Visualisierung von Organellen in situ mittels Kryo-STEM-Tomographie
Summary
Die Kryo-STEM-Tomographie bietet eine Möglichkeit, Organellen intakter Zellen ohne Einbettung, Schnitt oder andere invasive Präparate sichtbar zu machen. Die erzielte 3D-Auflösung liegt derzeit im Bereich von wenigen Nanometern, mit einem Sichtfeld von mehreren Mikrometern und einer zugänglichen Dicke in der Größenordnung von 1 μm.
Abstract
Die kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) beruht auf der Bildgebung biologischer oder organischer Proben, die in ihr natives wässriges Medium eingebettet sind. Wasser wird ohne Kristallisation zu einem Glas verfestigt (d. h. verglast). Die Kryo-EM-Methode wird häufig verwendet, um die Struktur biologischer Makromoleküle in jüngster Zeit mit einer nahezu atomaren Auflösung zu bestimmen. Der Ansatz wurde auf die Untersuchung von Organellen und Zellen mittels Tomographie ausgeweitet, aber die konventionelle Methode der Weitfeld-Transmissions-EM-Bildgebung weist eine starke Einschränkung in der Probendicke auf. Dies hat dazu geführt, dass dünne Lamellen mit einem fokussierten Ionenstrahl gefräst werden. Die hohe Auflösung wird durch Subtomogramm-Mittelung aus den Rekonstruktionen erreicht, aber dreidimensionale Beziehungen außerhalb der verbleibenden Schicht gehen verloren. Die Dickenbegrenzung kann durch gescannte Sondenbildgebung umgangen werden, ähnlich wie beim Raster-EM oder dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. Während die Rastertransmissionselektronenmikroskopie (STEM) in den Materialwissenschaften eine atomare Auflösung in Einzelbildern liefert, erfordert die Empfindlichkeit kryogener biologischer Proben gegenüber Elektronenbestrahlung besondere Überlegungen. Dieses Protokoll stellt einen Aufbau für die Kryotomographie mit STEM dar. Die grundsätzliche topische Konfiguration des Mikroskops wird sowohl für Zwei- als auch für Drei-Kondensor-Systeme beschrieben, während die Automatisierung durch die nicht-kommerzielle SerialEM-Software erfolgt. Verbesserungen bei der Batch-Erfassung und der korrelativen Ausrichtung auf zuvor erfasste Fluoreszenzkarten werden ebenfalls beschrieben. Als Beispiel zeigen wir die Rekonstruktion eines Mitochondriums, wobei wir auf die innere und äußere Membran und die Calciumphosphat-Granula sowie auf die umgebenden Mikrotubuli, Aktinfilamente und Ribosomen hinweisen. Die Kryo-STEM-Tomographie zeichnet sich dadurch aus, dass sie das Theater der Organellen im Zytoplasma und in einigen Fällen sogar die Kernperipherie der adhärenten Zellen in Kultur aufdeckt.
Introduction
Die dreidimensionale (3D) Visualisierung von Organellen ist eine überragende Aufgabe in der modernen Zellbiologie. Angesichts der Skalen, die von Dutzenden von Nanometern für sekretorische Vesikel bis zu vielen Mikrometern für den Zellkern reichen, ist es schwierig, eine einzige Mikroskopietechnik zu finden, die für alle Anwendungen geeignet ist. Während die moderne Fluoreszenzmikroskopie einen Großteil des Bereichs in Bezug auf die Auflösung abdecken kann, erscheinen nur die markierten Moleküle. Das zelluläre Theater bleibt das Reich der Elektronenmikroskopie. Herkömmliche Methoden der chemischen Fixierung, der plastischen Einbettung und der Färbung mit Schwermetallen sind stark invasiv, so dass die Ergebnisse von den Details der Probenvorbereitung abhängen können. Die Kryo-EM hingegen ist durch die Notwendigkeit eingeschränkt, das wässrige Medium zu verglasen; Eiskristalle, die sich bilden, beugen die Elektronenbeleuchtung und verursachen Kontrastartefakte mit höherem Kontrast als das interessierende organische Material.
In den letzten zehn Jahren hat sich die Zahl der EM-Bildgebungstechniken, die für zelluläre Studien entwickelt oder angepasst wurden, stark verbreitet1. Das Hochdruckgefrieren in Kombination mit iterativem fokussiertem Ionenstrahlfräsen (FIB) und serieller Oberflächenbildgebung mit dem Rasterelektronenmikroskop (d. h. FIB-REM) ist derzeit die Methode der Wahl für große Proben2. Die kryogene weiche Röntgentomographie (Kryo-SXT) eignet sich für Proben mit einer Größe von mehreren Mikrometern, begrenzt durch die charakteristische Absorptionslänge der weichen Röntgenstrahlen in Wasser 3,4,5. Diese Skala umfasst viele intakte Zelltypen, und die quantitative Natur des Röntgenabsorptionskontrasts fügt einen Aspekt der Konzentrationsmessung6 oder Spektroskopie7 hinzu. In Kombination mit der Subtomogramm-Mittelung bietet die Kryo-Transmissionselektronentomographie (Kryo-ET), die auf der Phasenkontrast-Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) basiert, die höchste Auflösung für Makromoleküle oder -komplexe 8,9,10. Es ist jedoch selten, dass intakte Organellen so regelmäßig sind, dass sie im Ganzen gemittelt werden können. Darüber hinaus ist der konventionelle Modus der Weitfeld-TEM für die Probendicke auf einige hundert Nanometer begrenzt, und zwar durch die Kombination von inelastischer Streuung (mit Energieverlust) in der Probe und chromatischer Aberration in der magnetischen Objektivlinse11,12. Die große Energieverteilung erfordert die Verwendung eines Energiefilters, um den resultierenden unscharfen Dunst zu entfernen, aber die empfindliche Probe erleidet immer noch Strahlungsschäden, während das Bildsignal mit zunehmender Dicke exponentiell schwächer wird.
Der alternative Bildgebungsmodus, Scanning Transmission EM (STEM), umgeht die Notwendigkeit der Energiefilterung und behält die inelastisch gestreuten Elektronen für die Bilderzeugung zurück, wenn auch derzeit mit einer geringeren Auflösung als bei der TEM-Tomographie (Abbildung 1). Tatsächlich entsteht kein wirkliches Bild. Stattdessen werden wie bei einem scannenden EM Punkt für Punkt Messungen durchgeführt und das Bild vom Computer zusammengesetzt. Die Vergrößerung wird nur durch die Größe der Scanschritte bestimmt, ohne die Objektivströme zu verändern. Bei richtiger Konfiguration kann der nutzbare Bereich der Probendicke für die Kryo-STEM-Tomographie (CSTET) 1,5 oder sogar 2 μm erreichen, obwohl die Komfortzone, in der die Nutzsignalintensität einen signifikanten Bruchteil der Beleuchtung ausmacht, bei etwa 600-900 nm liegt11,13. Dies reicht aus, um einen großen Teil des Zytoplasmas und gelegentlich einen Rand des Zellkerns zu sehen. In der Praxis stellen wir fest, dass die Vitrifikation mit der Standardmethode des Eintauchens in eine kryogene Flüssigkeit eine strengere Beschränkung der Dicke darstellt als die STEM-Bildgebung. Das Ziel dieses Videoartikels ist es, die Integration von CSTET in den Werkzeugkasten für die Bildgebung von Zellen und Organellen in Forschungslabors und Mikroskopieeinrichtungen zu erleichtern.
Die erste Herausforderung besteht darin, dass die Mikroskopoperationen im CSTET für Life-Science-Anwendungen noch nicht so standardisiert sind wie für die Kryo-TEM-Tomographie. STEM-Hardware wurde selten (wenn überhaupt) auf den Kryo-EM-Markt ausgerichtet. Dies ändert sich jedoch mit der neuesten Generation von Mikroskopen, und viele bestehende Werkzeuge können nachgerüstet werden. MINT als Technik hat sich in den Materialwissenschaften durchgesetzt, wo auch das Interesse an kryogenen und niedrig dosierten Methoden aufkeimt14,15. Die materialwissenschaftliche Literatur ist reich an Akronymen BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM usw., die zur Verwirrung beitragen. Wir bieten hier einen empfohlenen Ausgangspunkt, der nach unserer gemeinsamen Erfahrung am Weizmann Institute of Science das allgemeinste Protokoll für brauchbare Ergebnisse auf der Grundlage der Hellfeld-STEM-Bildgebung (BF) bietet16. Es erschöpft oder lotet die Bandbreite der Möglichkeiten keineswegs aus, sondern dient als Grundlage für weitere Erweiterungen. Während wir den Schwerpunkt auf Kryo-STEM legen, ist der größte Teil des Protokolls gleichermaßen relevant für die Raumtemperatur-STEM-Tomographie von in Kunststoff eingebetteten Abschnitten.
Das Wesen von STEM besteht darin, die Probe mit einer fokussierten Elektronensonde (Abbildung 1), dem Beleuchtungskegel, abzutasten und Signale aus der Beugungsebene (Streuung) in der Transmission Pixel für Pixel aufzuzeichnen, um 2D-Bilder zu erzeugen17,18. Amorphe Proben, einschließlich der meisten zellulären Materialien, erzeugen bei der Übertragung ein diffuses Streumuster. Die einfachste praktische STEM-Konfiguration besteht darin, einen kreisförmigen Detektor zu platzieren, um die zentrale Scheibe (d. h. die Sondenbeleuchtung, die ohne Probe übertragen würde) aufzuzeichnen. Die Probe streut Elektronen von diesem Beleuchtungskegel so weit weg, dass das Signal abnimmt. Dadurch entsteht ein BF-Bild – die Probe erscheint dunkel auf einem hellen Hintergrund. Ein ringförmiger Detektor kann auch (oder stattdessen) verwendet werden, um die Streuung der Probe außerhalb des Beleuchtungskegels zu detektieren. Wenn die Probe entfernt wird, gibt es kein Signal. Wenn eine Probe an Ort und Stelle ist, erscheinen Objekte im Dunkelfeldbild (DF) hell auf dunklem Hintergrund. Die Nomenklatur für STEM (BF, ringförmiges Dunkelfeld [ADF], hochwinkliges ringförmiges Dunkelfeld [HAADF] usw.) bezieht sich hauptsächlich auf die Bereiche der Sammelwinkel für die Detektoren.
Der Konvergenzwinkel der Beleuchtung stellt eine wesentliche Anpassung der STEM an die zelluläre Tomographie dar. Wenn eine hohe Auflösung oberste Priorität hat, sollte der Konvergenzwinkel so groß wie möglich sein. (Dies ist vergleichbar mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie; die Auflösung wird durch den Sondendurchmesser bestimmt, der als Wellenlänge geteilt durch die numerische Apertur skaliert. Beachten Sie, dass wir uns auf den Halbwinkel- oder Halbkonvergenzwinkel für EM beziehen.) Wenn die Schärfentiefe im Vordergrund steht, bietet ein Kompromiss bei der Auflösung hingegen einen großen Vorteil, da der fokussierte Strahl über eine Entfernung, die dem Doppelten der Wellenlänge geteilt durch den Halbwinkel im Quadrat entspricht, ungefähr parallel bleibt. Im Idealfall bleibt das gesamte Zellvolumen im Fokus19. Bei 300 keV beträgt die Elektronen-deBroglie-Wellenlänge beispielsweise 0,002 nm, so dass eine Konvergenz von 1 mrad eine Auflösung von 2 nm und eine Schärfentiefe von 4 Mikrometern ergibt. Unter diesen Bedingungen kann die Tomographie auch ohne Fokussierung während des Datenerfassungsprozesses durchgeführt werden, sondern nur einmal zu Beginn der Erfassung. Ein herkömmliches, tomographiefähiges STEM kann einen Semikonvergenzwinkel von 7 oder 8 mrad erreichen; Daher könnten wir prinzipiell eine Auflösung in der Größenordnung von 0,25 nm erreichen, dann aber mit einer Brenntiefe von nur 62 nm. Das ist eindeutig zu dünn für die zelluläre Bildgebung. Fortschrittlichere Mikroskope mit drei Kondensorlinsen bieten eine stufenlose Einstellung des Semikonvergenzwinkels über einen beträchtlichen Bereich. Bei der traditionelleren Konfiguration mit zwei Kondensatoren wird die Konvergenz diskret durch die Kondensoröffnung (C2) festgelegt.
Für robuste, in Kunststoff eingebettete Proben kann man bei jeder Neigung eine Fokusreihe aufzeichnen und sie für eine hohe Auflösung20 kombinieren, aber für kryogene Proben ist das Strahlungsbudget zu stark eingeschränkt. Schließlich sollte man bei der Abwägung der Vorteile der BF- oder DF-Bildgebung für dicke Proben die Auswirkungen der mehrfachen elastischen Streuung in der Probe berücksichtigen. Das BF-Signal wird durch Mehrfachstreuung weniger verfälscht und zeigt eine höhere Auflösung für dicke Proben16,21.
Eine nützliche Faustregel war, Sammelwinkel festzulegen, die um ein Vielfaches größer sind als die Konvergenz. Je dicker die Probe, desto größer sollte die Auffangscheibe sein. Eine zu kleine Scheibe führt zu einer geringen Signalintensität. Eine zu große Scheibe führt zu einem schlechten Bildkontrast, da nur die Streuung mit dem höchsten Winkel dazu beiträgt. Die Sammelwinkel sollten für eine bestimmte Probe optimiert werden. Die Detektorwinkel in Abhängigkeit von der (Beugungs-)Kameralänge müssen unabhängig voneinander kalibriert werden. Sie können bequem von der Mikroskop-Software angezeigt werden. In der Praxis ist ein Faktor von zwei bis fünf im Verhältnis von Sammel- zu Beleuchtungshalbwinkeln, θ bzw. α (Abbildung 1), ein empfohlener Ausgangspunkt für das CSTET zellulärer Proben.
Das folgende Protokoll beschreibt den STEM-Tomographie-Betrieb mit der beliebten SerialEM-Software zur Mikroskopsteuerung22,23. SerialEM ist nicht an einen bestimmten Hersteller gebunden und wird häufig in der TEM-Tomographie eingesetzt. Die meisten Vorgänge beim Einrichten der Tomographie können direkt aus TEM übernommen werden. Die Strategie von SerialEM besteht darin, das Scansystem als Kamera zu modellieren. Dies ermöglicht den einfachen Übergang von TEM zu STEM. Man sollte jedoch bedenken, dass Parameter wie Vergrößerung und Binning völlig künstlich sind. Wichtige Parameter sind das Sichtfeld in Mikrometern, die Anzahl der Pixel im Sichtfeld und die Belichtungszeit. Der Pixelabstand oder das Sampling ist das lineare Feld geteilt durch die Anzahl der Pixel, während die Verweilzeit die Anzahl der Pixel geteilt durch die Belichtungszeit ist.
Die Mindestkonfiguration für MINT und CSTET umfasst drei Funktionen des Mikroskops: einen Scan-Generator, einen STEM-Detektor und eine Tomographie-Steuerungssoftware. Das Protokoll bezieht sich auf die Nomenklatur von FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), aber die Konzepte sind generisch. Die proprietäre Software von TFS wurde in JoVE für TEM24 beschrieben, und die STEM-Bedienung ist sehr ähnlich.
Wir gehen davon aus, dass das Mikroskop vorab durch das Serviceteam oder erfahrenes Personal ausgerichtet wurde und eine Säulenausrichtung durch Laden einer Datei aufgerufen werden kann. Kleinere Anpassungen werden als direkte Ausrichtungen bezeichnet und können in sogenannten FEG-Registern (TFS-Mikroskopen) gespeichert werden. Zu den direkten Ausrichtungen gehören Rotationsmittelpunkt, Drehpunkte, Beugungsausrichtung und Kompensation von Kondensator-Astigmatismus. Anpassungen müssen iterativ durchgeführt werden. Beachten Sie, dass TFS-Mikroskope unterschiedliche Nanosonden- (nP) und Mikrosondenmodi (μP) implementieren. Für eine gegebene Kondensoröffnung bieten diese ein relativ enges oder weites Sichtfeld mit paralleler Beleuchtung in TEM bzw. einem mehr oder weniger konvergenten (eng fokussierten) Elektronenstrahl in STEM. Andere Hersteller verwenden andere Schemata, um den Bereich der Konvergenzwinkel abzudecken.
Bevor Sie beginnen, sollten das Sichtfeld L und die Abtastung (Pixelbreite) l in Abhängigkeit von der untersuchten Probe ausgewählt werden. Beispielsweise sollte für l = 1 nm/Pixel ein Bild mit 4.000 x 4.000 Pixeln gewählt werden, das ein Sichtfeld von 4 μm2 abdeckt. Die Auflösung wird bestenfalls doppelt so hoch sein wie die räumliche Abtastung, also 2 nm, und der Sondendurchmesser d sollte damit übereinstimmen. Die Kalibrierung des Sondenwinkels würde den Rahmen dieses Protokolls sprengen, daher gehen wir davon aus, dass eine Tabelle oder ein Bildschirmmesswert verfügbar ist. Der Sondendurchmesser entspricht in etwa der Elektronenwellenlänge dividiert durch den Halbkonvergenzwinkel (im Bogenmaß): d = λ/θ. Die Wellenlänge λ beträgt 0,002 nm für 300 keV und 0,0025 nm für 200 keV-Elektronen, so dass θ von 1 mrad einen Spotdurchmesser von 2 bzw. 2,5 nm ergibt.
Das Protokoll wird in einer Abfolge von zunehmender Komplexität präsentiert. Die erste Aufgabe besteht darin, ein STEM-Bild zu erstellen, das von der Software des Mikroskopherstellers abhängt, und dann eine Tilt-Serie, für die wir SerialEM verwenden. Viele Leser werden zweifellos mit SerialEM vertraut sein, so dass die komplizierteren Aufgaben von selbst kommen. Es besteht keine Notwendigkeit, die Verfahren strikt zu befolgen. Entwicklungen im Bereich der Automatisierung können sowohl für MINT als auch für TEM direkt umgesetzt werden. Erfahrene Anwender werden das Protokoll wahrscheinlich invertieren, beginnend mit der korrelativen Registrierung von Fluoreszenzkarten und der weiteren Einrichtung der Batch-Tomographie. Weitere Details finden Sie in der umfangreichen Dokumentation und den Tutorial-Bibliotheken für SerialEM selbst, einschließlich eines kürzlich erschienenen JoVE-Artikels über die neuesten Entwicklungen in der Automatisierung25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll soll biowissenschaftlichen Mikroskopikern helfen, die daran interessiert sind, eine 3D-Ansicht von intrazellulären Organellen in Regionen der Zelle zu erhalten, die für die konventionelle TEM-Tomographie nicht zugänglich sind. Das gleiche Protokoll kann auch für die STEM-Tomographie von Kunststoffschnitten verwendet werden, wobei die Belichtungsbeschränkungen gelockert werden. Das Protokoll sollte als Ausgangspunkt und nicht als eine Reihe harter Regeln betrachtet werden. In der Tat liegt die Stärke von MINT in seiner Flexibilität; Es gibt nicht den einen richtigen Weg, es zu bedienen.
Wir betonen, dass sich STEM per se nur auf die gescannte Sonde bezieht und nicht die Bildentstehung definiert. Der Kontrast hängt in erster Linie von der Konfiguration der Detektoren ab. Die einfacheren Methoden verwenden Detektoren mit axialer Symmetrie, entweder eine Scheibe, die auf der optischen Achse zentriert ist, oder einen Ring, der sie umgibt. Im Allgemeinen nehmen wir, wenn die Beleuchtung direkt auf den Detektor trifft, ein BF-Bild auf, bei dem die (elektronenstreuende) Probe dunkel erscheint; Umgekehrt, wenn der Detektor nur gestreute Elektronen sammelt, nehmen wir ein DF-Bild auf, in dem die dichte Probe hell erscheint. Wenn geeignete Hardware verfügbar ist, kann SerialEM diese beiden Signale gleichzeitig erfassen und aufzeichnen. Es stehen noch ausgefeiltere Konfigurationen zur Verfügung, die von Detektoren mit mehreren Segmenten bis hin zu vollständig pixeligen Kameras reichen. Eine Phasenkontrastbildgebung kann beispielsweise durch die Auswertung der Differenz zwischen außeraxialen Detektorelementen32,33 erreicht werden. Die Erfassung des gesamten 2D-Streumusters (Beugung) pro Pixel definiert die als 4D STEM34 bekannte Methode, die die Rekonstruktion mehrerer Bildkontraste aus denselben Originaldaten ermöglicht. Das vierdimensionale STEM ermöglicht die Elektronenptychographie, die eine weitere Möglichkeit bietet, den Phasenkontrast35 zu erhalten.
Wir haben uns auf die spezielle STEM-Modalität konzentriert, die wir für die Untersuchung von Organellen und intakten Zellen oder mikrometerdicken Zellabschnitten für am nützlichsten halten. Dies beinhaltet insbesondere den Einsatz von BF-Bildgebung mit einem kleinen Semikonvergenzwinkel in der Beleuchtung und einem relativ großen Sammelwinkel am Detektor. Die kleine Konvergenz sorgt für eine große Schärfentiefe, so dass die gesamte Probe während der gesamten Neigungsreihe19 scharf bleibt. In der Praxis kann mit einem guten Mikroskoptisch auch die Notwendigkeit einer Fokuseinstellung während der Aufnahme entfallen. Der Preis ist ein Kompromiss bei der Auflösung, wie in Abschnitt 3 des Protokolls beschrieben. Wir haben 4k-Bilder mit einer Sonde von ~2 nm vorgeschlagen, die bei 1 nm Pixelabstand ein Sichtfeld von 4 μm erreicht. Der Leser wird jedoch nachdrücklich zum Experimentieren aufgefordert. Die zweite Überlegung betrifft die Seite des Detektors. Wenn die Beleuchtungsscheibe den BF-Detektor auf der Achse nicht ausfüllt, wird der Phasenkontrast unterdrückt und der Streukontrast (Amplitudenkontrast) dominiert. Dieser Zustand wurde als inkohärenter Hellfeldkontrast36 bezeichnet. Die Frage ist, mit welchem Anteil untergefüllt werden soll, und die Antwort hängt von der Stichprobe ab. Eine sehr dünne Probe zeigt den besten Kontrast, wenn der Detektor vollständig gefüllt ist (d. h. der Erfassungswinkel entspricht dem der Beleuchtung), aber eine dickere Probe streut die gesamte Intensität weg und hinterlässt ein verrauschtes Signal mit schlechtem Kontrast. Eine nützliche Faustregel lautet: Je dicker die Probe, desto größer sollte der äußere Grenzwinkel des BF-Detektors21 sein. Die Größe und Position des Detektors sind natürlich festgelegt, so dass die Größe der Beugungsscheibe anhand der Kameralänge angepasst wird, wie in Abschnitt 1 beschrieben. Wenn der Detektorverstärker so eingestellt ist, dass das Signal den Dynamikbereich ausfüllt, aber bei direkter Beleuchtung nicht sättigt (1.12.3), kann die Kameralänge erhöht werden, bis eine angemessene Signalintensität und ein angemessener Kontrast erreicht sind. Auch hier wird der Leser zum Experimentieren angeregt. Die Kunst liegt sozusagen in den Winkeln.
Ein weiterer Parameter, der im Protokoll nicht behandelt wird, ist die Beschleunigungsspannung des Mikroskops. Die Wechselwirkung der Leuchtelektronen mit der Probe ist bei einer niedrigeren Spannung stärker. Wenn alles andere gleich ist, können wir einen höheren Kontrast bei niedrigerer Spannung erwarten. Andererseits ist es das Einsetzen von Mehrfachstreuung innerhalb der Probe, das die nutzbare Probendicke begrenzt, so dass eine höhere Spannung die Verwendung dickerer Proben ermöglicht. Diese Effekte sind jedoch eher subtil. Ähnlich sind unsere bisherigen Erfahrungen mit 200 kV und 300 kV Beschleunigungen.
Wenn man bedenkt, was von STEM in Bezug auf die Auflösung zu erwarten ist, hängt dies wiederum von der Probe und der Detektorkonfiguration ab. Mit Hilfe eines Einzelpartikelanalyseansatzes konnten Metallionen auf Ferritin mittels ringförmigem Dunkelfeld-STEM mit einer Genauigkeit von wenigen Ångström lokalisiert werden37. In jüngerer Zeit wurde eine Sub-Nanometer-Auflösung für Virus- und Proteinproben mit Hilfe von Bildern erreicht, die mit integriertem differentiellem Phasenkontrast (iDPC) STEM32 sowie Ptychographie35 gewonnen wurden. Für einzigartige Objekte in dickzelligen Proben und mit den hier beschriebenen Methoden ist eine so hohe Auflösung nicht realistisch. Die optimale Auflösung ist der Sondendurchmesser, der sich auf den beschriebenen Semikonvergenzwinkel bezieht. Andere Faktoren verschlechtern die Auflösung, insbesondere eine grobe Pixelabtastung, um ein großes Sichtfeld zu erreichen, Fehlausrichtungen in der Neigungsreihe und die Ausbreitung des Sondenstrahls bei der Übertragung. Die Bilder lassen sich gut mit der Kunststoffschnitttomographie vergleichen. Mit dem hier beschriebenen Aufbau sollte es zum Beispiel gut sein, den hohlen Kern der Mikrotubuli zu erkennen, nicht aber die einzelnen Protofilamente.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich sowohl MINT-Methoden als auch Hardware in einer Entwicklungsphase befinden. Wir können davon ausgehen, dass sich Innovationen in der Bildgebung auch auf die Tomographie auswirken und MINT in Bereiche führen werden, die mit anderen Techniken bisher nicht zugänglich waren. Wir gehen davon aus, dass eine Konvergenz mit korrelativer kryogener Fluoreszenzbildgebung auf Basis moderner optischer Superauflösungsmethoden besonders fruchtbar sein wird. Die Skala der Organellen von 100-1.000 nm ist ein ideales Ziel für diese neuen Methoden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind sehr dankbar für die kontinuierliche und konstante Unterstützung durch den Autor und Betreuer des SerialEM-Softwarepakets, David Mastronade, und Günther Resch. P.K. wurde vom Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung (FWF) durch ein Schrödinger-Stipendium J4449-B gefördert. Zum Zwecke des Open Access haben die Autoren eine CC-BY-Lizenz für das öffentliche Urheberrecht auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergibt. M.E. und S.G.W. würdigen die Förderung durch die Israel Science Foundation, Grant Nr. 1696/18, und durch das Horizon 2020 Twinning-Projekt der Europäischen Union, ImpaCT (Grant Nr. 857203). M.E. bedankt sich für die Förderung durch den ERC im Projekt CryoSTEM (Grant Nr. 101055413). M.E. ist Inhaber des Sam and Ayala Zacks Professorial Chair und Leiter des Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. Das Labor von M.E. hat von der historischen Großzügigkeit der Familie Harold Perlman profitiert. Wir bedanken uns auch für die Förderung durch die Europäische Union. Die geäußerten Ansichten und Meinungen sind jedoch nur die des Autors/der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die der Europäischen Union oder der Exekutivagentur des Europäischen Forschungsrats wider. Weder die Europäische Union noch die Bewilligungsbehörde können dafür verantwortlich gemacht werden.
Materials
| SerialEM | University of Colorado | Veriosn 4.0 | SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition. |
| STEM-capable transmission electron microscope | The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well. |
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