JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

تصور العضيات في الموقع عن طريق التصوير المقطعي بالتبريد STEM

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65052
, , ,
1Department of Chemical and Biological Physics,Weizmann Institute of Sciences, 2Department of Chemical Research Support,Weizmann Institute of Sciences

Summary

يوفر التصوير المقطعي Cryo-STEM وسيلة لتصور عضيات الخلايا السليمة دون تضمين أو تقسيم أو مستحضرات غازية أخرى. دقة 3D التي تم الحصول عليها حاليا في نطاق بضعة نانومتر ، مع مجال رؤية يبلغ عدة ميكرومتر وسمك يمكن الوصول إليه في حدود 1 ميكرومتر.

Abstract

يعتمد المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) على تصوير العينات البيولوجية أو العضوية المضمنة في وسطها المائي الأصلي. يتم ترسيخ الماء في كوب (أي مزجج) دون تبلور. تستخدم طريقة cryo-EM على نطاق واسع لتحديد بنية الجزيئات البيولوجية الكبيرة مؤخرا بدقة شبه ذرية. تم توسيع هذا النهج ليشمل دراسة العضيات والخلايا باستخدام التصوير المقطعي ، لكن الوضع التقليدي للتصوير الكهرومغناطيسي واسع المجال يعاني من قيود شديدة في سمك العينة. وقد أدى ذلك إلى ممارسة طحن الصفائح الرقيقة باستخدام حزمة أيونية مركزة. يتم الحصول على الدقة العالية عن طريق متوسط التصوير المقطعي الفرعي من عمليات إعادة البناء ، ولكن يتم فقد العلاقات ثلاثية الأبعاد خارج الطبقة المتبقية. يمكن التحايل على تحديد السماكة عن طريق تصوير المسبار الممسوح ضوئيا ، على غرار المسح EM أو مجهر المسح بالليزر متحد البؤر. بينما يوفر المسح المجهري الإلكتروني (STEM) في علوم المواد دقة ذرية في صور مفردة ، فإن حساسية العينات البيولوجية المبردة للإشعاع الإلكتروني تتطلب اعتبارات خاصة. يقدم هذا البروتوكول إعدادا للتصوير المقطعي بالتبريد باستخدام العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات. يتم وصف التكوين الموضعي الأساسي للمجهر لكل من أنظمة المكثف الثنائية والثلاثة ، بينما يتم توفير الأتمتة بواسطة برنامج SerialEM غير التجاري. كما تم وصف التحسينات الخاصة بالحصول على الدفعات والمحاذاة المرتبطة بخرائط التألق المكتسبة سابقا. على سبيل المثال، نعرض إعادة بناء الميتوكوندريا، مع الإشارة إلى الغشاء الداخلي والخارجي وحبيبات فوسفات الكالسيوم، وكذلك الأنابيب الدقيقة المحيطة، وخيوط الأكتين، والريبوسومات. يتفوق التصوير المقطعي Cryo-STEM في الكشف عن مسرح العضيات في السيتوبلازم ، وفي بعض الحالات ، حتى المحيط النووي للخلايا الملتصقة في الثقافة.

Introduction

التصور ثلاثي الأبعاد (3D) للعضيات هو مهمة قصوى في بيولوجيا الخلية الحديثة. بالنظر إلى المقاييس المعنية ، والتي تتراوح من عشرات النانومتر للحويصلات الإفرازية إلى العديد من الميكرونات لنواة الخلية ، من الصعب العثور على تقنية مجهرية واحدة تناسب جميع التطبيقات. في حين أن الفحص المجهري الفلوري الحديث يمكن أن يمتد على جزء كبير من النطاق من حيث الدقة ، تظهر الجزيئات المسماة فقط. لا يزال المسرح الخلوي عالم المجهر الإلكتروني. الطرق التقليدية للتثبيت الكيميائي ، وتضمين البلاستيك ، وتلطيخ المعادن الثقيلة غازية بشدة ، لذلك قد تعتمد النتائج على تفاصيل تحضير العينة. من ناحية أخرى ، فإن Cryo-EM مقيد بالحاجة إلى تزجيج الوسط المائي. بلورات الجليد التي تشكل انحراف إضاءة الإلكترون ، مما تسبب في آثار تباين أعلى من المواد العضوية ذات الأهمية.

شهد العقد الماضي انتشار تقنيات التصوير الكهرومغناطيسي التي تم تطويرها أو تكييفها للدراسات الخلوية1. يعد التجميد عالي الضغط جنبا إلى جنب مع طحن الحزمة الأيونية المركزة التكرارية (FIB) والتصوير السطحي التسلسلي باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (أي FIB-SEM) حاليا الطريقة المفضلة للعينات الكبيرة2. التصوير المقطعي بالأشعة السينية اللينة المبردة (cryo-SXT) مناسب لعينات من عدة ميكرونات في الحجم ، محدودة بطول الامتصاص المميز للأشعة السينية اللينة في الماء3،4،5. يتضمن هذا المقياس العديد من أنواع الخلايا السليمة ، وتضيف الطبيعة الكمية لتباين امتصاص الأشعة السينية جانبا من قياس التركيز6 أو التحليل الطيفي7. عند دمجه مع متوسط التصوير المقطعي الفرعي ، يوفر التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد (cryo-ET) ، استنادا إلى المجهر الإلكتروني لانتقال تباين الطور (TEM) ، أعلى دقة للجزيئات الكبيرة أو المجمعات8،9،10. ومع ذلك ، فمن النادر أن تكون العضيات السليمة منتظمة لدرجة أنه يمكن حساب متوسطها بالكامل. علاوة على ذلك ، فإن الوضع التقليدي ل TEM واسع المجال يقتصر على سمك العينة إلى بضع مئات من النانومتر من خلال مزيج من التشتت غير المرن (الذي ينطوي على فقدان الطاقة) في العينة والانحراف اللوني في عدسة الهدف المغناطيسي11,12. يفرض انتشار الطاقة الكبير استخدام مرشح الطاقة لإزالة الضباب الناتج خارج التركيز ، لكن العينة الحساسة لا تزال تعاني من أضرار إشعاعية بينما تصبح إشارة الصورة أضعف أضعافا مضاعفة مع زيادة السماكة.

يتحايل وضع التصوير البديل ، مسح EM (STEM) ، على الحاجة إلى تصفية الطاقة ويحتفظ بالإلكترونات المتناثرة بشكل غير مرن لتشكيل الصورة ، وإن كان ذلك حاليا بدقة أقل من التصوير المقطعي TEM (الشكل 1). في الواقع ، لا يتم تشكيل صورة حقيقية. بدلا من ذلك ، كما هو الحال في المسح الضوئي EM ، يتم إجراء القياسات نقطة تلو الأخرى ، ويتم تجميع الصورة بواسطة الكمبيوتر. يتم تحديد التكبير فقط من خلال حجم خطوات المسح الضوئي دون تغيير تيارات العدسة. عند تكوينها بشكل صحيح ، يمكن أن يصل النطاق المفيد لسمك العينة للتصوير المقطعي بالتبريد (CSTET) إلى 1.5 أو حتى 2 ميكرومتر ، على الرغم من أن منطقة الراحة ، حيث تظل شدة الإشارة المفيدة جزءا كبيرا من الإضاءة ، حوالي 600-900 نانومتر11,13. هذا يكفي لرؤية جزء كبير من السيتوبلازم ، وأحيانا حافة نواة الخلية. في الممارسة العملية ، نجد أن التزجيج بالطريقة القياسية للغطس في السائل المبرد يفرض قيدا أكثر شدة على السماكة من تصوير العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات. الهدف من مقالة الفيديو هذه هو تسهيل دمج CSTET في صندوق الأدوات لتصوير الخلايا والعضيات في مختبرات الأبحاث ومرافق الفحص المجهري.

التحدي الأول هو أن عمليات المجهر في CSTET لم يتم توحيدها بعد لتطبيقات علوم الحياة بالطريقة التي كانت عليها في التصوير المقطعي بالتبريد. نادرا ما تم استهداف أجهزة العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات (إن وجدت) لسوق cryo-EM. ومع ذلك ، فإن هذا يتغير مع أحدث جيل من المجاهر ، ويمكن تعديل العديد من الأدوات الموجودة. لقد انطلقت العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات كتقنية واستحوذت إلى حد كبير على علوم المواد ، حيث يوجد أيضا اهتمام ناشئ بالطرق المبردة والجرعات المنخفضة14,15. تزخر أدبيات علوم المواد بالاختصارات BF-STEM ، ADF-STEM ، HAADF-STEM ، 4D-STEM ، DPC-STEM ، وما إلى ذلك ، مما يزيد من الارتباك. نقدم هنا نقطة انطلاق موصى بها ، في تجربتنا الجماعية في معهد وايزمان للعلوم ، توفر البروتوكول الأكثر عمومية للنتائج المفيدة القائمة على تصوير STEM للمجال الساطع (BF)16. لا يستنفد أو حتى يستكشف بأي حال من الأحوال مجموعة الاحتمالات ، ولكنه سيكون بمثابة أساس لمزيد من التحسينات. بينما نؤكد على cryo-STEM ، فإن معظم البروتوكول وثيق الصلة بنفس القدر بالتصوير المقطعي STEM بدرجة حرارة الغرفة للأقسام المدمجة بالبلاستيك.

يتمثل جوهر STEM في مسح العينة باستخدام مسبار إلكتروني مركز (الشكل 1) ، ومخروط الإضاءة ، وتسجيل الإشارات من مستوى الحيود (التشتت) في الإرسال ، بكسل تلو الآخر ، لإنتاج صور ثنائية الأبعاد17,18. ستنتج العينات غير المتبلورة ، بما في ذلك معظم المواد الخلوية ، نمط تشتت منتشر في الإرسال. أبسط تكوين عملي ل STEM هو وضع كاشف دائري لتسجيل القرص المركزي (أي إضاءة المسبار التي سيتم إرسالها بدون عينة). تشتت العينة الإلكترونات بعيدا عن مخروط الإضاءة هذا إلى الحد الذي تقل فيه الإشارة. ينتج عن هذا صورة BF – تظهر العينة مظلمة على خلفية ساطعة. يمكن أيضا استخدام كاشف حلقي (أو بدلا من ذلك) للكشف عن التشتت من العينة خارج مخروط الإضاءة. مع إزالة العينة ، لا توجد إشارة. عندما تكون العينة في مكانها ، تظهر الكائنات ساطعة على خلفية داكنة في صورة الحقل المظلم (DF). تشير تسمية STEM (BF ، الحقل المظلم الحلقي [ADF] ، الحقل المظلم الحلقي عالي الزاوية [HAADF] ، إلخ) بشكل أساسي إلى نطاقات زوايا التجميع للكاشفات.

تمثل زاوية التقارب للإضاءة تكيفا أساسيا ل STEM مع التصوير المقطعي الخلوي. عندما تكون الأولوية القصوى هي الدقة العالية ، يجب أن تكون زاوية التقارب كبيرة قدر الإمكان. (هذا مشابه للفحص المجهري بالليزر متحد البؤر ؛ يتم تحديد الدقة من خلال قطر المسبار ، والذي يقيس الطول الموجي مقسوما على الفتحة العددية. لاحظ أننا نشير إلى زاوية نصف الزاوية أو زاوية شبه التقارب ل EM.) عندما تكون الأولوية هي عمق المجال ، من ناحية أخرى ، فإن الحل الوسط في الدقة يوفر ميزة كبيرة ، حيث تظل الحزمة المركزة موازية تقريبا لمسافة تساوي ضعف الطول الموجي مقسوما على نصف زاوية مربعة. من الناحية المثالية ، يظل حجم الخلية بالكامل في التركيز19. على سبيل المثال ، عند 300 keV ، يكون الطول الموجي للإلكترون deBroglie 0.002 nm ، لذا فإن التقارب بمقدار 1 مراد ينتج عنه دقة 2 نانومتر وعمق مجال 4 ميكرون. في ظل هذه الظروف ، يمكن إجراء التصوير المقطعي حتى بدون التركيز أثناء عملية جمع البيانات ، ولكن مرة واحدة فقط في بداية الاستحواذ. يمكن أن يصل STEM التقليدي القادر على التصوير المقطعي إلى زاوية شبه تقارب تبلغ 7 أو 8 مراد. لذلك ، من حيث المبدأ ، يمكننا التوصل إلى حل في حدود 0.25 نانومتر ، ولكن بعد ذلك بعمق بؤري يبلغ 62 نانومتر فقط. من الواضح أن هذا رقيق جدا للتصوير الخلوي. توفر المجاهر الأكثر تقدما المزودة بثلاث عدسات مكثفة ضبطا مستمرا لزاوية شبه التقارب على نطاق واسع. مع التكوين الأكثر تقليدية للمكثفين ، يتم تثبيت التقارب بشكل منفصل بواسطة فتحة المكثف (C2).

بالنسبة للعينات القوية المضمنة بالبلاستيك ، يمكن للمرء تسجيل سلسلة بؤرية عند كل ميل ودمجها للحصول على دقةعالية 20 ، ولكن بالنسبة للعينات المبردة ، فإن ميزانية الإشعاع مقيدة بشدة. أخيرا ، عند تقييم مزايا التصوير BF أو DF ، بالنسبة للعينات السميكة ، ينبغي للمرء أن يأخذ في الاعتبار تأثيرات التشتت المرن المتعدد في العينة. إشارة BF أقل تلفا بسبب التشتت المتعدد وتظهر دقة أعلى للعينات السميكة16,21.

كانت القاعدة الأساسية المفيدة هي تحديد زوايا تجميع أكبر بعدة مرات من التقارب. كلما كانت العينة أكثر سمكا ، يجب أن يكون قرص التجميع أكبر. سيوفر القرص الصغير جدا كثافة إشارة منخفضة ؛ سيؤدي القرص الكبير جدا إلى تباين ضعيف للصورة ، حيث سيساهم التشتت الأعلى زاوية فقط. يجب تحسين زوايا التجميع لعينة معينة. يجب معايرة زوايا الكاشف كدالة لطول الكاميرا (الحيود) بشكل مستقل. يمكن عرضها بسهولة بواسطة برنامج المجهر. في الممارسة العملية ، يعد عامل من اثنين إلى خمسة في نسبة المجموعة إلى نصف زوايا الإضاءة ، θ إلى α ، على التوالي (الشكل 1) ، نقطة انطلاق موصى بها ل CSTET للعينات الخلوية.

يصف البروتوكول التالي عملية التصوير المقطعي STEM باستخدام برنامج SerialEM الشهير للتحكم المجهري22,23. لا يرتبط SerialEM بمصنع معين ، ويستخدم على نطاق واسع في التصوير المقطعي TEM. يمكن نقل معظم العمليات في الإعداد للتصوير المقطعي مباشرة من TEM. تتمثل إستراتيجية SerialEM في نمذجة نظام المسح ككاميرا. يتيح ذلك التقاطع البسيط من TEM إلى STEM. ومع ذلك ، يجب على المرء أن يضع في اعتباره أن المعلمات مثل التكبير والتجميع مصطنعة تماما. المعلمات المهمة هي مجال الرؤية بالميكرونات ، وعدد وحدات البكسل في مجال الرؤية ، ووقت التعرض. تباعد البكسل ، أو أخذ العينات ، هو الحقل الخطي مقسوما على عدد وحدات البكسل ، بينما وقت السكون هو عدد وحدات البكسل مقسوما على وقت التعرض.

يتضمن الحد الأدنى من التكوين ل STEM و CSTET ثلاث ميزات على المجهر: مولد المسح الضوئي ، وكاشف STEM ، وبرنامج التحكم في التصوير المقطعي. يشير البروتوكول إلى تسمية FEI / Thermo Fisher Scientific (TFS) ، لكن المفاهيم عامة. تم وصف البرنامج الاحتكاري ل TFS في JoVE ل TEM24 ، وعملية STEM متشابهة جدا.

نفترض أن المجهر قد تمت محاذاته مسبقا من قبل فريق الخدمة أو الموظفين ذوي الخبرة وأنه يمكن استدعاء محاذاة العمود عن طريق تحميل ملف. تسمى التعديلات الطفيفة بالمحاذاة المباشرة ويمكن تخزينها في ما يسمى بسجلات FEG (مجاهر TFS). تشمل المحاذاة المباشرة مركز الدوران والنقاط المحورية ومحاذاة الحيود والتعويض عن الاستجماتيزم المكثف. يجب إجراء التعديلات بشكل متكرر. لاحظ أن مجاهر TFS تنفذ أوضاع مسبار نانوي متميز (nP) ومسبار دقيق (μP) ؛ بالنسبة لفتحة مكثف معينة ، توفر هذه مجال رؤية ضيق أو واسع نسبيا مع إضاءة متوازية في TEM وحزمة إلكترون متقاربة إلى حد ما (مركزة بإحكام) في STEM ، على التوالي. تستخدم الشركات المصنعة الأخرى مخططات مختلفة لتغطية نطاق زوايا التقارب.

قبل البدء ، يجب اختيار مجال الرؤية ، L ، وأخذ العينات (عرض البكسل) ، l ، اعتمادا على العينة قيد الدراسة. على سبيل المثال ، بالنسبة إلى l = 1 نانومتر / بكسل ، يجب اختيار صورة 4,000 × 4,000 بكسل تغطي مجال رؤية 4 ميكرومتر2 . ستكون الدقة ، في أحسن الأحوال ، ضعف أخذ العينات المكانية ، لذلك 2 نانومتر ، وقطر المسبار ، d ، يجب أن يتطابق مع ذلك. معايرة زاوية المسبار خارج نطاق هذا البروتوكول ، لذلك نفترض أن قراءة الجدول أو الشاشة متاحة. قطر المسبار هو تقريبا الطول الموجي للإلكترون مقسوما على زاوية شبه التقارب (بالراديان): d = λ / θ. الطول الموجي ، λ ، هو 0.002 نانومتر ل 300 كيلو فولت و 0.0025 نانومتر لإلكترونات 200 كيلو فولت ، لذا فإن θ من 1 مراد سيوفر قطر بقعة يبلغ 2 أو 2.5 نانومتر ، على التوالي.

يتم تقديم البروتوكول في تقدم متزايد التعقيد. تتمثل المهمة الأولى في إنتاج صورة STEM ، والتي تعتمد على برنامج الشركة المصنعة للمجهر ، ثم سلسلة إمالة ، نستخدم SerialEM من أجلها. سيكون العديد من القراء بلا شك على دراية ب SerialEM ، وبالتالي فإن المهام الأكثر تعقيدا ستأتي بشكل طبيعي. ليست هناك حاجة لاتباع الإجراءات بدقة. يمكن تنفيذ التطورات المتعلقة بالأتمتة مباشرة ل STEM وكذلك ل TEM. من المحتمل أن يقوم المستخدمون المتمرسون بعكس البروتوكول ، بدءا من التسجيل المترابط لخرائط التألق والاستمرار في إعداد التصوير المقطعي الدفعي. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل في الوثائق الشاملة والمكتبات التعليمية ل SerialEM نفسها ، بما في ذلك مقالة JoVE الأخيرة حول أحدث التطورات فيالأتمتة 25.

Protocol

1. إعداد العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات المحاذاة الأولية: قم بتحميل ملف محاذاة العمود، ثم افتح صمامات العمود. في حالة استخدام حامل تبريد جانبي ، افتح Cryo-shield. ابدأ في وضع TEM. يجب أن يظهر الشعاع على الشاشة. إذا لم يكن كذلك ، فقم بخفض التكبير. أحضر المجهر إلى التركيز المركزي عن طريق الضغط على الزر الموجود على لوحة التحكم. اضبط حجم البقعة على قيمة مناسبة (على سبيل المثال ، 6) لتصور شاشة الفلورسنت ، إما مباشرة أو باستخدام الكاميرا المدمجة (حسب طراز المجهر). اضبط المجهر على وضع STEM وتحقق من أن التركيز يستخدم عدسات المكثف (الشدة) بدلا من الهدف. اضبط التركيز المركزي. بعد ذلك ، اخرج من وضع الحيود لإجراء التعديلات الأولية. تأكد من عدم إفراغ الشعاع. قلل التكبير حتى يظهر الشعاع على الشاشة. اضبط إزاحة الشعاع إلى المركز وقم بزيادة التكبير بخطوات تصل إلى حوالي 70 كيلو × مع إبقاء الشعاع في المركز. أدخل فتحة المكثف المطلوبة ، عادة 50 ميكرومتر. تحقق من توسيط فتحة العدسة. عند تدوير مقبض التركيز البؤري قليلا ذهابا وإيابا ، يجب أن تتمدد البقعة وتتقلص ولكنها تظل في مكانها ، كما لو أن الطائرة تقطع ساعة رملية عمودية وهمية. إذا لم يتم توسيط الفتحة ، فستتحول الإضاءة بشكل جانبي ، كما لو كانت الساعة الرملية مائلة. أحضر الشعاع إلى التركيز واضغط على تركيز قائمة الشدة (إن وجد) في علامة تبويب المحاذاة ، أو عد إلى التركيز المركزي كما في 1.2. أعد ضبط موضع الشعاع على المركز. اضبط مركز الدوران. أدر عجلة خطوة التركيز البؤري إلى الحد الأدنى أو خطوة واحدة أعلاه ، بحيث ينبض الشعاع برفق ، وتأكد من بقائه ثابتا أثناء تحرك التركيز لأعلى ولأسفل. حدد النقاط المحورية واجمع النقطتين معا مع تعديلات X و Y.ملاحظة: إذا تم تركيب لوحة طور على جهاز TFS ، فيجب استخدام ضبط X فقط. قم بإلغاء تركيز الحزمة قليلا ، واضبط وصمات المكثف لجعل القرص مستديرا. الذهاب صعودا وهبوطا من خلال التركيز على التحسين ؛ يجب ألا يكون هناك ميل للاستطالة في اتجاه واحد أو آخر عند تمرير التركيز. تطبيع العدسات. بعد ذلك ، قم بزيادة التكبير تدريجيا إلى حوالي 240 كيلو × أثناء استخدام إزاحة الحزمة للحفاظ على توسيط البقعة ، وكرر تعديلات مركز الدوران والنقطة المحورية (الخطوات 1.6-1.8). العودة إلى وضع الحيود. يجب أن يظهر الشعاع كقرص موحد على شاشة الفلورسنت. يتحكم طول الكاميرا (CL) الآن بشكل فعال في المسافة البصرية إلى الكاشف ، كما هو الحال في علم البلورات بالأشعة السينية. قم بتغييره وشاهد القرص ينقبض ويكبر ، كما لو أن موقع الشاشة سيتحرك نحو العينة أو بعيدا عنها. يمثل هذا المخروط إضاءة BF.ملاحظة: لكل CL ، هناك محاذاة حيود يجب تعديلها من أجل إحضار الحزمة المسقطة إلى المحور المركزي. عادة ليست هناك حاجة لتنقيحها جميعا ، فقط واحد (أو قليل) لاستخدامها في الكشف. قم بتشغيل وضع STEM بتكبير عال.إذا كان كاشف BF STEM متاحا ، فابدأ بذلك. أحضر المسرح إلى منطقة بها فتحة فارغة واضبط محاذاة الحيود لتوسيط الحزمة باستخدام CL المطلوب. تم تجهيز العديد من المجاهر فقط بكاشف HAADF. هناك خدعة لاستخدام هذا كاشف BF. أولا ، اسحب الكاشف ، وقم بتوسيط الحزمة على النحو الوارد أعلاه في المحاذاة المباشرة ، وأدخل فتحة موضوعية ، عادة ما تكون فتحة صغيرة مثل 20 ميكرومتر ، واضبط موضعها لإحاطة الحزمة بشكل موحد. (أسهل طريقة للقيام بذلك هي عن طريق إدخال عينة أو شبكة اختبار لرؤية هالة حول الإضاءة). بعد ذلك ، استخدم محاذاة الحيود لتحريك الحزمة من المحور إلى منطقة الكاشف. أدخل الكاشف وسحبه أثناء مشاهدة الشعاع على الشاشة للتأكد من أن الشعاع محجوب بواسطة الكاشف. ابدأ المسح الضوئي في برنامج المجهر واضبط إعدادات السطوع والتباين (B / C) بحيث تكون الإشارة قريبة من 0 عندما تكون الحزمة فارغة ، وقريبة من التشبع عندما تسقط الإضاءة الكاملة على الكاشف. استخدم عرض النطاق للمساعدة. قد تقترن الإعدادات بطرق غير متوقعة ، لذلك يجب تكرار الضبط عدة مرات. أعد المجهر إلى تكبير منخفض نسبيا في سجل التكبير العالي (وضع SA) ، دون الانتقال إلى وضع الماج المنخفض (LM). لاحظ الشاشة الحالية للرجوع إليها لاحقا (انظر الخطوة 3.1.1). يمكن تغيير التيار باستخدام عدسة البندقية وإعدادات حجم البقعة ، كما هو الحال في TEM ، مع زيادة الأرقام المقابلة للتيار المنخفض. في هذه المرحلة ، احفظ سجل FEG لتسهيل العودة إلى القيم القياسية.ملاحظة: يمكن للمنشأة إعداد مجموعة افتراضية من سجلات FEG بحيث يمكن للمستخدمين البدء من تكوين العمل. 2. وضع العينة في وضع LM TEM ، تأكد من أن الشبكة ليست معتمة. ابحث عن مربع شبكة لإجراء التعديلات الأولية. من الملائم العثور على بعض المساحة الفارغة أو الحفرة أو مربع الشبكة الممزقة. سجل مواقف المرحلة من أجل العودة إليها بسهولة. أحضر العينة إلى ارتفاع مركزي. هناك عدة طرق للقيام بذلك. على سبيل المثال ، استخدم تذبذب المسرح لإمالة الشبكة أثناء تحريك ارتفاع العينة على طول المحور Z حتى تتوقف الصورة عن التحول الجانبي. بدلا من ذلك ، حدد بعض الميزات على شاشة العرض وقم بإمالة المسرح إلى 30 درجة. ستتحرك الميزة بشكل جانبي. اضبط ارتفاع العينة لإعادتها إلى الموضع الأصلي. قم بزيادة التكبير أو إمالة المسرح للتحسين. العودة إلى الميل 0 درجة. ارجع إلى وضع STEM وأدخل كاشف STEM. انتقل إلى وضع التكبير العالي الأدنى (SA). تأكد من ملاحظة صورة على شاشة الكمبيوتر. المسح الضوئي بسرعة لتجنب التعرض غير الضروري ؛ 1 ميكرو ثانية / بكسل أو أقل سيكون نموذجيا. لاحظ أن الصورة قد تظهر مشوهة عند الحد الأيسر عندما يكون المسح سريعا للغاية (انظر الشكل 2). اضغط على التركيز البؤري المركزي ، وقم بزيادة التكبير ، وتحسين التركيز أثناء المسح الضوئي. من الملائم استخدام عدسة التركيز التي يوفرها برنامج المجهر. ضبط الاستجماتيزم المكثف. يمكن القيام بذلك بدقة أكبر عن طريق طريقة Ronchigram. باستخدام الحزمة فوق منطقة عينة رفيعة ، ركز على النقطة التي تنفجر فيها الحزمة المرسلة ، بين صور الظل للعينة على كلا الجانبين. بعد ذلك ، اضبط ضبط المكثف لجعل القرص المركزي دائريا. هذا يتطلب بعض الممارسة ، خاصة بالنسبة للعينات المبردة.ملاحظة: البديل هو العثور على بعض جزيئات الذهب (غالبا ما تستخدم كعلامات إيمانية للمحاذاة في التصوير المقطعي). زيادة التكبير والتركيز لأعلى ولأسفل ، وضبط الاستجماتيزم بحيث تظل الجسيمات مستديرة دون استطالة في أي من الاتجاهين. انتقل إلى وضع LM STEM واستمر في المسح للعثور على منطقة مثيرة للاهتمام. أعد ضبط إعدادات الكاشف B / C إذا لزم الأمر (الخطوة 1.13.3) ، تقريبا في هذه المرحلة. 3. تسجيل صورة تقدير الجرعة للتسجيل. كقاعدة عامة ، استهدف 100-150 e- / Å2 للتصوير المقطعي بأكمله. تحقق من تحمل الجرعة لكل عينة. يمثل التيار بالأمبير (A) مقسوما على الشحنة لكل إلكترون عدد e- / s ، مضروبا في وقت التعرض ، T ، بالثواني ومقسوما على مجال الرؤية في Å2. للراحة ، قم بالتعبير عن التيار بالنانوأمبير (كما هو مقروء من الشاشة) ، وعرض مجال الرؤية بالميكرومتر ، ووقت تعرض الإطار بالثواني ، مع العوامل المناسبة:يجب ضرب هذا الرقم في عدد الإمالات للحصول على إجمالي التعرض في السلسلة. على سبيل المثال ، مع تيار I = 0.04 nA ، حقل L = 4 μm ، ووقت تعرض 12 s ، نحصل على 1.9 e- / Å 2 لكل إمالة ، أو حوالي 110 e- / Å2 لسلسلة من 61 إسقاطا. أعد المسرح إلى حفرة (أو اسحب الشبكة) واضبط تيار الشعاع باستخدام حجم البقعة و / أو إعدادات عدسة البندقية للوصول إلى تيار الشاشة المطلوب. إذا كان القياس يقرأ 0 ، فأدخل فتحة C2 أكبر لزيادة التيار. بعد ذلك ، قم بالتصحيح بقسمة القياس على مربع نسبة الأقطار ، وأخيرا العودة إلى الفتحة الأصغر. قم بتحسين إعدادات B / C وفقا للخطوة 1.13.3 ، وأخيرا أعد المسرح إلى منطقة الاهتمام وأعد فحص المحاذاة المباشرة والاستجماتيزم في ظل ظروف التصوير. الحصول على صورة اختبار. 4. التصوير المقطعي باستخدام SerialEM بدء تشغيل خادم SerialEM على الكمبيوتر المجهري (يتم تثبيت SerialEM عادة على واحد مختلف). ثم افتح SerialEM. يظهر STEM في SerialEM مثل الكاميرا ، بنفس الواجهة. تأكد من أن الاتصالات تعمل بشكل مناسب للإعداد. على سبيل المثال ، يجب أن تعرض علامة تبويب المجهر التكبير الصحيح. إذا لم يفلح ذلك ، فتوقف هنا واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. ابحث عن علامة تبويب الكاميرا والبرنامج النصي وافتح الإعداد. تأكد من تحديد كاميرا STEM ، واختر لكل وضع أوقات تجميع ومدة مناسبة. تأكد من ظهور الكاشف (أو أجهزة الكشف) المناسبة في مربع “القنوات المراد الحصول عليها” في أسفل اليسار. اضغط على اكتساب في الجزء السفلي للاختبار. مرة أخرى ، لا تستمر إذا لم يحدث شيء ، أو إذا لم يتم إلغاء الشعاع. توقف وتحقق من الاتصالات.ملاحظة: يتم استخدام الأوضاع بطريقة مشابهة للتصوير المقطعي TEM. Binning هو حيلة للتوافق مع TEM. المعلمة المهمة هي عدد البكسل. تستخدم أنظمة المجهر المختلفة binning مختلفة للوصول إلى نفس العدد.يجب أن يكون العرض والبحث عمليات مسح سريعة مع عدد قليل نسبيا من وحدات البكسل (على سبيل المثال ، 512 × 512 بكسل بمعدل 1 ثانية). التركيز بشكل عام هو منطقة صغيرة مع تسجيل سريع. وبالتالي ، في وضع الجرعة المنخفضة ، اختر التركيز ليكون في تكبير مختلف عن وضع التسجيل ، والذي يمكن أن يساعد في الدقة. اترك حجم البقعة دون تغيير. بالنسبة لوضع التسجيل ، استخدم المعلمات المختارة أعلاه في تقدير التعرض. إذا كان ذلك متاحا، حدد أيضا التركيز الديناميكي، الذي يصحح التركيز البؤري سطرا في صورة مائلة. للراحة لاحقا، اختر تجميع المعاينة ليكون مطابقا ل عرض (راجع التحسين #1، الخطوة 5.5). لا يلزم أن يكون حجم الصورة (عدد وحدات البكسل) هو نفسه. استخدم الوضع التجريبي للحفاظ على توسيط منطقة السجل أثناء الاستحواذ. يمكن أن يكون مشابها ل View ، ولكن احرص على عدم وجود تشوهات مسح واضحة على الجانب الأيسر من الإطار (انظر الشكل 2 للحصول على مثال). مرة أخرى ، في وضع الجرعة المنخفضة ، يمكن أن يكون للتجربة تكبير مختلف عن وضع التسجيل. استخدم وضع المونتاج على الفور لفحص الشبكة. يجب أن تكون كثيفة البكسل بما يكفي للعثور على مجالات الاهتمام ؛ التوصية: 512 × 512 أو 1024 × 1024. تأكد من أن الصورة جيدة ، مع نطاق ديناميكي لائق (يظهر في عناصر التحكم في عرض الصورة) ، حيث يتم استخدام هذا الوضع للعثور على مناطق العينة. احفظ ملف الإعدادات بحيث يتم الاحتفاظ بهذه الخيارات كإعداد افتراضي للجلسة التالية (والتي قد تحدث قريبا في حالة تعطل البرنامج). اختبر معايرة إزاحة الصورة وإزاحة المرحلة. في وضع microprobe (أو nanoprobe) ، انقر فوق عرض الصورة ، وقم بالمرور فوقها بالماوس ، واضغط مع الاستمرار على الزر لأسفل ، واسحب قطريا بمقدار ربع مجال الرؤية تقريبا. ثم خذ طريقة عرض أخرى. يجب أن تتداخل الصور تماما. كرر عن طريق السحب مرة أخرى مع الاستمرار في الضغط على مفتاح Shift (لفرض حركة مرحلة). يجب أن تتداخل الصور جيدا ، على الرغم من أنها ربما تكون أقل دقة. انتقل إلى وضع LM واختبر تحول المرحلة. إذا فشلت هذه الاختبارات، فتوقف واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. الباقي لن ينجح. قم بعمل خريطة LM للمونتاج للشبكة بأكملها. يمكن القيام بذلك في TEM أيضا.انتقل إلى وضع STEM الأقل تكبيرا حيث لا يتم حظر الصورة بواسطة فتحات العدسة ، عادة حوالي 185x. انقر فوق قائمة المتصفح > فتح. ثم انقر فوق قائمة المتصفح > التنقل. > الخيارات إلغاء تحديد تحويل الخرائط إلى بايت. حدد قائمة Navigator > المونتاج والشبكات > إعداد المونتاج الكامل. سيتم فتح قائمة. الخيارات التي يجب التحقق منها هي: نقل المرحلة بدلا من إزاحة الصورة ، وإنشاء خريطة من كل مونتاج إذا كان Navigator مفتوحا ، واستخدام تعيين المونتاج ، وليس معلمات التسجيل. يجب أن تكون شبكة الصورة تقريبا 6 × 6 أو 7 × 7. ابحث عن المساحة الإجمالية المراد تسجيلها. إذا كانت هناك حاجة إلى عدد كبير جدا من الصور ، فقد لا تتم قراءة التكبير بشكل صحيح من المجهر (الشكل 3). توقف وتحقق. لبدء اكتساب المونتاج، اضغط على ابدأ في عناصر التحكم في المونتاج أو المونتاج ضمن الكاميرا والبرنامج النصي. سيتم فتح قائمة أخرى لاختيار معلمات الملف: mrc ، وتخزينها كأعداد صحيحة ، وفي مربع حوار آخر ، اختر اسم الملف للتخزين. تأكد من تخزين البيانات في منطقة البيانات المناسبة وليس ضمن إعدادات المستخدم الخاصة ب SerialEM. يوصى بعدم تخزين البيانات الكبيرة على القرص C حيث يوجد النظام. عند الانتهاء من الاستحواذ ، سيظهر المونتاج في النافذة الرئيسية (الشكل 4). يمكن للمرء الآن التنقل حول الشبكة باستخدام العلامة والنقاط الموجودة على Navigator ، تماما كما هو الحال في TEM. أعد فحص تصحيح الاستجماتيزم. عادة ، يكفي مسح منطقة صغيرة بسرعة وضبطها مع التركيز بحيث تظل الميزات الشبيهة بالنقاط مثل جسيمات الذهب النانوية مستديرة تماما أثناء مرورها داخل وخارج التركيز (كما هو الحال في SEM) عند التكبير العالي. بشكل أكثر تحفظا ، يمكن للمرء تكرار المحاذاة المباشرة للخطوات 1.5-1.8 قبل إصلاح الاستجماتيزم. قم بمحاذاة التصوير عالي التكبير مع مونتاج LM.انتقل إلى موضع على مونتاج LM مع بعض الميزات التي يمكن التعرف عليها بسهولة. أضف نقطة ، وانقر فوق نافذة Navigator > إضافة نقاط ، وانقر فوق الميزة. اضغط مرة أخرى (توقف عن الإضافة) لإلغاء التنشيط. التقط صورة عرض أو تجربة عند أدنى تكبير مرتفع (HM) وابحث عن العنصر المشار إليه. ضع العلامة هناك (تقاطع أخضر) ، مع تمييز النقطة المقابلة في نافذة Navigator ، في قائمة Navigator > Shift to Marker … ، في مربع الحوار الذي يفتح ، اختر كل الخرائط وحفظ Shift ، كما هو موضح في الشكل 5. اختبر عن طريق نقل المرحلة إلى مواضع أخرى والتحقق من توسيط صورة HM في نفس المواقع المحددة في مونتاج LM. إذا لم تكن الميزة مرئية في صورة HM ، فقد يكون التحول بين وضعي LM و HM كبيرا جدا. في هذه الحالة ، قم بعمل مونتاج مضلع على مساحة أكبر. انقر على نافذة المتصفح > إضافة مضلع، اختر بعض النقاط، ثم انقر على إضافة مضلع مرة أخرى للإغلاق. انقر فوق قائمة المتصفح > المونتاج والشبكات > إعداد مونتاج مضلع وعناصر تحكم المونتاج > ابدأ. ثم ابحث عن النقاط المقابلة على النحو الوارد أعلاه وانقر فوق Shift to Marker …. قم بإعداد وضع الجرعة المنخفضة.افتح علامة التبويب التحكم في الجرعة المنخفضة وحدد مربع وضع الجرعة المنخفضة . تحقق من التحديث المستمر وانتقل إلى عرض. اختر تكبير المجهر لهذا الوضع ، وعادة ما يكون الأدنى أو بجوار الأدنى. اختر كل وضع من الأوضاع التالية واضبط التكبير المناسب. يجب تعيين السجل لتحقيق حجم البكسل المطلوب ، ويجب أن يكون تكبير التركيز مرتفعا بدرجة كافية بحيث يتم حل العلامات الائتمانية أو ميزات التباين العالي الأخرى للتركيز بوضوح. ثم قم بإلغاء تحديد التحديث المستمر على الفور.ملاحظة: قد يتم تعيين الوضع التجريبي إما على غرار Record ، وفي هذه الحالة يجب إزاحة منطقة التتبع من منطقة السجل لتقليل التعرض ، أو إلى التكبير المنخفض ، بما في ذلك الكثير من المناطق المحيطة. التقط صورة عرض واضبط موضع الإصدار التجريبي باستخدام تحديد موضع المنطقة: تجريبي.ملاحظة: التوصية #1: نظرا للتغيير في منطقة العينة والوقت ، قد يكون التعرض الإضافي لتجربة منخفضة mag ضئيلا. طالما أن شريط الشبكة لا يدخل مجال الرؤية ، فإن طريقة التتبع هذه عادة ما تكون أكثر موثوقية. التوصية #2: من الممكن أيضا تحديث حجم البقعة من أجل ضبط الجرعة لأوضاع مختلفة ، مثل التركيز. لتحقيق الاستقرار في إعدادات بصريات المجهر ، نوصي بعدم القيام بذلك ، بل ترك حجم البقعة كما هو مناسب للتسجيل ثم ضبط وقت التعرض إذا لزم الأمر لأوضاع المسح الأسرع. انقر فوق علامة التبويب التحكم في الجرعة المنخفضة > انتقل إلى: Rec. ، ثم انقر فوق قائمة Navigator > حالات التصوير المفتوحة > إضافة الحالة الحالية. أعطه اسما بحيث يمكن استدعاؤه بسهولة (على سبيل المثال ، μP STEM للمسبار الدقيق STEM). يمكن تعريف حالات مختلفة لمهام مختلفة. انقل المرحلة إلى موقع مهم للتصوير المقطعي (المزيد حول استخدام Navigator أدناه).أضف نقطة في المتصفح بالنقر فوق نافذة المتصفح > إضافة نقاط. قم بتحسين الارتفاع المركزي عن طريق تحديد المهام > مركزية اليوسنترية > خشنة. نافذة المتصفح > تحديث Z. قم بتعيين مناطق التركيز والمحاكمة. أولا ، التقط صورة عرض. بعد ذلك ، في علامة التبويب التحكم في الجرعة المنخفضة ، ضمن تحديد موضع المنطقة ، حدد التركيز أو التجربة. اضبط مواضع المنطقتين على طول محور الإمالة. يجب ألا يتداخل التركيز مع منطقة السجل.ملاحظة: ضع في اعتبارك أن هناك بعض اللقطات الزائدة، خاصة على الحافة اليسرى، لذلك لا ينبغي تعيين أي منهما بجوار منطقة التسجيل مباشرة. يمكن تقييم مدى الالتقاط الزائد في منطقة اختبار عن طريق المسح الضوئي المتكرر عند تكبير السجل، ثم تقليل التكبير للحصول على عرض أوسع. لإجراء قياس جيد (اختياري مع خبرة) ، قم بإمالة المسرح إلى + 60 درجة ثم -60 درجة ، في كل مرة تلتقط صورة عرض أو معاينة للتأكد من أن شريط الشبكة لا يدخل في حقل عرض منطقة السجل الموضح باللون الأخضر. قم بإعداد سلسلة الإمالة.افتح ملفا جديدا لحفظ البيانات بالنقر فوق ملف > فتح جديد واختر اسم ملف. حدد قائمة سلسلة الإمالة > إعداد سلسلة الإمالة (الشكل 6). استكشاف الأخطاء وإصلاحها: إذا كان الزر فتح جديد باللون الرمادي، فتحقق من إنهاء سلسلة الإمالة السابقة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بالإنهاء بالنقر فوق Tilt Series > Finish. اضبط زوايا الإمالة القصوى في المربعين إمالة إلى وإنهاء ، عادة -60° و+60°، على التوالي، بالإضافة إلى الزيادة، عادة 2°. بالنسبة للوضع المتماثل للجرعة (موصى به – تأكد من أن وضع الجرعة المنخفضة لا يزال نشطا) ، تحقق من تشغيل السلسلة في اتجاهين من ___. عادة ما يكون الفراغ 0 ، ولكن يمكن استخدامه للتعويض عن صفائح FIB المائلة مسبقا (على سبيل المثال ، عند 20 درجة). للتبسيط، تحقق من الحفاظ على وقت التعرض ثابتا. يتطلب تغيير هذا بعض إعادة صياغة حساب التعرض ويمكن أن يتداخل أيضا مع عمليات إعادة البناء الجبرية (على سبيل المثال ، ART / SART / SIRT) ، والتي تقارن الشدة المتوقعة بالبيانات الأصلية (انظر الخطوة 7.1). حدد تخطي التركيز البؤري التلقائي. تشير زاوية شبه التقارب الصغيرة ، مثل 1 mrad ، إلى عمق مجال طويل لدرجة أنه قد يكون من غير الضروري التركيز. كاختبار ، ركز عند 0 درجة ، وقم بالإمالة إلى 60 درجة أو -60 درجة ، واضغط على تسجيل. الحفاظ على التركيز هو في المقام الأول مسألة ارتفاع مركزي دقيق. لمزيد من التقارب ، قد يكون من الضروري التركيز أثناء السلسلة. في هذه الحالة ، قم بإلقاء نظرة ، وفي علامة التبويب التحكم في الجرعة المنخفضة ، حدد موضع المنطقة والتركيز ، واضبط منطقة التركيز. الإجراءات الأولية والنهائية: إذا تم إجراء ضبط الارتفاع المركزي بدقة ، فلا داعي لتكراره. قم بإلغاء تحديد إغلاق صمامات العمود في نهاية السلسلة ما لم يكن هناك سبب وجيه لعدم القيام بذلك. لتتبع معلمات التحكم ، هناك العديد من الخيارات. بالنسبة لجمع البيانات غير المراقب ، فإن الأولوية القصوى هي تجنب توقف البرنامج لإدخال المستخدم. استخدم الإعدادات الموصى بها: كرر التسجيل إذا كانت النسبة المئوية للحقل المفقود أكثر من 5. بعد ذلك ، تتبع بعد وتحقق محاذاة مع معاينة قبل الحصول على مرجع مسار جديد والحصول على مرجع مسار جديد إذا كانت محاذاة السجل تختلف بنسبة 2٪. لجمع البيانات الخاضعة للإشراف ، قم بتطبيق معلمات أكثر صرامة لتجنب مخاطر فقدان ساعات من وقت الأداة. عندما تكون جاهزا للبدء ، اضغط على GO في أسفل النافذة. في النهاية، حدد سلسلة الإمالة > إنهاء. 5. الحصول على دفعة في نقاط متعددة باستخدام المستكشف (تحسين # 1) ملاحظة: البروتوكول بدائي لأنه أ) مطابق ل TEM و ب) أصبحت الأدوات الجديدة متاحة والتي من المحتمل أن تجعل الوصف الكامل قديما. قم بتحميل مونتاج الشبكة الكامل إلى النافذة الرئيسية. اختر عددا من المجالات التي تبدو واعدة. انقر إضافة نقاط وأضفها إلى مراكز مربعات الشبكة المحددة. انقر فوق إضافة نقاط مرة أخرى لإلغاء تنشيط الوضع. مع تنشيط حالة التصوير بجرعة منخفضة، حدد نافذة Navigator > حدد الحصول وملف جديد في العنصر لكل مربع من المربعات المحددة. بالنسبة للأول ، سيتم فتح مربع حوار لخصائص الملف (الشكل 7) ثم اسم الملف. اختر الصور المركبة ، ثم في مربع حوار إعداد المونتاج (الشكل 8) ، تحقق من استخدام معلمات العرض في وضع الجرعة المنخفضة واجعل شبكة كبيرة بما يكفي لتغطية المربع (حوالي 100 × 100 ميكرومتر). انقر فوق قائمة Navigator > الحصول على العناصر وحدد المعلمات لرسم الخرائط. الأهم من ذلك ، في الإجراءات الأساسية ، تحقق من إنشاء خريطة الملاح ، ثم المركزية التقريبية والمركزية الدقيقة ، واضغط على Go (الشكل 9). بالنسبة لشبكة 200 شبكة ، سيؤدي ذلك إلى خريطة للمربع بأكمله تقريبا (الشكل 10) الاستعداد لاختيارات موقف التصوير المقطعي. افتح ملفا جديدا بالنقر فوق ملف > فتح جديد. أعطه اسم ملف (على سبيل المثال ، AnchorMaps.mrc).أثناء تنشيط وضع الجرعة المنخفضة ، أدخل Camera & Script > Setup وتأكد من أن العرض والمعاينة في نفس التجميع (وإلا ، فلا يمكن حفظهما في نفس الملف). قم بزيارة النقاط في الخرائط المربعة بالنقر فوق نافذة Navigator > الانتقال إلى XYZ. اختر موضعا للتصوير المقطعي الأول باستخدام العلامة. التقط صورة معاينة وحسن الموضع عن طريق السحب بزر الفأرة الأيمن. ثم حدد نافذة المتصفح > خريطة جديدة، وانقر فوق نعم في مربع الحوار للحفظ. بعد ذلك ، التقط صورة عرض لنفس المنطقة واحفظها مرة أخرى كخريطة جديدة. تأكد من تمييز عرض الخريطة، وحدد حالة الإرساء في نافذة المتصفح أعلى اليمين. اختر الموضع الثاني ، وخذ معاينة مرة أخرى وقم بتحسين الموقع على النحو الوارد أعلاه ، وهذه المرة اضغط على خريطة المرساة في نافذة المتصفح. سيؤدي هذا إلى حفظ كل من المعاينة والعرض كخرائط جديدة في Navigator. كرر الخطوة 5.5.4 لجميع المواقع المطلوبة. انتقل من مربع شبكة إلى آخر عن طريق تحديد النقطة والضغط على Go to XYZ في نافذة المتصفح. للتركيز المرجعي، اختر منطقة واضحة من الشبكة وقم بالتركيز البؤري بعناية، يدويا أو عن طريق التركيز البؤري التلقائي. اضغط على إعادة تعيين إلغاء التركيز على لوحة المجهر. قم بإنشاء برنامج نصي في SerialEM بالنقر فوق البرنامج النصي > تحرير > تحرير 15 (أو رقم مجاني آخر) وأدخل سطرين: ScriptName SetDefocus و SetDefocus 0. في نافذة المتصفح، قم بتمييز الموقع الأول (إما معاينة أو عرض). اضغط على Shift-T ثم ظلل الموقع الأخير واضغط مرة أخرى على Shift-T. سيتم فتح مربع حوار خصائص الملف. اختر صورا ومعلمات أحادية الإطار لحفظها بما في ذلك اسم الملف. قم بتحرير اسم الملف ولكن اترك تسمية العنصر في النهاية.ملاحظة: سيتم تحديث أسماء الملفات التي تنتهي بالأرقام تلقائيا لسلسلة الإمالة المتتالية. من الملائم استخدام خيار قائمة Navigator > Nav. > استخدام تسميات العناصر في أسماء الملفات. بعد ذلك ، سيتم فتح قائمة إعداد سلسلة الإمالة تلقائيا. املأ كما كان من قبل (الشكل 6) ، لكن لا تختار صقل المركزية. سيتم الآن وضع علامة على نقاط المعاينة في Navigator ك TS. يمكن للمرء العودة إلى هذه القائمة باستخدام الزر الموجود في نافذة Navigator أعلى قائمة العناصر. اختر قائمة المتصفح > الحصول على العناصر. هذه المرة ، حدد معلمات البيانات النهائية. حدد الإجراء الأساسي: الحصول على سلسلة إمالة واختر إدارة Dewars / فراغ ، وإعادة محاذاة إلى عنصر ، ومركزية دقيقة ، وتشغيل البرنامج النصي قبل الإجراء ، معS cript للتشغيل: SetDefocus. حدد الخيارات العامة: لا يوجد مربع رسالة عند حدوث خطأ وأغلق صمامات العمود في النهاية ، ثم اضغط على GO (الشكل 11). سيقوم SerialEM الآن بزيارة جميع خرائط Anchor وتسجيل سلسلة إمالة في كل موضع (الشكل 12). 6. تسجيل خريطة CLEM (تحسين #2) إذا لم يتم ذلك بالفعل ، فقم بتحميل مونتاج الشبكة الكامل في النافذة الرئيسية ، ثم قم بإنشاء نافذة جديدة بالنقر فوق نافذة > نافذة جديدة وقم بتسميتها. لاحظ أن مونتاج الشبكة الكامل يظهر في التسجيل 1. قم باستيراد صورة خريطة CLEM بالنقر فوق قائمة المتصفح > استيراد الخريطة. يجب أن تذهب إلى التسجيل 2. يمكن أيضا تعيين نافذة جديدة له على النحو الوارد أعلاه. افحص خريطة CLEM لتحديد الدوران النسبي فيما يتعلق بمونتاج الشبكة الكامل. من الأسهل القيام بذلك على الخريطة التي تظهر فيها أشرطة الشبكة. لاحظ أنه قد يتم أيضا قلب الخريطة. قم بمحاذاتها تقريبا باستخدام قائمة Navigator > تدوير الخريطة ، مع Flip إذا لزم الأمر.ملاحظة: يمكن أن تستوعب الخطوة التالية أيضا الوجه ، ولكن القيام بذلك مسبقا يجعل ما يلي أسهل بكثير. يمكن تكرار هذه الخطوة حتى تبدو المحاذاة مرضية ، ولكن ليس من الضروري أن تكون دقيقا. تقديم نقاط التسجيل للمحاذاة الدقيقة. ضع عددا من النقاط المقابلة على واحدة ثم النافذة الأخرى. لكل نقطة من هذا القبيل ، تحقق من نقطة التسجيل في الجزء العلوي من نافذة المتصفح. سيتم تسمية النقاط المقابلة بمؤشر تصاعدي ، متبوعا ب R1 أو R2 لمونتاج الشبكة أو الخريطة المستوردة ، على التوالي.ملاحظة: استخدام شبكات الباحث يجعل هذه الخطوة بسيطة للغاية. بخلاف ذلك ، اختر ميزات صلبة مثل العلامة المركزية أو زوايا مربعات الشبكة. من حيث المبدأ ، ثلاث نقاط كافية للمحاذاة الخام ، ولكن المزيد من النقاط تساعد في تعويض عدم التطابق الطفيف في إنشاءات المونتاج. إذا كانت هناك رغبة في عدة قنوات لخريطة CLEM ، على سبيل المثال ، ألوان فلورية مختلفة أو مضان بدون خلفية حقل ساطع ، فقم باستيرادها كما في الخطوة 6.2 أعلاه ، وقم بتغيير التسجيلات إلى 2. بهذه الطريقة ، سيرثون نقاط التسجيل من الخريطة الأولى. فرض التسجيل عن طريق قائمة Navigator > تحويل العناصر. ستظهر نقاط التسجيل المقابلة الآن على جميع الخرائط ، والتي سيتم إدراجها في التسجيل 1. للمحاذاة بشكل مرئي ، انقر فوق قائمة المتصفح > تدوير الخريطة. لاحظ أنه عند تحميل خريطة من نافذة المتصفح، لا يتم تدويرها تلقائيا ما لم يتم تحديد المربع تدوير عند التحميل . يمكن دائما تدويره من نافذة Navigator. يجب أن يكون من الممكن الآن وضع علامة أو نقطة على خريطة التألق ونقل المرحلة إلى الموقع المقابل على الشبكة (الشكل 13). 7.3D إعادة الإعمار يتضمن ذلك نفس الخطوات الأساسية للتصوير المقطعي TEM: محاذاة سلسلة الميل متبوعة عادة بالإسقاط الخلفي. تتوفر العديد من منصات البرامج ، ويمكن معالجة البيانات بشكل مشابه لبيانات TEM ، باستثناء أنه يجب تخطي تصحيح CTF. قم بتطبيق تطبيع الشدة لتعزيز مساهمة الإسقاطات عالية الميل أو لموازنة التغيير في الإضاءة أثناء السلسلة ، مع التحذير من تأثر المعلومات الكمية. يعمل IMOD26 بشكل جيد ، على سبيل المثال ، بينما AreTomo27 مفيد جدا للمحاذاة غير الإيمانية ؛ في حالة وجود جسيمات إيمانية ، يمكن ل ClusterAlign28 متابعتها كمجموعات بدلا من بقع فردية ؛ هذا مفيد بشكل خاص لبيانات العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات حيث قد تفقد البقع أو تخفيها ميزات عالية التباين. اتبع إعادة الإعمار مع إزالة الالتفاف 3D29 لتحسين التباين وتقليل الضوضاء. بمجرد إعادة بنائها ، قم بتمثيل بيانات حجم STEM بأي من الطرق القياسية ، مثل orthoslices أو تجزئة متساوي السطح. والجدير بالذكر أن توزيع الكثافة أحادي القطب ، بدون انعكاسات تباين أو أهداب فورييه التي تظهر في تباين الطور التقليدي TEM. من الوسائل المثيرة للاهتمام لتمثيل التصوير المقطعي ل STEM ، بشكل عام ، عكس المجال الساطع (الشكل 14). التأثير هو تأثير “عيون الأشعة السينية” ، رؤية الأشياء الكثيفة ذات الأهمية من خلال الخلية الموضحة30.

Representative Results

يظهر مونتاج شبكي كامل تم إعداده في STEM المناطق ذات الخلايا ذات الأهمية (الشكل 4). لاحظ أن الصورة في حقل مظلم ، لذلك تظهر الثقوب الفارغة مظلمة. تظهر الخلايا ساطعة جزئيا ، حيث تنتشر الإلكترونات نحو كاشف HAADF. في الأجزاء الأكثر سمكا ، عادة ما تكون المراكز أو بالقرب من قضبان الشبكة ، يصبح التباين داكنا مرة أخرى. ويرجع ذلك إلى التشتت المتعدد ، حيث تصل الإلكترونات إلى زوايا لا يلتقطها الكاشف. في الممارسة العملية ، ستكون هذه المناطق سميكة جدا للتصوير المقطعي. تتضمن المرحلة التالية خرائط التكبير الوسيط (الشكل 10). غالبا ما تسمى هذه الخرائط المونتاج المتوسطة ، أو الخرائط المربعة ، في إشارة إلى مربعات الشبكة بدلا من الشكل. حتى في أدنى وضع STEM للمسبار الدقيق ، سيتم الحصول عليها أيضا كصور مونتاج. يؤدي النقر فوق العنصر الموجود في نافذة Navigator إلى تحميل صورة الخريطة في النافذة الرئيسية. يتم اختيار نقاط محددة للحصول على التصوير المقطعي داخل هذا المجال. استخدم وضع المعاينة لتحديد موقع المنطقة عند تكبير التسجيل. ضع في اعتبارك أنه قد يكون هناك تحول جانبي بين المعاينة والتسجيل، اعتمادا على سرعات المسح الضوئي. يمكن تسجيل سلسلة إمالة واحدة هنا. الميتوكوندريا ، على سبيل المثال ، يمكن تحديدها غالبا في صورة المعاينة والتسجيل (الشكل 12). بالنسبة للتصوير المقطعي الدفعي ، ستنتقل المرحلة حول الشبكة وقد لا تعود إلى نفس الموقع بالضبط. تستخدم خرائط الربط لضمان إعادة تعريف مناطق التسجيل المرغوبة بشكل موثوق بمطابقة صورة المعاينة مع عرض تكبير أقل، حتى إذا تحولت حركة المرحلة. يوفر PyEM23,24 بديلا أسرع موصى به بالتأكيد ، ولكنه ليس جزءا من التثبيت القياسي بعد. في نهج CLEM ، يمكن استخدام خريطة مضان لتحديد مجالات الاهتمام للتصوير المقطعي. يتم الحصول على التألق خارجيا ويجب تسجيله في مونتاج الشبكة الكامل. من المفيد أن تكون أشرطة الشبكة والثقوب مرئية ، لذلك يمكن تحضير مضان مدمج + مركب مجال ساطع قبل الاستيراد ، على سبيل المثال في برنامج GIMP (https://www.gimp.org) أو ImageJ31 (احرص على أن يعكس ImageJ المحور الرأسي). عندما يكون النطاق الديناميكي للتألق كبيرا ، قد يكون من الصعب إنشاء مثل هذا الدمج دون تشبع. في هذه الحالة ، يمكن استيراد الخريطتين بشكل منفصل ثم تسجيلهما معا كما هو موضح (الشكل 13). بهذه الطريقة ، تؤدي نقطة على خريطة التألق في نافذة Navigator ، متبوعة ب “Go To XY” ، إلى نقل المسرح إلى الموضع المقابل على الشبكة كما هو مثبت في TEM. احرص على أن تؤدي التناقضات الصغيرة في إنشاء المونتاج (أو خريطة التألق ، إذا كانت أيضا مونتاج) إلى عمليات نزوح صغيرة ؛ لذلك ، للحصول على الدقة المثلى ، يجب إعادة تسجيل التألق على وجه التحديد على الخريطة المربعة. غالبا ما يكفي إجراء هذا التسجيل بالعين ، على أساس الثقوب الموجودة في فيلم الدعم أو الميزات المشتركة مع صورة ضوء المجال الساطع. ينتج عن إعادة بناء سلسلة الميل حجم ثلاثي الأبعاد (الشكل 14). يحتوي هذا المثال على حجم بكسل يبلغ 2.042 نانومتر ، مما ينتج عنه مجال رؤية ~ 4 ميكرومتر. تبرز رواسب فوسفات الكالسيوم (رؤوس الأسهم البرتقالية) ، بسبب العدد الذري الأعلى مقارنة بالمناطق المحيطة. يمكن تتبع الأنابيب الدقيقة (رؤوس الأسهم الحمراء) في جميع أنحاء مجال الرؤية بأكمله. أيضا ، يمكن رؤية أغشية الميتوكوندريا الداخلية والخارجية (رؤوس الأسهم الخضراء) بوضوح. يمكن ملاحظة الأكتين في صورة حزم أو خيوط فردية. لتحقيق دقة أكثر خواص ، يمكن معالجة إعادة الإعمار عن طريق الالتفاف. الشكل 1: مقارنة بين TEM مقابل STEM. في TEM ، يضيء مجال الرؤية بواسطة شعاع شبه متوازي ، وتشكل العدسة الموضوعية صورة مكبرة على الكاميرا. بالنسبة إلى cryo-TEM ، يتم فتح الفتحة الموضوعية لتمرير موجات الإلكترون المتناثرة (الخط الأحمر المتقطع) ، والتي ، مع إلغاء التركيز ، تنتج تباين الطور عن طريق التداخل مع الموجات (الخضراء) غير المبعثرة. من ناحية أخرى ، يقوم STEM بتنقيط شعاع مركز عبر العينة ويجمع الإلكترونات المتناثرة بطريقة بكسل تلو الآخر. قد تجمع أجهزة الكشف المتعددة الإلكترونات المتناثرة في زوايا مختلفة. تم تعديل هذا الرقم من30. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: مثال على تشويه الصورة على الجانب الأيسر بسبب ارتفاع معدل المسح. لاحظ التشويه المميز برؤوس الأسهم الصفراء ، وكذلك الثقوب المشوهة ذات الشكل البيضاوي في Quantifoil. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: حوار إعداد المونتاج لمونتاج الشبكة بالكامل. اختر التكبير وعدد القطع في X و Y بحيث تصل المساحة الإجمالية إلى حوالي 2000 ميكرومتر للحصول على خريطة لمعظم الشبكة. اختر أيضا نقل المرحلة بدلا من إزاحة الصورة واستخدام تعيين المونتاج، وليس معلمات التسجيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: خريطة الشبكة ذات التكبير المنخفض الكامل المسجلة في وضع STEM. تظهر المناطق المكسورة سوداء تماما في صورة الحقل المظلم. من المحتمل أن تكون المناطق الرمادية الداكنة سميكة جدا ومزججة بشكل سيئ. المناطق المرشحة الجيدة للتصوير المقطعي هي بيضاء أو رمادية فاتحة في هذا الفحص. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 5: التحول إلى عملية العلامة. يتم تمييز كائن يمكن التعرف عليه في الخريطة منخفضة الدقة بواسطة إضافة نقاط (38 في هذه الصورة). لاحظ التحول بين الخريطة منخفضة الدقة (الدائرة الخضراء) والخريطة متوسطة الدقة (الدائرة البرتقالية). بعد ذلك ، يتم تمييز الكائن بالعلامة (الصليب الأخضر ، الدائرة الحمراء) ، ويبدأ مربع الحوار Shift to Marker. ينقل الخيار المختار جميع الخرائط بمعدل 245x بنفس المقدار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6: حوار إعداد سلسلة الإمالة لسلسلة إمالة STEM. يتم استخدام مخطط الجرعة المتماثل من -60 درجة إلى +60 درجة في خطوات 2 درجة. يتم تخطي التركيز البؤري التلقائي بسبب عمق التركيز البؤري العالي عند استخدام زاوية تقارب منخفضة. لا حاجة لتحسين المركزية كما تم ذلك من قبل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 7: حوار خصائص الملف للخرائط متوسطة الدقة. احفظ كملف مكدس MRC ، واختر الأعداد الصحيحة ، واحفظ معلومات إضافية في ملف بيانات تعريف .mdoc. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 8: حوار إعداد المونتاج لحفظ الخرائط متوسطة الدقة. بالنسبة للمربع على شبكة 200 شبكة ، بعرض 90 ميكرومتر ، ينصح بمساحة إجمالية لا تقل عن 90 ميكرومتر × 90 ميكرومتر. اختر نقل المرحلة بدلا من إزاحة الصورة واستخدام معلمات العرض في وضع الجرعة المنخفضة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 9: تسجيل خريطة متوسطة الدقة. الحصول على مربع حوار العناصر لتسجيل خرائط متوسطة الدقة. اختر تعيين ، والحصول على وحفظ الصورة أو المونتاج ، وحدد إنشاء خريطة المتصفح. في المهام قبل أو بعد الأساسي، اختر مركزية خشنة ودقيقة. عند عدم المساعدة، اختر اختياريا مربع لا توجد رسالة عند حدوث خطأ وإغلاق صمامات العمود في النهاية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 10: صورة لخريطة متوسطة الدقة. خريطة متوسطة الدقة (خريطة مربعة) مسجلة في وضع STEM بواسطة مونتاج 3 × 3. يشار إلى خريطتي المرساة متوسطة الدقة لجمع البيانات بالمربعات الزرقاء. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 11: بيانات سلسلة إمالة الدفعة. الحصول على مربع حوار العناصر لجمع سلسلة إمالة الدفعة. لتجميع بيانات سلسلة الإمالة، اختر البيانات النهائية والحصول على سلسلة إمالة. في المهام قبل أو بعد الأساسي ، حدد إدارة Dewars / Vacuum (اختر الإعدادات المناسبة في قائمة الإعداد) ، وإعادة المحاذاة إلى العنصر ، و Fine Eucentricity ، و Run Script قبل الإجراء. في الخيارات العامة ، حدد مربع لا توجد رسالة عند حدوث خطأ و إغلاق صمامات العمود في النهاية (انظر 5.14). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 12: ميل 0 درجة لسلسلة إمالة STEM للميتوكندريون. تشير رؤوس الأسهم البرتقالية إلى رواسب فوسفات الكالسيوم (حبيبات المصفوفة) ، ورؤوس الأسهم الخضراء إلى cristae ، ورؤوس الأسهم الحمراء إلى علامات إيمانية ذهبية 15 نانومتر. شريط المقياس = 500 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 13: خرائط cryo-CLEM المسجلة . (أ) خريطة STEM متوسطة الدقة (خريطة مربعة ، 26-A) مسجلة في (B) خريطة STEM منخفضة الدقة ، (C) خريطة قناة BF cryo-FM ، و (D) خريطة قناة GFP cryo-FM. تظهر نقاط التسجيل التسع (الملصقات 4-21) في (E) Navigator. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 14: عرض وحدة التخزين. تجسيد حجم (A) 60 نانومتر و (B) مقاطع بسمك 40 نانومتر من خلال تصوير مقطعي مفلتر يشبه SIRT (30 دورة) على أعماق مختلفة. حجم البكسل هو 2.048 نانومتر ، مما ينتج عنه مجال رؤية يبلغ حوالي 4 ميكرومتر. يرجى ملاحظة الكثافة المقلوبة مقارنة بالشكل 12 ، مما يعني أن الميزات عالية الكثافة ساطعة. تشير رؤوس الأسهم البرتقالية والبيضاء والحمراء والخضراء والزرقاء الفاتحة إلى رواسب فوسفات الكالسيوم والريبوسومات والأنابيب الدقيقة وغشاء الميتوكوندريا الداخلي والخارجي وخيوط الأكتين على الترتيب. شريط المقياس = 500 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يجب أن يساعد البروتوكول علماء المجهر في علوم الحياة المهتمين بالحصول على عرض 3D للعضيات داخل الخلايا في مناطق الخلية التي لا يمكن الوصول إليها من خلال التصوير المقطعي TEM التقليدي. يمكن استخدام نفس البروتوكول أيضا في التصوير المقطعي STEM للأقسام البلاستيكية ، مع قيود مريحة على التعرض. وينبغي اعتبار البروتوكول نقطة انطلاق وليس مجموعة من القواعد الصارمة. في الواقع ، قوة العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات هي مرونتها. لا توجد طريقة واحدة صحيحة لتشغيله.

نؤكد أن STEM ، في حد ذاته ، يشير فقط إلى المسبار الممسوح ضوئيا ولا يحدد تكوين الصورة. يعتمد التباين بشكل أساسي على تكوين أجهزة الكشف. تستخدم الطرق الأكثر وضوحا أجهزة الكشف ذات التماثل المحوري ، إما قرص متمركز على المحور البصري أو حلقة محيطة به. بشكل عام ، عندما تصطدم الإضاءة بالكاشف مباشرة ، نسجل صورة BF حيث تظهر عينة (تشتت الإلكترون) مظلمة ؛ على العكس من ذلك ، عندما يجمع الكاشف الإلكترونات المتناثرة فقط ، فإننا نسجل صورة DF حيث تظهر العينة الكثيفة ساطعة. عند توفر الأجهزة المناسبة ، يمكن ل SerialEM الحصول على هاتين الإشارتين وتسجيلهما في وقت واحد. لا تزال هناك تكوينات أكثر تطورا ، بدءا من أجهزة الكشف ذات الأجزاء المتعددة إلى الكاميرات المنقطة بالكامل. يمكن تحقيق تصوير تباين الطور ، على سبيل المثال ، من خلال تقييم الفرق بين عناصر الكاشف خارج المحور32,33. يحدد جمع نمط التشتت ثنائي الأبعاد (الحيود) بالكامل لكل بكسل الطريقة المعروفة باسم 4D STEM34 ، والتي تتيح إعادة بناء تباينات صور متعددة من نفس البيانات الأصلية. يتيح STEM رباعي الأبعاد تصوير الإلكترون ، والذي يوفر وسيلة أخرى للحصول على تباين الطور35.

لقد ركزنا على طريقة STEM الخاصة التي نعتبرها مفيدة للغاية لدراسة العضيات والخلايا السليمة أو أقسام الخلايا السميكة ميكرون. يستلزم ذلك على وجه التحديد استخدام تصوير BF بزاوية شبه تقارب صغيرة في الإضاءة وزاوية تجميع كبيرة نسبيا في الكاشف. يوفر التقارب الصغير عمقا كبيرا للمجال بحيث تظل العينة بأكملها في التركيز طوال سلسلة الميل19. في الممارسة العملية ، مع مرحلة المجهر الجيدة ، يمكن أن يلغي أيضا الحاجة إلى ضبط التركيز أثناء الاستحواذ. السعر هو حل وسط في القرار ، كما هو موضح في القسم 3 من البروتوكول. لقد اقترحنا صورا بدقة 4K مع مسبار ~ 2 نانومتر ، والذي يصل مع تباعد بكسل 1 نانومتر إلى مجال رؤية يبلغ 4 ميكرومتر. ومع ذلك ، يتم تشجيع القارئ بشدة على التجربة. الاعتبار الثاني هو على جانب الكاشف. عندما يملأ قرص الإضاءة كاشف BF الموجود على المحور ، يتم قمع تباين الطور ويهيمن تباين التشتت (السعة) ؛ وقد سميت هذه الحالة تباين المجال الساطع غير المتماسك36. السؤال هو بأي كسر يجب ملؤه ، وتعتمد الإجابة على العينة. ستظهر العينة الرقيقة جدا أفضل تباين مع الكاشف المملوء بالكامل (أي زاوية التجميع المطابقة لزاوية الإضاءة) ، لكن العينة الأكثر سمكا ستنثر كل الشدة بعيدا ، تاركة إشارة صاخبة ذات تباين ضعيف. القاعدة الأساسية المفيدة هي أنه كلما كانت العينة أكثر سمكا ، يجب أن تكون زاوية القطع الخارجية لكاشف BFأكبر 21. حجم الكاشف وموضعه ثابتان بالطبع ، لذلك يتم ضبط حجم قرص الحيود باستخدام طول الكاميرا ، كما هو موضح في القسم 1. إذا كانت إعدادات مضخم الكاشف بحيث تملأ الإشارة النطاق الديناميكي ولكنها لا تتشبع تحت الإضاءة المباشرة (1.12.3) ، فيمكن زيادة طول الكاميرا حتى يتم الوصول إلى شدة إشارة وتباين معقولين. مرة أخرى ، يتم تشجيع القارئ على التجربة. الفن ، إذا جاز التعبير ، في الزوايا.

معلمة أخرى ، لم تتم مناقشتها في البروتوكول ، هي جهد تسريع المجهر. سيكون تفاعل الإلكترونات المضيئة مع العينة أقوى عند الجهد المنخفض. مع تساوي كل شيء آخر ، يمكننا توقع تباين أعلى عند الجهد المنخفض. من ناحية أخرى ، فإن بداية التشتت المتعدد داخل العينة هي التي تحد من سمك العينة القابلة للاستخدام ، لذلك يسمح الجهد العالي باستخدام عينات أكثر سمكا. ومع ذلك ، فإن هذه التأثيرات خفية إلى حد ما. تجاربنا حتى الآن مع تسارع 200 كيلو فولت و 300 كيلو فولت متشابهة.

بالنظر إلى ما يمكن توقعه من STEM من حيث الدقة ، يعتمد هذا مرة أخرى على العينة وتكوين الكاشف. باستخدام نهج تحليل جسيم واحد ، يمكن تحديد أيونات المعادن على الفيريتين بواسطة STEM للحقل المظلم الحلقي بدقة بضعة أنجستروم37. في الآونة الأخيرة ، تم تحقيق استبانة دون النانومتر لعينات الفيروسات والبروتين باستخدام الصور التي تم الحصول عليها بواسطة تباين الطور التفاضلي المتكامل (iDPC) STEM32 وكذلك ptychography35. بالنسبة للكائنات الفريدة في العينات الخلوية السميكة ، وبالطرق الموضحة هنا ، فإن هذه الدقة العالية ليست واقعية. الدقة المثلى هي قطر المسبار ، والذي يتعلق بزاوية شبه التقارب كما هو موضح. ستؤدي العوامل الأخرى إلى تدهور الدقة ، لا سيما أخذ عينات البكسل الخشنة للوصول إلى مجال رؤية كبير ، والاختلالات في سلسلة الإمالة ، وانتشار شعاع المسبار في الإرسال. تقارن الصور جيدا مع التصوير المقطعي للقسم البلاستيكي. باستخدام الإعداد الموصوف هنا ، على سبيل المثال ، يجب أن يكون من السهل رؤية النواة المجوفة للأنابيب الدقيقة ، ولكن ليس الخيوط الأولية الفردية.

للتلخيص ، فإن طرق وأجهزة العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات في مرحلة التطوير. يمكننا أن نتوقع أن تؤثر الابتكارات في التصوير على التصوير المقطعي أيضا ، مما يؤدي إلى دخول العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات إلى مجالات لم تكن متاحة بواسطة تقنيات أخرى. نتوقع أن يكون التقارب مع التصوير الفلوري المبرد المترابط القائم على طرق الدقة البصرية الفائقة الحديثة مثمرا بشكل خاص. مقياس العضيات ، 100-1000 نانومتر ، هو هدف مثالي لهذه الأساليب الناشئة.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نحن ممتنون للغاية للدعم المستمر والمستمر من مؤلف ومشرف حزمة برامج SerialEM ، David Mastronade ، و Günther Resch. تم تمويل P.K. من قبل صندوق العلوم النمساوي (FWF) من خلال زمالة شرودنجر J4449-B. لغرض الوصول المفتوح ، قام المؤلفون بتطبيق ترخيص حقوق الطبع والنشر العام CC-BY على أي نسخة مخطوطة مقبولة من المؤلف تنشأ عن هذا التقديم. يقر كل من م. إ. و س. ج. و. بتمويل من صندوق العلوم الإسرائيلي، منحة رقم 1696/18، ومن مشروع توأمة أفق 2020 التابع للاتحاد الأوروبي، ImpaCT (منحة رقم 857203). يقر م. بالتمويل المقدم من ERC في مشروع CryoSTEM (المنحة رقم 101055413). إم إي هو شاغل كرسي سام وأيالا زاكس البروفيسور ورئيس مركز إيرفينغ وشيرنا موسكوفيتز لتصوير النانو والنانو الحيوي. استفاد مختبر M.E. من الكرم التاريخي لعائلة هارولد بيرلمان. وننوه أيضا بالتمويل المقدم من الاتحاد الأوروبي. ومع ذلك ، فإن الآراء ووجهات النظر المعبر عنها هي آراء المؤلف (المؤلفين) فقط ولا تعكس بالضرورة آراء الاتحاد الأوروبي أو الوكالة التنفيذية لمجلس البحوث الأوروبي. لا يمكن تحميل الاتحاد الأوروبي ولا السلطة المانحة المسؤولية عنها.

Materials

 SerialEM University of Colorado Veriosn 4.0 SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition. 
STEM-capable transmission electron microscope The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elbaum, M. Expanding horizons of cryo-tomography to larger volumes. Current Opinion in Microbiology. 43, 155-161 (2018).
  2. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).
  3. Do, M., Isaacson, S. A., McDermott, G., Le Gros, M. A., Larabell, C. A. Imaging and characterizing cells using tomography. Archives of Biochemistry and Biophysics. 581, 111-121 (2015).
  4. Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. The cellular landscape by cryo soft X-ray tomography. Biophysical Reviews. 11 (4), 611-619 (2019).
  5. Kapishnikov, S., et al. Oriented nucleation of hemozoin at the digestive vacuole membrane in Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11188-11193 (2012).
  6. Kapishnikov, S., et al. Unraveling heme detoxification in the malaria parasite by in situ correlative X-ray fluorescence microscopy and soft X-ray tomography. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  7. Sviben, S., et al. A vacuole-like compartment concentrates a disordered calcium phase in a key coccolithophorid alga. Nature Communications. 7, 11228 (2016).
  8. Wan, W., Briggs, J. A. Cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Methods in Enzymology. , 329-367 (2016).
  9. Zhang, P. Advances in cryo-electron tomography and subtomogram averaging and classification. Current Opinion in Structural Biology. 58, 249-258 (2019).
  10. Bäuerlein, F. J. B., Baumeister, W. Towards visual proteomics at high resolution. Journal of Molecular Biology. 433 (20), 167187 (2021).
  11. Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. Toward compositional contrast by cryo-STEM. Accounts of Chemical Research. 54 (19), 3621-3631 (2021).
  12. Elbaum, M., Wolf, S. G., Houben, L. Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells. MRS Bulletin. 41 (7), 542-548 (2016).
  13. Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells. Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
  14. Houben, L., Weissman, H., Wolf, S. G., Rybtchinski, B. A mechanism of ferritin crystallization revealed by cryo-STEM tomography. Nature. 579 (7800), 540-543 (2020).
  15. Li, Y., Huang, W., Li, Y., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. ACS Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
  16. Hohmann-Marriott, M. F., et al. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nature Methods. 6 (10), 729-731 (2009).
  17. Engel, A. Scanning transmission electron microscopy: biological applications. Advances in Imaging and Electron Physics. 159, 357-386 (2009).
  18. Wolf, S. G., Elbaum, M. CryoSTEM tomography in biology. Methods in Cell Biology. 152, 197-215 (2019).
  19. Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition-A comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
  20. Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
  21. Rez, P., Larsen, T., Elbaum, M. Exploring the theoretical basis and limitations of cryo-STEM tomography for thick biological specimens. Journal of Structural Biology. 196 (3), 466-478 (2016).
  22. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  23. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  24. Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. Cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging. Journal of Visualized Experiments. (185), e63923 (2022).
  25. Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition. Journal of Visualized Experiments. (169), e62383 (2021).
  26. O’Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, J. R., Mastronarde, D. Large-scale electron tomography of cells using SerialEM and IMOD. Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).
  27. Zheng, S., et al. AreTOMO: An integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction. Journal of Structural Biology. (6), 100068 (2022).
  28. Seifer, S., Elbaum, M. ClusterAlign: A fiducial tracking and tilt series alignment tool for thick sample tomography. Biological Imaging. 2, 7 (2022).
  29. Waugh, B., et al. Three-dimensional deconvolution processing for STEM cryotomography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (44), 27374-27380 (2020).
  30. Kirchenbuechler, D., et al. Cryo-STEM tomography of intact vitrified fibroblasts. AIMS Biophysics. 2 (3), 259-273 (2015).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Lazić, I., et al. Single-particle cryo-EM structures from iDPC-STEM at near-atomic resolution. Nature Methods. 19 (9), 1126-1136 (2022).
  33. Seifer, S., Houben, L., Elbaum, M. Flexible STEM with simultaneous phase and depth contrast. Microscopy and Microanalysis. , 1-12 (2021).
  34. Ophus, C. Four-dimensional scanning transmission electron microscopy (4D-STEM): from scanning nanodiffraction to ptychography and beyond. Microscopy and Microanalysis. 25 (3), 563-582 (2019).
  35. Zhou, L., et al. Low-dose phase retrieval of biological specimens using cryo-electron ptychography. Nature Communications. 11 (1), 2773 (2020).
  36. Nellist, P. D. The principles of STEM imaging. Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging and Analysis. , 91-115 (2011).
  37. Elad, N., Bellapadrona, G., Houben, L., Sagi, I., Elbaum, M. Detection of isolated protein-bound metal ions by single-particle cryo-STEM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (42), 11139-11144 (2017).

Tags

Cryo-STEM TomographyTEM TomographyFIB SEMSoft X-ray TomographySTEM OpticsColumn AlignmentEucentric FocusSTEM ModeCondenser ApertureBeam ShiftRotation CenterPivot PointsCondenser Stigmators

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf, S. G., Elbaum, M. Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography. J. Vis. Exp. (196), e65052, doi:10.3791/65052 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image