再構築する。 6. 相関と分析 光学顕微鏡とEMデータセットを、ImageJ/Fiji17、Icy18のec-CLEMプラグイン、Photoshopなどの適切な画像処理ソフトウェアにロードします。光学顕微鏡データセットをトリミングして回転させ、EMタイルセットに合わせます。蛍光のDAPIシグナルとEMの核外形に基づいて相関を実行します(図1I)。画像をシフトして正確に重ね合わせ、手動の相関関係を正確に実行します。このアプローチをより正確にするには、たとえば、Icy の ec-CLEM プラグインや ImageJ の BigWarp プラグインを使用してランドマークベースの相関を適用し、対応するポイントを手動で選択して画像を関連付けます。ec-CLEMとの相関関係に関する詳細なステップバイステップのプロトコルが利用可能です19。注:このアプローチは、バイモーダル基準プローブ20,21の使用でもうまく機能します。 適切なプログラム(ImageJなど)で蛍光シグナルに基づいてROIを選択することにより、相関画像を解析します。定量分析では、すべての標識オルガネラの ROI のコレクションを作成します。次に、個々のROIの対応する超微細構造を検査し、形態学的要素に基づいて分類します。