Visualização de Organelas In Situ por Tomografia Crio-STEM
Summary
A tomografia crio-STEM fornece um meio de visualizar organelas de células intactas sem incorporação, seccionamento ou outras preparações invasivas. A resolução 3D obtida está atualmente na faixa de poucos nanômetros, com um campo de visão de vários micrômetros e uma espessura acessível na ordem de 1 μm.
Abstract
A microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) baseia-se na obtenção de imagens de espécimes biológicos ou orgânicos embutidos em seu meio aquoso nativo; A água é solidificada em um vidro (ou seja, vitrificado) sem cristalização. O método crio-EM é amplamente utilizado para determinar a estrutura de macromoléculas biológicas recentemente em uma resolução quase atômica. A abordagem foi estendida para o estudo de organelas e células usando tomografia, mas o modo convencional de imagem EM de transmissão de campo largo sofre uma severa limitação na espessura da peça. Isso levou a uma prática de moagem de lamelas finas usando um feixe de íons focalizado; A alta resolução é obtida pela média do subtomograma das reconstruções, mas relações tridimensionais fora da camada restante são perdidas. A limitação de espessura pode ser contornada por imagens de sonda digitalizadas, semelhante ao EM de varredura ou ao microscópio confocal de varredura a laser. Enquanto a microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM) em ciência dos materiais fornece resolução atômica em imagens únicas, a sensibilidade de espécimes biológicos criogênicos à irradiação eletrônica requer considerações especiais. Este protocolo apresenta um setup para criotomografia utilizando STEM. A configuração tópica básica do microscópio é descrita para sistemas de dois e três condensadores, enquanto a automação é fornecida pelo software não comercial SerialEM. Aprimoramentos para aquisição de lotes e alinhamento correlativo a mapas de fluorescência previamente adquiridos também são descritos. Como exemplo, mostramos a reconstrução de uma mitocôndria, apontando a membrana interna e externa e grânulos de fosfato de cálcio, bem como microtúbulos circundantes, filamentos de actina e ribossomos. A tomografia crio-STEM se destaca por revelar o teatro de organelas no citoplasma e, em alguns casos, até mesmo na periferia nuclear de células aderentes em cultura.
Introduction
A visualização tridimensional (3D) de organelas é uma tarefa primordial na biologia celular moderna. Dadas as escalas envolvidas, variando de dezenas de nanômetros para vesículas secretoras a muitos mícrons para o núcleo celular, é desafiador encontrar uma única técnica de microscopia para atender a todas as aplicações. Enquanto a microscopia de fluorescência moderna pode abranger grande parte do intervalo em termos de resolução, apenas as moléculas marcadas aparecem. O teatro celular continua sendo o reino da microscopia eletrônica. Os métodos convencionais de fixação química, incorporação plástica e coloração com metais pesados são fortemente invasivos, de modo que os resultados podem depender dos detalhes da preparação da amostra. O crio-EM, por outro lado, é limitado pela necessidade de vitrificação do meio aquoso; cristais de gelo que formam difratam a iluminação eletrônica, causando artefatos de contraste de maior contraste do que o material orgânico de interesse.
Na última década, proliferaram técnicas de imagem em ME desenvolvidas ou adaptadas para estudoscelulares1. O congelamento a alta pressão combinado com fresagem iterativa por feixe de íons focalizados (FIB) e imagens seriadas de superfície usando o microscópio eletrônico de varredura (i.e., FIB-SEM) é atualmente o método de escolha para grandes espécimes2. A tomografia criogênica de raios X moles (crio-SXT) é adequada para amostras de vários mícrons de tamanho, limitado pelo comprimento característico de absorção dos raios X moles em água 3,4,5. Essa escala inclui muitos tipos celulares intactos, e a natureza quantitativa do contraste de absorção de raios X adiciona um aspecto de medição de concentração6 ou espectroscopia7. Quando combinada com a média do subtomograma, a tomografia eletrônica de criotransmissão (crio-TE), baseada em microscopia eletrônica de transmissão por contraste de fase (MET), oferece a mais alta resolução para macromoléculas ou complexos 8,9,10. No entanto, é raro que organelas intactas sejam tão regulares que possam ser médias inteiras. Além disso, o modo convencional de MET de campo largo é limitado para a espessura do espécime a algumas centenas de nanômetros pela combinação de espalhamento inelástico (envolvendo perda de energia) no espécime e aberração cromática na objetiva magnética11,12. A grande dispersão de energia dita o uso de um filtro de energia para remover a névoa fora de foco resultante, mas o espécime sensível ainda sofre danos de radiação, enquanto o sinal de imagem se torna exponencialmente mais fraco com o aumento da espessura.
O modo alternativo de imagem, scanning transmission EM (STEM), contorna a necessidade de filtragem de energia e retém os elétrons espalhados inelasticamente para a formação da imagem, embora atualmente em uma resolução menor do que para a tomografia por TEM (Figura 1). Na verdade, nenhuma imagem real é formada. Em vez disso, como em um EM de varredura, as medições são feitas ponto a ponto, e a imagem é montada pelo computador. A ampliação é determinada apenas pelo tamanho das etapas de varredura sem alterar as correntes da lente. Quando bem configurada, a faixa útil de espessura da amostra para tomografia crio-STEM (CSTET) pode chegar a 1,5 ou até 2 μm, embora a zona de conforto, onde a intensidade útil do sinal permanece uma fração significativa da iluminação, esteja em torno de 600-900 nm11,13. Isso é suficiente para ver uma grande fração do citoplasma e, ocasionalmente, uma borda do núcleo celular. Na prática, descobrimos que a vitrificação pelo método padrão de imersão em fluido criogênico impõe uma restrição mais severa na espessura do que a imagem STEM. O objetivo deste artigo em vídeo é facilitar a incorporação do CSTET no tórax de ferramentas para imagens de células e organelas em laboratórios de pesquisa e instalações de microscopia.
O primeiro desafio é que as operações de microscópio no CSTET ainda não estão padronizadas para aplicações em ciências da vida da mesma forma que têm sido para a tomografia por crio-TEM. O hardware STEM raramente (ou nunca) foi direcionado para o mercado de crio-EM. No entanto, isso está mudando com a mais nova geração de microscópios, e muitas ferramentas existentes podem ser adaptadas. A técnica STEM tem decolado e assumido largamente as ciências dos materiais, onde também há um crescente interesse em métodos criogênicos e de baixa dose14,15. A literatura de ciência dos materiais é abundante com siglas BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM, etc., que aumentam a confusão. Oferecemos aqui um ponto de partida recomendado que, em nossa experiência coletiva no Instituto Weizmann de Ciências, fornece o protocolo mais geral para resultados úteis baseados em imagens STEM de campo brilhante (BF)16. De forma alguma esgota ou mesmo explora o leque de possibilidades, mas servirá de base para novos aprimoramentos. Embora enfatizemos a crio-STEM, a maior parte do protocolo é igualmente relevante para a tomografia STEM à temperatura ambiente de cortes embebidos em plástico.
A essência do STEM é escanear o espécime com uma sonda eletrônica focalizada (Figura 1), o cone de iluminação, e registrar sinais do plano de difração (espalhamento) em transmissão, pixel a pixel, para produzir imagens 2D17,18. Espécimes amorfos, incluindo a maioria dos materiais celulares, produzirão um padrão de espalhamento difuso na transmissão. A configuração STEM prática mais simples é colocar um detector circular para registrar o disco central (ou seja, a iluminação da sonda que seria transmitida sem uma amostra). O espécime espalha elétrons para longe deste cone de iluminação na medida em que o sinal diminui. Isso produz uma imagem BF – o espécime aparece escuro em um fundo brilhante. Um detector anular também pode (ou em vez disso) ser usado para detectar o espalhamento do espécime fora do cone de iluminação. Com o espécime retirado, não há sinal. Quando um espécime está no lugar, os objetos aparecem brilhantes em um fundo escuro na imagem de campo escuro (DF). A nomenclatura para STEM (BF, campo escuro anular [ADF], campo escuro anular de alto ângulo [HAADF], etc.) refere-se principalmente às faixas de ângulos de coleta para os detectores.
O ângulo de convergência da iluminação representa uma adaptação essencial do STEM à tomografia celular. Quando a prioridade máxima é alta resolução, o ângulo de convergência deve ser o maior possível. (Isso é semelhante à microscopia confocal de varredura a laser; a resolução é determinada pelo diâmetro da sonda, que escala como o comprimento de onda dividido pela abertura numérica. Note que nos referimos ao ângulo de meio-ângulo ou semi-convergência para EM.) Quando a prioridade é a profundidade de campo, por outro lado, um comprometimento na resolução oferece uma grande vantagem, pois o feixe focalizado permanece aproximadamente paralelo por uma distância igual ao dobro do comprimento de onda dividido pelo semiângulo quadrado. O ideal é que todo o volume celular permaneça emfoco19. Por exemplo, a 300 keV, o comprimento de onda do elétron deBroglie é de 0,002 nm, então uma convergência de 1 mrad produz uma resolução de 2 nm e uma profundidade de campo de 4 mícrons. Nessas condições, a tomografia pode ser realizada mesmo sem foco durante o processo de coleta de dados, mas apenas uma vez no início da aquisição. Um STEM convencional capaz de tomografia pode atingir um ângulo de semiconvergência de 7 ou 8 mrad; Portanto, em princípio, poderíamos chegar a uma resolução da ordem de 0,25 nm, mas então com uma profundidade focal de apenas 62 nm. Isso é claramente muito fino para imagens celulares. Microscópios mais avançados com três lentes condensadoras oferecem ajuste contínuo do ângulo de semiconvergência em uma faixa considerável. Com a configuração mais tradicional de dois condensadores, a convergência é fixada discretamente pela abertura do condensador (C2).
Para amostras robustas embutidas em plástico, pode-se gravar uma série focal em cada inclinação e combiná-las para alta resolução20, mas para amostras criogênicas, o orçamento de radiação é muito restrito. Finalmente, na ponderação das vantagens da imagem de FS ou FD, para espécimes espessos, deve-se considerar os efeitos do espalhamento elástico múltiplo no espécime. O sinal do FS é menos corrompido por espalhamento múltiplo e apresenta maior resolução para espécimes espessos16,21.
Uma regra prática útil tem sido definir ângulos de coleta várias vezes maiores do que a convergência. Quanto mais espesso o espécime, maior deve ser o disco de coleta. Um disco muito pequeno fornecerá uma baixa intensidade de sinal; Um disco muito grande resultará em contraste de imagem ruim, pois apenas a dispersão de ângulo mais alto contribuirá. Os ângulos de coleta devem ser otimizados para uma determinada amostra. Os ângulos do detector em função do comprimento da câmera (difração) devem ser calibrados independentemente. Eles podem ser exibidos convenientemente pelo software do microscópio. Na prática, um fator de dois a cinco na razão entre os semiângulos de coleta e iluminação, θ e α, respectivamente (Figura 1), é um ponto de partida recomendado para o CSTET de espécimes celulares.
O protocolo a seguir descreve a operação da tomografia STEM utilizando o popular software SerialEM para controle microscópico22,23. SerialEM não está vinculado a um fabricante específico, e é amplamente utilizado em tomografia de TEM. A maioria das operações de montagem para tomografia pode ser realizada diretamente do TEM. A estratégia do SerialEM é modelar o sistema de digitalização como uma câmera. Isso permite o cruzamento simples de TEM para STEM. Deve-se ter em mente, no entanto, que parâmetros como ampliação e binning são totalmente artificiais. Os parâmetros importantes são o campo de visão em mícrons, o número de pixels no campo de visão e o tempo de exposição. O espaçamento entre pixels, ou amostragem, é o campo linear dividido pelo número de pixels, enquanto o tempo de permanência é o número de pixels dividido pelo tempo de exposição.
A configuração mínima para STEM e CSTET envolve três recursos no microscópio: um gerador de varredura, um detector STEM e um software de controle de tomografia. O protocolo refere-se à nomenclatura da FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), mas os conceitos são genéricos. O software proprietário do TFS foi descrito no JoVE para TEM24, e a operação STEM é muito semelhante.
Assumimos que o microscópio foi alinhado com antecedência pela equipe de serviço ou equipe experiente e que um alinhamento de coluna pode ser chamado carregando um arquivo. Pequenos ajustes são chamados de alinhamentos diretos e podem ser armazenados nos chamados registradores FEG (microscópios TFS). Os alinhamentos diretos incluem centro de rotação, pontos de pivô, alinhamento de difração e compensação para o astigmatismo do condensador. Os ajustes devem ser realizados de forma iterativa. Observe que os microscópios TFS implementam modos distintos de nanossonda (nP) e microssonda (μP); para uma dada abertura do condensador, estes fornecem um campo de visão relativamente estreito ou largo com iluminação paralela em MET e um feixe de elétrons mais ou menos convergente (fortemente focado) em STEM, respectivamente. Outros fabricantes utilizam esquemas diferentes para cobrir a gama de ângulos de convergência.
Antes de iniciar, deve-se escolher o campo de visão, L, e a amostragem (largura do pixel), l, dependendo da amostra em estudo. Por exemplo, para l = 1 nm/pixel, uma imagem de 4.000 x 4.000 pixels que cobrirá um campo de visão de 4 μm2 deve ser escolhida. A resolução será, na melhor das hipóteses, o dobro da amostragem espacial, então 2 nm, e o diâmetro da sonda, d, deve corresponder a isso. A calibração do ângulo da sonda está além do escopo deste protocolo, então assumimos que uma tabela ou uma leitura de tela está disponível. O diâmetro da sonda é aproximadamente o comprimento de onda do elétron dividido pelo ângulo de semiconvergência (em radianos): d = λ/θ. O comprimento de onda, λ, é de 0,002 nm para 300 keV e 0,0025 nm para elétrons de 200 keV, então θ de 1 mrad fornecerá um diâmetro de ponto de 2 ou 2,5 nm, respectivamente.
O protocolo apresenta-se numa progressão de complexidade crescente. A primeira tarefa é produzir uma imagem STEM, que depende do software do fabricante do microscópio, e depois uma série de inclinação, para a qual usamos o SerialEM. Muitos leitores, sem dúvida, estarão familiarizados com o SerialEM, então as tarefas mais complicadas virão naturalmente. Não há necessidade de seguir os procedimentos rigorosamente. Desenvolvimentos relacionados à automação podem ser implementados diretamente para STEM e TEM. Usuários experientes provavelmente inverterão o protocolo, começando com o registro correlativo de mapas de fluorescência e continuando a configurar a tomografia em lote. Mais detalhes podem ser encontrados na extensa documentação e bibliotecas de tutoriais do próprio SerialEM, incluindo um artigo recente do JoVE sobre os últimos desenvolvimentos em automação25.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo deve auxiliar microscopistas de ciências da vida interessados em obter uma visão 3D de organelas intracelulares em regiões da célula que não são acessíveis à tomografia convencional de TEM. O mesmo protocolo também pode ser usado para tomografia STEM de cortes plásticos, com restrições relaxadas na exposição. O protocolo deve ser considerado como um ponto de partida e não como um conjunto de regras rígidas. De fato, o poder do STEM é sua flexibilidade; não há uma maneira certa de operá-lo.
Ressaltamos que STEM, por si só, refere-se apenas à sonda digitalizada e não define a formação da imagem. O contraste depende principalmente da configuração dos detectores. Os métodos mais simples empregam detectores com simetria axial, seja um disco centrado no eixo óptico ou um anel ao seu redor. Em geral, quando a iluminação incide diretamente sobre o detector, registramos uma imagem BF onde o espécime (espalhamento de elétrons) aparece escuro; por outro lado, quando o detector coleta apenas elétrons espalhados, registramos uma imagem DF onde o espécime denso parece brilhante. Quando o hardware adequado está disponível, o SerialEM pode adquirir e gravar esses dois sinais simultaneamente. Configurações ainda mais sofisticadas estão disponíveis, variando de detectores com vários segmentos a câmeras totalmente pixeladas. A imagem com contraste de fase pode ser obtida, por exemplo, avaliando-se a diferença entre os elementos detectores fora do eixo32,33. A coleta de todo o padrão de espalhamento 2D (difração) por pixel define o método conhecido como 4D STEM34, que permite a reconstrução de múltiplos contrastes de imagem a partir dos mesmos dados originais. O STEM quadridimensional permite a pticografia eletrônica, que fornece outro meio para obter contraste de fase35.
Nós nos concentramos na modalidade STEM particular que consideramos ser mais útil para o estudo de organelas e células intactas ou cortes celulares de mícron grosso. Isso implica especificamente o uso de imagens BF com um pequeno ângulo de semiconvergência na iluminação e um ângulo de coleta relativamente grande no detector. A pequena convergência fornece uma grande profundidade de campo para que toda a amostra permaneça em foco durante toda a série de inclinação19. Na prática, com um bom estágio do microscópio, também pode eliminar a necessidade de ajuste do foco durante a aquisição. O preço é um compromisso na resolução, conforme descrito na seção 3 do protocolo. Sugerimos imagens 4k com uma sonda de ~2 nm, que com espaçamento de pixel de 1 nm atinge um campo de visão de 4 μm. No entanto, o leitor é fortemente encorajado a experimentar. A segunda consideração está na lateral do detector. Quando o disco de iluminação preenche o detector BF no eixo, o contraste de fase é suprimido e o contraste de espalhamento (amplitude) domina; Essa condição tem sido chamada de contraste incoerente de campo brilhante36. A questão é por qual fração preencher, e a resposta depende da amostra. Uma amostra muito fina mostrará melhor contraste com o detector completamente preenchido (ou seja, o ângulo de coleta correspondente ao da iluminação), mas uma amostra mais espessa espalhará toda a intensidade, deixando um sinal ruidoso com contraste fraco. Uma regra prática útil é que quanto mais espessa a amostra, maior deve ser o ângulo de corte externo do detector de BF21. O tamanho e a posição do detector são, naturalmente, fixos, de modo que o tamanho do disco de difração é ajustado usando o comprimento da câmera, conforme descrito na seção 1. Se as configurações do amplificador do detector forem tais que o sinal preencha a faixa dinâmica, mas não satura sob iluminação direta (1.12.3), então o comprimento da câmera pode ser aumentado até que uma intensidade de sinal e contraste razoáveis sejam alcançados. Mais uma vez, o leitor é encorajado a experimentar. A arte, por assim dizer, está nos ângulos.
Outro parâmetro, não discutido no protocolo, é a tensão de aceleração do microscópio. A interação dos elétrons iluminantes com o espécime será mais forte em uma tensão mais baixa. Com tudo o mais igual, podemos esperar maior contraste em tensão mais baixa. Por outro lado, é o início de múltiplos espalhamentos dentro do corpo de prova que limita a espessura do corpo de prova utilizável, de modo que uma tensão mais alta permite o uso de amostras mais espessas. Esses efeitos são bastante sutis, no entanto. Nossas experiências até o momento com acelerações de 200 kV e 300 kV são semelhantes.
Considerando o que se pode esperar de STEM em termos de resolução, isso novamente depende da amostra e da configuração do detector. Usando uma abordagem de análise de partícula única, íons metálicos sobre ferritina poderiam ser localizados por STEM de campo escuro anular com uma precisão de alguns angstrom37. Mais recentemente, a resolução subnanométrica foi obtida para amostras de vírus e proteínas usando imagens obtidas por contraste de fase diferencial integrado (iDPC) STEM32 , bem como pticografia35. Para objetos únicos em espécimes celulares espessos, e com os métodos descritos aqui, essa alta resolução não é realista. A resolução ótima é o diâmetro da sonda, que se relaciona com o ângulo de semiconvergência como descrito. Outros fatores degradarão a resolução, particularmente uma amostragem de pixel grosso para alcançar um grande campo de visão, desalinhamentos na série de inclinação e espalhamento do feixe de sonda na transmissão. As imagens se comparam bem com a tomografia de corte plástico. Com a configuração descrita aqui, por exemplo, deve ser fácil ver o núcleo oco dos microtúbulos, mas não os protofilamentos individuais.
Para resumir, os métodos STEM e o hardware estão em fase de desenvolvimento. Podemos esperar que as inovações em imagem também impactem a tomografia, levando STEM a domínios que não foram acessíveis por outras técnicas. Esperamos que uma convergência com imagens de fluorescência criogênica correlativa baseada em métodos modernos de super-resolução óptica seja especialmente frutífera. A escala de organelas, 100-1.000 nm, é um alvo ideal para esses métodos emergentes.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos extremamente gratos pelo apoio contínuo e constante do autor e mantenedor do pacote de software SerialEM, David Mastronade, e Günther Resch. P.K. foi financiado pelo Fundo Austríaco para a Ciência (FWF) através de uma bolsa Schrödinger J4449-B. Para fins de acesso aberto, os autores aplicaram uma licença pública de direitos autorais CC-BY a qualquer versão do Manuscrito Aceito pelo Autor decorrente desta submissão. M.E. e S.G.W. reconhecem o financiamento da Israel Science Foundation, grant no.1696/18, e do projeto de geminação Horizon 2020 da União Europeia, ImpaCT (grant no.857203). M.E. reconhece o financiamento do ERC no projeto CryoSTEM (subvenção n.º 101055413). M.E. é o titular da Cátedra Sam e Ayala Zacks e chefe do Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. O laboratório de M.E. se beneficiou da generosidade histórica da família Harold Perlman. Reconhecemos também o financiamento da União Europeia. Os pontos de vista e opiniões expressos são, no entanto, apenas do(s) autor(es) e não reflectem necessariamente os da União Europeia ou da Agência de Execução do Conselho Europeu de Investigação. Nem a União Europeia nem a autoridade que concede o auxílio podem ser responsabilizadas por elas.
Materials
| SerialEM | University of Colorado | Veriosn 4.0 | SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition. |
| STEM-capable transmission electron microscope | The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well. |
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