הדמיה של אברונים באתרם על ידי טומוגרפיה Cryo-STEM
Summary
טומוגרפיה Cryo-STEM מספקת אמצעי לדמיין אברונים של תאים שלמים ללא הטבעה, חתך או תכשירים פולשניים אחרים. הרזולוציה התלת-ממדית המתקבלת נמצאת כיום בטווח של ננומטרים בודדים, עם שדה ראייה של מספר מיקרומטרים ועובי נגיש בסדר גודל של 1 מיקרומטר.
Abstract
מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryo-EM) מסתמך על הדמיה של דגימות ביולוגיות או אורגניות המשובצות בתווך המימי הטבעי שלהן; מים מתמצקים לכוס (כלומר, מזוגגים) ללא התגבשות. שיטת cryo-EM נמצאת בשימוש נרחב כדי לקבוע את המבנה של מקרומולקולות ביולוגיות לאחרונה ברזולוציה כמעט אטומית. הגישה הורחבה לחקר אברונים ותאים באמצעות טומוגרפיה, אך המצב הקונבנציונלי של הדמיית EM בשידור שדה רחב סובל ממגבלה חמורה בעובי הדגימה. זה הוביל לנוהג של כרסום lamellae דק באמצעות קרן יונים ממוקדת; הרזולוציה הגבוהה מתקבלת על ידי ממוצע סובטומוגרפיה מהשחזורים, אך יחסים תלת מימדיים מחוץ לשכבה הנותרת אובדים. ניתן לעקוף את מגבלת העובי על ידי הדמיית בדיקה סרוקה, בדומה ל- EM סורק או מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. בעוד שסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (STEM) במדעי החומרים מספקת רזולוציה אטומית בתמונות בודדות, הרגישות של דגימות ביולוגיות קריוגניות לקרינת אלקטרונים דורשת שיקולים מיוחדים. פרוטוקול זה מציג הגדרה עבור קריו-טומוגרפיה באמצעות STEM. התצורה האקטואלית הבסיסית של המיקרוסקופ מתוארת עבור מערכות שניים ושלושה מעבים, בעוד אוטומציה מסופקת על ידי תוכנת SerialEM הלא מסחרית. מתוארים גם שיפורים ברכישת אצווה ויישור מתאם למפות פלואורסצנטיות שנרכשו בעבר. לדוגמה, אנו מראים שחזור של מיטוכונדריה, ומצביעים על גרגרי הממברנה הפנימית והחיצונית ועל גרגרי סידן פוספט, כמו גם על מיקרוטובולים, חוטי אקטין וריבוזומים שמסביב. טומוגרפיית Cryo-STEM מצטיינת בחשיפת התיאטרון של אברונים בציטופלסמה, ובמקרים מסוימים, אפילו את הפריפריה הגרעינית של תאים דבקים בתרבית.
Introduction
הדמיה תלת-ממדית (תלת-ממדית) של אברונים היא משימה חשובה ביותר בביולוגיה המודרנית של התא. בהתחשב בקשקשים המעורבים, החל מעשרות ננומטרים עבור שלפוחיות הפרשה ועד מיקרונים רבים עבור גרעין התא, מאתגר למצוא טכניקת מיקרוסקופיה אחת שתתאים לכל היישומים. בעוד שמיקרוסקופ פלואורסצנטי מודרני יכול להקיף את רוב הטווח במונחים של רזולוציה, רק המולקולות המסומנות מופיעות. התיאטרון הסלולרי נותר תחום מיקרוסקופ האלקטרונים. שיטות קונבנציונליות של קיבוע כימי, הטבעה פלסטיק, צביעה עם מתכות כבדות הם פולשניים מאוד, ולכן התוצאות עשויות להיות תלויות בפרטים של הכנת הדגימה. Cryo-EM, לעומת זאת, מוגבל על ידי הצורך לזגוג את התווך המימי; גבישי קרח הנוצרים מפזרים את תאורת האלקטרונים, וגורמים לתוצרי ניגוד בעלי ניגודיות גבוהה יותר מהחומר האורגני המעניין.
בעשור האחרון חלה התפשטות של טכניקות הדמיה אלקטרומגנטית שפותחו או הותאמו למחקרים תאיים1. הקפאה בלחץ גבוה בשילוב עם כרסום קרן יונים ממוקדת איטרטיבית (FIB) והדמיית פני שטח טורית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (כלומר, FIB-SEM) היא כיום השיטה המועדפת עבור דגימות גדולות2. טומוגרפיית רנטגן רכה קריוגנית (cryo-SXT) מתאימה לדגימות בגודל של מספר מיקרונים, המוגבלות על ידי אורך הספיגה האופייני של קרני הרנטגן הרכות במים 3,4,5. סולם זה כולל סוגי תאים שלמים רבים, והאופי הכמותי של ניגודיות בליעת קרני רנטגן מוסיף היבט של מדידת ריכוז6 או ספקטרוסקופיה7. בשילוב עם ממוצע תת-טומוגרפיה, טומוגרפיית אלקטרונים בשידור קריו-שידור (cryo-ET), המבוססת על מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת ניגודיות פאזה (TEM), מציעה את הרזולוציה הגבוהה ביותר עבור מקרומולקולות או קומפלקסים 8,9,10. עם זאת, נדיר שאברונים שלמים הם כל כך סדירים שניתן לחשב אותם בשלמותם. יתר על כן, המצב המקובל של TEM רחב שדה מוגבל לעובי הדגימה לכמה מאות ננומטרים על ידי שילוב של פיזור קשיח (הכרוך באיבוד אנרגיה) בדגימה וסטייה כרומטית בעדשת האובייקט המגנטי11,12. פיזור האנרגיה הגדול מכתיב את השימוש במסנן אנרגיה כדי להסיר את האובך החריג מהמיקוד שנוצר, אך הדגימה הרגישה עדיין סובלת מנזקי קרינה בעוד שאות התמונה נחלש אקספוננציאלית עם עובי הולך וגדל.
מצב ההדמיה החלופי, סריקת EM (STEM), עוקף את הצורך בסינון אנרגיה ושומר על האלקטרונים המפוזרים באופן בלתי אלסטי ליצירת תמונה, אם כי כיום ברזולוציה נמוכה יותר מאשר בטומוגרפיית TEM (איור 1). למעשה, לא נוצרת תמונה אמיתית. במקום זאת, כמו בסריקת EM, המדידות נעשות נקודה אחר נקודה, והתמונה מורכבת על ידי המחשב. ההגדלה נקבעת רק לפי גודל שלבי הסריקה מבלי לשנות את זרמי העדשה. כאשר הוא מוגדר כראוי, הטווח השימושי של עובי הדגימה עבור טומוגרפיה cryo-STEM (CSTET) יכול להגיע ל -1.5 או אפילו 2 מיקרומטר, אם כי אזור הנוחות, שבו עוצמת האות השימושית נשארת חלק משמעותי של התאורה, הוא סביב 600-900 ננומטר11,13. זה מספיק כדי לראות חלק גדול של הציטופלסמה, ולפעמים קצה של גרעין התא. בפועל, אנו מוצאים כי ויטריפיקציה בשיטה הסטנדרטית של צלילה לתוך נוזל קריוגני מטילה מגבלה חמורה יותר על עובי מאשר הדמיית STEM. מטרת מאמר וידאו זה היא להקל על שילוב CSTET בתיבת הכלים להדמיית תאים ואברונים במעבדות מחקר ומתקני מיקרוסקופיה.
האתגר הראשון הוא שפעולות מיקרוסקופ ב- CSTET עדיין אינן סטנדרטיות ליישומי מדעי החיים כפי שהיו עבור טומוגרפיית cryo-ZEM. חומרת STEM כמעט ולא (אם בכלל) הייתה ממוקדת לשוק ה-cryo-EM. עם זאת, זה משתנה עם הדור החדש ביותר של מיקרוסקופים, וכלים קיימים רבים ניתן לשדרג. STEM כטכניקה המריא והשתלט במידה רבה במדעי החומרים, שם יש גם ניצני עניין בשיטות קריוגניות ובמינון נמוך14,15. ספרות מדעי החומרים משופעת בראשי תיבות BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM וכו ‘, המוסיפים לבלבול. אנו מציעים כאן נקודת התחלה מומלצת, אשר, מניסיוננו הקולקטיבי במכון ויצמן למדע, מספקת את הפרוטוקול הכללי ביותר לתוצאות שימושיות המבוססות על הדמיית STEM בשדה בהיר (BF)16. בשום אופן זה לא ממצה או אפילו לחקור את מגוון האפשרויות, אבל זה ישמש בסיס לשיפורים נוספים. בעוד אנו מדגישים cryo-STEM, רוב הפרוטוקול רלוונטי באותה מידה עבור טומוגרפיית STEM בטמפרטורת החדר של חלקים משובצים פלסטיק.
המהות של STEM היא לסרוק את הדגימה עם גשושית אלקטרונים ממוקדת (איור 1), חרוט ההארה, ולהקליט אותות ממישור העקיפה (פיזור) בשידור, פיקסל אחר פיקסל, כדי להפיק תמונות דו-ממדיות17,18. דגימות אמורפיות, כולל רוב החומרים התאיים, ייצרו דפוס פיזור מפוזר בשידור. תצורת STEM המעשית הפשוטה ביותר היא להציב גלאי מעגלי כדי להקליט את הדיסק המרכזי (כלומר, תאורת הגשושית שתועבר ללא דגימה). הדגימה מפזרת אלקטרונים הרחק מחרוט ההארה הזה עד כדי כך שהאות פוחת. זה מייצר תמונת BF – הדגימה נראית כהה על רקע בהיר. גלאי טבעתי עשוי לשמש גם (או לחילופין) כדי לזהות את הפיזור מהדגימה מחוץ לחרוט התאורה. עם הסרת הדגימה, אין אות. כשדגימה נמצאת במקומה, עצמים נראים בהירים על רקע כהה בתמונת השדה הכהה (DF). המינוח ל-STEM (BF, שדה כהה טבעתי [ADF], שדה כהה טבעתי בזווית גבוהה [HAADF] וכו’) מתייחס בעיקר לטווחי זוויות האיסוף של הגלאים.
זווית ההתכנסות של התאורה מייצגת התאמה חיונית של STEM לטומוגרפיה תאית. כאשר העדיפות העליונה היא רזולוציה גבוהה, זווית ההתכנסות צריכה להיות גדולה ככל האפשר. (הדבר דומה למיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי; הרזולוציה נקבעת על ידי קוטר הגשושית, אשר משתנה כאורך הגל חלקי הצמצם המספרי. שים לב שאנו מתייחסים לזווית חצי זווית או חצי התכנסות עבור EM.) כאשר העדיפות היא עומק השדה, לעומת זאת, פשרה ברזולוציה מעניקה יתרון גדול, שכן הקרן הממוקדת נשארת מקבילה בערך למרחק השווה לכפול מאורך הגל חלקי חצי זווית בריבוע. באופן אידיאלי, נפח התא כולו נשאר בפוקוס19. לדוגמה, ב-300 keV, אורך הגל של האלקטרון דה-ברויי הוא 0.002 ננומטר, כך שהתכנסות של 1 mrad מניבה רזולוציה של 2 ננומטר ועומק שדה של 4 מיקרון. בתנאים אלה, טומוגרפיה יכולה להתבצע גם מבלי להתמקד בתהליך איסוף הנתונים, אלא רק פעם אחת בתחילת הרכישה. STEM קונבנציונלי בעל יכולת טומוגרפיה יכול להגיע לזווית התכנסות למחצה של 7 או 8 mrad; לכן, באופן עקרוני, אנחנו יכולים להגיע לרזולוציה בסדר גודל של 0.25 ננומטר, אבל אז עם עומק מוקד של רק 62 ננומטר. זה בבירור דק מדי עבור הדמיה תאית. מיקרוסקופים מתקדמים יותר עם שלוש עדשות מעבה מציעים התאמה רציפה של זווית ההתכנסות למחצה על פני טווח ניכר. בתצורה המסורתית יותר של שני מעבים, ההתכנסות קבועה באופן דיסקרטי על ידי צמצם המעבה (C2).
עבור דגימות חזקות המשובצות בפלסטיק, ניתן להקליט סדרת מוקדים בכל הטיה ולשלב אותן לקבלת רזולוציה גבוהה20, אך עבור דגימות קריוגניות, תקציב הקרינה מוגבל מדי. לבסוף, בשקלול היתרונות של הדמיית BF או DF, עבור דגימות עבות, יש לקחת בחשבון את ההשפעות של פיזור אלסטי מרובה בדגימה. אות BF פחות פגום על ידי פיזור מרובה ומראה רזולוציה גבוהה יותר עבור דגימות עבות 16,21.
כלל אצבע שימושי היה לקבוע זוויות איסוף גדולות פי כמה מההתכנסות. ככל שהדגימה עבה יותר, כך דיסק האיסוף צריך להיות גדול יותר. דיסק קטן מדי יספק עוצמת אות נמוכה; דיסק גדול מדי יגרום לניגודיות תמונה גרועה, מכיוון שרק הפיזור בזווית הגבוהה ביותר יתרום. זוויות האיסוף צריכות להיות מותאמות למדגם נתון. זוויות הגלאי כפונקציה של אורך המצלמה (עקיפה) חייבות להיות מכוילות באופן עצמאי. הם עשויים להיות מוצגים בנוחות על ידי תוכנת המיקרוסקופ. בפועל, פקטור של שניים עד חמישה ביחס בין האוסף לחצאי זוויות הארה, θ עד α, בהתאמה (איור 1), הוא נקודת מוצא מומלצת עבור CSTET של דגימות תאיות.
הפרוטוקול הבא מתאר פעולת טומוגרפיה STEM באמצעות תוכנת SerialEM הפופולרית לבקרת מיקרוסקופ22,23. SerialEM אינו קשור ליצרן מסוים, והוא נמצא בשימוש נרחב בטומוגרפיה TEM. רוב הפעולות בהגדרת טומוגרפיה ניתן לבצע ישירות מ TEM. אסטרטגיית SerialEM היא למדל את מערכת הסריקה כמצלמה. זה מאפשר את ההצלבה הפשוטה מ-TEM ל-STEM. יש לזכור, עם זאת, כי פרמטרים כגון הגדלה וכריכה הם מלאכותיים לחלוטין. הפרמטרים החשובים הם שדה הראייה במיקרונים, מספר הפיקסלים בשדה הראייה וזמן החשיפה. מרווח הפיקסלים, או הדגימה, הוא השדה הליניארי חלקי מספר הפיקסלים, ואילו זמן השהייה הוא מספר הפיקסלים חלקי זמן החשיפה.
התצורה המינימלית עבור STEM ו- CSTET כוללת שלוש תכונות במיקרוסקופ: מחולל סריקה, גלאי STEM ותוכנת בקרת טומוגרפיה. הפרוטוקול מתייחס למינוח של FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), אך המושגים הם גנריים. התוכנה הקניינית של TFS תוארה ב- JoVE עבור TEM24, ופעולת STEM דומה מאוד.
אנו מניחים כי המיקרוסקופ יושר מראש על ידי צוות השירות או הצוות המנוסה וכי ניתן לקרוא ליישור עמודות על ידי טעינת קובץ. התאמות קלות נקראות יישור ישיר וניתן לאחסן אותן במה שמכונה אוגרי FEG (מיקרוסקופים TFS). יישור ישיר כולל מרכז סיבוב, נקודות ציר, יישור עקיפה ופיצוי על אסטיגמציה של מעבה. יש לבצע התאמות באופן איטרטיבי. שים לב שמיקרוסקופ TFS מיישם מצבי ננו-פרוב (nP) ומיקרו-פרוב (μP) נפרדים; עבור צמצם מעבה נתון, אלה מספקים שדה ראייה צר או רחב יחסית עם תאורה מקבילה ב- TEM וקרן אלקטרונים מתכנסת פחות או יותר (ממוקדת היטב) ב- STEM, בהתאמה. יצרנים אחרים משתמשים בתוכניות שונות כדי לכסות את טווח זוויות ההתכנסות.
לפני שמתחילים, יש לבחור את שדה הראייה, L, ואת הדגימה (רוחב פיקסל), l, בהתאם למדגם הנחקר. לדוגמה, עבור l = 1 ננומטר/פיקסל, יש לבחור תמונה בגודל 4,000 x 4,000 פיקסלים שתכסה שדה ראייה בגודל 4 מיקרומטר2 . הרזולוציה תהיה, במקרה הטוב, כפולה מהדגימה המרחבית, כך ש-2 ננומטר, וקוטר הגשושית, d, אמור להתאים לכך. כיול זווית הבדיקה הוא מעבר לטווח של פרוטוקול זה, ולכן אנו מניחים כי טבלה או קריאת מסך זמין. קוטר הגשושית הוא בערך אורך גל האלקטרונים חלקי זווית ההתכנסות למחצה (ברדיאנים): d = λ/θ. אורך הגל, λ, הוא 0.002 ננומטר עבור 300 keV ו-0.0025 ננומטר עבור 200 keV אלקטרונים, כך θ של 1 mrad יספק קוטר נקודתי של 2 או 2.5 ננומטר, בהתאמה.
הפרוטוקול מוצג בתהליך של מורכבות הולכת וגוברת. המשימה הראשונה היא לייצר תמונת STEM, התלויה בתוכנת יצרן המיקרוסקופ, ולאחר מכן סדרת הטיה, שעבורה אנו משתמשים ב- SerialEM. קוראים רבים ללא ספק יכירו את SerialEM, ולכן המשימות המסובכות יותר יבואו באופן טבעי. אין צורך לעקוב אחר הנהלים בקפדנות. פיתוחים הקשורים לאוטומציה עשויים להיות מיושמים ישירות עבור STEM כמו גם עבור TEM. סביר להניח שמשתמשים מנוסים יהפכו את הפרוטוקול, החל מרישום מתאם של מפות פלואורסצנטיות והמשך בהגדרת טומוגרפיית אצווה. פרטים נוספים ניתן למצוא בספריות התיעוד וההדרכה הנרחבות עבור SerialEM עצמה, כולל מאמר שפורסם לאחרונה ב- JoVE על ההתפתחויות האחרונות באוטומציה25.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול אמור לסייע למיקרוסקופים במדעי החיים המעוניינים לקבל תצוגה תלת-ממדית של אברונים תוך-תאיים באזורים בתא שאינם נגישים לטומוגרפיית TEM קונבנציונלית. אותו פרוטוקול עשוי לשמש גם לטומוגרפיית STEM של קטעי פלסטיק, עם אילוצים מקלים על החשיפה. יש להתייחס לפרוטוקול כנקודת מוצא ולא כמערכת של כללים קשיחים. ואכן, כוחו של STEM הוא בגמישותו; אין דרך אחת נכונה להפעיל אותו.
נדגיש כי STEM, כשלעצמו, מתייחס רק לגשושית הסרוקה ואינו מגדיר את היווצרות התמונה. הניגודיות תלויה בעיקר בתצורת הגלאים. השיטות הפשוטות יותר משתמשות בגלאים בעלי סימטריה צירית, או דיסק שבמרכזו הציר האופטי או בטל המקיף אותו. באופן כללי, כאשר התאורה פוגעת ישירות בגלאי, אנו רושמים תמונת BF שבה הדגימה (פיזור אלקטרונים) נראית כהה; לעומת זאת, כאשר הגלאי אוסף רק אלקטרונים מפוזרים, אנו רושמים תמונת DF שבה הדגימה הצפופה נראית בהירה. כאשר חומרה מתאימה זמינה, SerialEM יכולה לרכוש ולהקליט את שני האותות הללו בו זמנית. תצורות מתוחכמות עוד יותר זמינות, החל מגלאים עם מקטעים מרובים ועד מצלמות מפוקסלות לחלוטין. ניתן להשיג הדמיית ניגודיות פאזה, למשל, על ידי הערכת ההבדל בין רכיבי גלאי מחוץ לציר32,33. איסוף כל תבנית הפיזור הדו-ממדית (עקיפה) לפיקסל מגדיר את השיטה הידועה בשם 4D STEM34, המאפשרת בנייה מחדש של ניגודי תמונה מרובים מאותם נתונים מקוריים. STEM ארבע-ממדי מאפשר פטיכוגרפיה של אלקטרונים, המספקת אמצעי נוסף להשגת ניגודיות פאזה35.
התמקדנו בשיטת ה-STEM המסוימת שאנו מחשיבים כשימושית ביותר לחקר אברונים ותאים שלמים או חלקי תאים בעובי מיקרון. זה כרוך במיוחד בשימוש בהדמיית BF עם זווית חצי התכנסות קטנה בתאורה וזווית איסוף גדולה יחסית בגלאי. ההתכנסות הקטנה מספקת עומק שדה גדול כך שכל הדגימה נשארת בפוקוס לאורך סדרת ההטיה19. בפועל, עם שלב מיקרוסקופ טוב, זה יכול גם לבטל את הצורך בהתאמת מיקוד במהלך הרכישה. המחיר הוא פשרה ברזולוציה, כמתואר בסעיף 3 לפרוטוקול. הצענו תמונות 4k עם בדיקה של ~2 ננומטר, אשר עם מרווח פיקסלים של 1 ננומטר מגיע לשדה ראייה של 4 מיקרומטר. עם זאת, מומלץ מאוד לקורא להתנסות. השיקול השני הוא בצד הגלאי. כאשר דיסק ההארה ממלא את גלאי BF על הציר, ניגודיות הפאזה מדוכאת וניגודיות הפיזור (משרעת) שולטת; מצב זה נקרא ניגודיות שדה בהיר לא קוהרנטית36. השאלה היא באיזה חלק למלא, והתשובה תלויה במדגם. דגימה דקה מאוד תציג את הניגודיות הטובה ביותר עם הגלאי המלא לחלוטין (כלומר, זווית האיסוף תואמת לזו של התאורה), אך דגימה עבה יותר תפזר את כל העוצמה ותשאיר אות רועש עם ניגודיות גרועה. כלל אצבע שימושי הוא שככל שהדגימה עבה יותר, כך זווית החיתוך החיצונית של גלאי BF צריכה להיותגדולה יותר. גודל הגלאי ומיקומו קבועים כמובן, ולכן גודל דיסק העקיפה מותאם באמצעות אורך המצלמה, כמתואר בסעיף 1. אם הגדרות מגבר הגלאי הן כאלה שהאות ממלא את הטווח הדינמי אך אינו רווי תחת תאורה ישירה (1.12.3), ניתן להגדיל את אורך המצלמה עד שמגיעים לעוצמת אות וניגודיות סבירים. שוב, הקורא מוזמן להתנסות. האמנות, כביכול, נמצאת בזוויות.
פרמטר נוסף, שלא נדון בפרוטוקול, הוא מתח התאוצה במיקרוסקופ. האינטראקציה של האלקטרונים המאירים עם הדגימה תהיה חזקה יותר במתח נמוך יותר. עם כל השאר שווה, אנו יכולים לצפות לניגודיות גבוהה יותר במתח נמוך יותר. מצד שני, תחילתו של פיזור מרובה בתוך הדגימה היא המגבילה את עובי הדגימה השמישה, ולכן מתח גבוה יותר מאפשר שימוש בדגימות עבות יותר. עם זאת, השפעות אלה עדינות למדי. החוויות שלנו עד כה עם תאוצות של 200 קילו-וולט ו-300 קילו-וולט דומות.
בהתחשב במה שניתן לצפות מ- STEM במונחים של רזולוציה, זה שוב תלוי בדגימה ובתצורת הגלאי. באמצעות גישה של ניתוח חלקיקים יחידים, יוני מתכת על פריטין יכולים להיות ממוקמים על ידי שדה כהה טבעתי STEM לדיוק של כמה אנגסטרום37. לאחרונה, הושגה רזולוציה תת-ננומטרית עבור דגימות וירוסים וחלבונים באמצעות תמונות שהתקבלו על ידי ניגודיות פאזה דיפרנציאלית משולבת (iDPC) STEM32 וכן פטיכוגרפיה35. עבור עצמים ייחודיים בדגימות תאיות עבות, ובשיטות המתוארות כאן, רזולוציה כה גבוהה אינה מציאותית. הרזולוציה האופטימלית היא קוטר הבדיקה, המתייחס לזווית ההתכנסות למחצה כמתואר. גורמים אחרים יפגעו ברזולוציה, במיוחד דגימת פיקסלים גסה כדי להגיע לשדה ראייה גדול, חוסר התאמה בסדרת ההטיה, והתפשטות קרן הגשושית בשידור. תמונות להשוות היטב עם טומוגרפיה סעיף פלסטיק. עם ההתקנה המתוארת כאן, למשל, זה צריך להיות קל לראות את הליבה החלולה של microtubules, אבל לא protofilaments בודדים.
לסיכום, שיטות STEM וחומרה נמצאות שתיהן בשלב פיתוח. אנו יכולים לצפות כי חידושים בהדמיה ישפיעו גם על טומוגרפיה, ויובילו את STEM לתחומים שלא היו נגישים על ידי טכניקות אחרות. אנו צופים כי התכנסות עם הדמיה פלואורסצנטית קריוגנית מתאמת המבוססת על שיטות אופטיות מודרניות ברזולוציית על תהיה פורייה במיוחד. קנה המידה של אברונים, 100-1,000 ננומטר, הוא יעד אידיאלי עבור שיטות מתפתחות אלה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה על התמיכה המתמשכת והמתמדת של המחבר והמתחזק של חבילת התוכנה SerialEM, דיוויד מסטרונדה וגינתר רש. P.K. מומן על ידי קרן המדע האוסטרית (FWF) באמצעות מלגת שרדינגר J4449-B. לצורך גישה פתוחה, המחברים החילו רישיון זכויות יוצרים ציבורי CC-BY על כל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר הנובעת מהגשה זו. M.E. ו-SGW מודים על מימון מהקרן הלאומית למדע, מענק מס’ 1696/18, ומפרויקט התאומות Horizon 2020 של האיחוד האירופי, ImpaCT (מענק מס’ 857203). M.E. מכיר במימון מה-ERC בפרויקט CryoSTEM (מענק מס’ 101055413). M.E. הוא ראש הקתדרה הפרופסורית ע”ש סם ואיילה זקס וראש מרכז אירווינג וצ’רנה מוסקוביץ’ לדימות ננו וביו-ננו. המעבדה של M.E. נהנתה מהנדיבות ההיסטורית של משפחת הרולד פרלמן. אנו מכירים גם במימון של האיחוד האירופי. עם זאת, הדעות המובעות הן של המחבר(ים) בלבד ואינן משקפות בהכרח את אלה של האיחוד האירופי או של הסוכנות המבצעת של מועצת המחקר האירופית. לא האיחוד האירופי ולא הרשות המעניקה יכולים לשאת באחריות להם.
Materials
| SerialEM | University of Colorado | Veriosn 4.0 | SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition. |
| STEM-capable transmission electron microscope | The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well. |
References
- Elbaum, M. Expanding horizons of cryo-tomography to larger volumes. Current Opinion in Microbiology. 43, 155-161 (2018).
- Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).
- Do, M., Isaacson, S. A., McDermott, G., Le Gros, M. A., Larabell, C. A. Imaging and characterizing cells using tomography. Archives of Biochemistry and Biophysics. 581, 111-121 (2015).
- Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. The cellular landscape by cryo soft X-ray tomography. Biophysical Reviews. 11 (4), 611-619 (2019).
- Kapishnikov, S., et al. Oriented nucleation of hemozoin at the digestive vacuole membrane in Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11188-11193 (2012).
- Kapishnikov, S., et al. Unraveling heme detoxification in the malaria parasite by in situ correlative X-ray fluorescence microscopy and soft X-ray tomography. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Sviben, S., et al. A vacuole-like compartment concentrates a disordered calcium phase in a key coccolithophorid alga. Nature Communications. 7, 11228 (2016).
- Wan, W., Briggs, J. A. Cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Methods in Enzymology. , 329-367 (2016).
- Zhang, P. Advances in cryo-electron tomography and subtomogram averaging and classification. Current Opinion in Structural Biology. 58, 249-258 (2019).
- Bäuerlein, F. J. B., Baumeister, W. Towards visual proteomics at high resolution. Journal of Molecular Biology. 433 (20), 167187 (2021).
- Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. Toward compositional contrast by cryo-STEM. Accounts of Chemical Research. 54 (19), 3621-3631 (2021).
- Elbaum, M., Wolf, S. G., Houben, L. Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells. MRS Bulletin. 41 (7), 542-548 (2016).
- Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells. Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
- Houben, L., Weissman, H., Wolf, S. G., Rybtchinski, B. A mechanism of ferritin crystallization revealed by cryo-STEM tomography. Nature. 579 (7800), 540-543 (2020).
- Li, Y., Huang, W., Li, Y., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. ACS Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
- Hohmann-Marriott, M. F., et al. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nature Methods. 6 (10), 729-731 (2009).
- Engel, A. Scanning transmission electron microscopy: biological applications. Advances in Imaging and Electron Physics. 159, 357-386 (2009).
- Wolf, S. G., Elbaum, M. CryoSTEM tomography in biology. Methods in Cell Biology. 152, 197-215 (2019).
- Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition-A comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
- Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
- Rez, P., Larsen, T., Elbaum, M. Exploring the theoretical basis and limitations of cryo-STEM tomography for thick biological specimens. Journal of Structural Biology. 196 (3), 466-478 (2016).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. Cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging. Journal of Visualized Experiments. (185), e63923 (2022).
- Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition. Journal of Visualized Experiments. (169), e62383 (2021).
- O’Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, J. R., Mastronarde, D. Large-scale electron tomography of cells using SerialEM and IMOD. Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).
- Zheng, S., et al. AreTOMO: An integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction. Journal of Structural Biology. (6), 100068 (2022).
- Seifer, S., Elbaum, M. ClusterAlign: A fiducial tracking and tilt series alignment tool for thick sample tomography. Biological Imaging. 2, 7 (2022).
- Waugh, B., et al. Three-dimensional deconvolution processing for STEM cryotomography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (44), 27374-27380 (2020).
- Kirchenbuechler, D., et al. Cryo-STEM tomography of intact vitrified fibroblasts. AIMS Biophysics. 2 (3), 259-273 (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Lazić, I., et al. Single-particle cryo-EM structures from iDPC-STEM at near-atomic resolution. Nature Methods. 19 (9), 1126-1136 (2022).
- Seifer, S., Houben, L., Elbaum, M. Flexible STEM with simultaneous phase and depth contrast. Microscopy and Microanalysis. , 1-12 (2021).
- Ophus, C. Four-dimensional scanning transmission electron microscopy (4D-STEM): from scanning nanodiffraction to ptychography and beyond. Microscopy and Microanalysis. 25 (3), 563-582 (2019).
- Zhou, L., et al. Low-dose phase retrieval of biological specimens using cryo-electron ptychography. Nature Communications. 11 (1), 2773 (2020).
- Nellist, P. D. The principles of STEM imaging. Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging and Analysis. , 91-115 (2011).
- Elad, N., Bellapadrona, G., Houben, L., Sagi, I., Elbaum, M. Detection of isolated protein-bound metal ions by single-particle cryo-STEM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (42), 11139-11144 (2017).
