Schaalbare transfectie van maïs mesophyl protoplasten

1. Groei van het plantmateriaal Spoel de maïskorrels twee keer af met leidingwater. Week de pitten een nacht in leidingwater op kamertemperatuur. Vul de volgende dag een startbak met 72 cellen met bevochtigd 1:1 vermiculiet:veenmos. Spoel de pitten een keer af en plant ze met de dop naar beneden, één pit per cel. Kweek onder langdurige dagomstandigheden (16 uur licht, 8 uur donker) bij 25 °C gedurende 3 dagen. Overbrengen naar constante duisternis bij 25 °C en 9-11 dagen groeien. 2. Plasmide isolatie Transformeer commercieel chemisch competente E. coli met de plasmide (en) van belang volgens de instructies van de fabrikant. Kweek de getransformeerde E. coli in 50 ml vloeibaar LB-medium met geschikte antibiotica gedurende een nacht bij 37 °C met schudden. Pelleteer de E. coli door gedurende 10 minuten te centrifugeren bij 3.000 x g bij kamertemperatuur. Extraheer de plasmiden met behulp van een in de handel verkrijgbare midiprep plasmide DNA-isolatiekit. Schat de plasmide-DNA-concentratie met behulp van een microvolumespectrofotometer.OPMERKING: Materiaal dat geschikt is voor transfectie moet een concentratie hebben van ≥800 ng/μL en een A260/A280 van ≥1,8. 3. Protoplast isolatie Bereid 20 ml enzymoplossing.Voeg 2,18 g mannitol, 0,30 g cellulase R-10 en 0,06 g macerozym R-10 toe aan een centrifugebuis van 50 ml. Keer om om de poeders te mengen. Voeg gedeïoniseerd H2O toe aan 15 ml. Voeg 200 μL 1 M MES, pH 5,7 toe. Vortex om te mixen. Verwarm de oplossing gedurende 10 minuten op 55 °C. Laat 10 minuten afkoelen op kamertemperatuur. Voeg 20 μL 1 M CaCl2, 0,02 g runderserumalbumine en 100 μL 1 M β-mercaptoethanol toe. Vul tot 20 ml met gedeïoniseerd H2O. Giet in een in folie verpakt bekerglas van 250 ml. Haal de maïszaailingen uit het donker. Knip ze een paar centimeter boven de grond met een nieuw scheermesje. Plaats de afgesneden uiteinden in water. Bewaar ze in het donker bij kamertemperatuur terwijl ze niet in gebruik zijn. Selecteer de tweede en derde bladeren van elke zaailing en zorg ervoor dat bladeren met bruine of beschadigde gebieden worden uitgesloten. Selecteer 12-16 bladeren. Snijd ~1 cm van de punt van elk blad af en gooi weg. Snijd vervolgens een sectie van 10 cm van elk blad.OPMERKING: Als er meer weefsel nodig is, gebruik dan een extra volume van 20 ml enzymoplossing in een extra bekerglas van 250 ml. Te veel bladmateriaal in een bepaalde hoeveelheid enzymoplossing kan de levensvatbaarheid verminderen. Stapel de bladdelen op elkaar met de basale uiteinden op elkaar. Klem de bundel aan het basale uiteinde aan elkaar met behulp van een bindclip. Leg de bundel bladeren op een stuk wit papier. Pak de bladeren ~1 cm van het distale uiteinde vast. Snijd met een nieuw scheermesje de bladeren van het distale uiteinde loodrecht op de nerven in dunne (0,5-1 mm) plakjes. Vermijd recht naar beneden hakken, maar maak korte, voorwaartse plakjes door het weefsel.Verwissel de scheermesjes wanneer er zichtbare resten op het papier beginnen te worden afgezet. Zichtbaar residu duidt op pureren van het weefsel als gevolg van een dof mes of een slechte techniek. Na het snijden van ~ 2 cm van de lengte van de bladbundel, breng de plakjes onmiddellijk over in het bekerglas van enzymoplossing. Laat het materiaal niet uitdrogen, omdat dit het aantal verkregen protoplasten zal verminderen. Draai de enzymoplossing voorzichtig rond om het materiaal nat te maken.Plaats een foliedeksel over het bekerglas om het licht te blokkeren. Herhaal het snij- en overdrachtsproces totdat de hele bundel dicht bij de bindclip is gesneden. Breng het bekerglas enzymoplossing over in een stolp. Vacuüm-infiltreer tussen −50,8 kPa en −67,7 kPa ten opzichte van de omgevingsdruk gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Breng het bekerglas over op een tafelbladschudder. Schud bij 40 RPM gedurende 2,5 uur bij kamertemperatuur. Draai het bekerglas voorzichtig met de hand. Wanneer volledig verteerd, zal de enzymoplossing er enigszins melkachtig uitzien. Als de oplossing nog steeds helder is, blijft u nog maximaal een uur schudden bij 40 RPM. Niet langer dan 3,5 uur. Maak tijdens de spijsvertering een mannitol + MES + MgCl2 (MMG) -oplossing, een polyethyleenglycol (PEG) -oplossing en een incubatieoplossing.MMG: Voeg 5,47 g mannitol, 200 μL 1 M MES, pH 5,7 en 750 μL 1 M MgCl2 toe aan een centrifugebuis van 50 ml. Vul tot 50 ml met gedestilleerd H2O. Vortex om op te lossen. Plaats op ijs. Incubatieoplossing: Voeg 5,47 g mannitol, 200 μl 1 M MES bij pH 5,7 en 200 μl 1 M KCl toe aan een centrifugebuis van 50 ml. Vul tot 50 ml met gedestilleerd H2O. Vortex om op te lossen. Plaats op ijs. PEG-oplossing: Voeg 0,44 g mannitol, 1,0 g PEG en 400 μl 1 M CaCl2 toe aan een centrifugebuis van 15 ml. Vul tot 4 ml met gedestilleerd H2O. Vortex om te mengen. Incubeer bij 37 °C met schudden gedurende 30 minuten tot het volledig is opgelost. Bewaren bij kamertemperatuur. Schud de enzymoplossing bij 80 RPM gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Leg het bekerglas met de enzymoplossing op ijs. Verwijder de foliebedekking niet. Voeg 20 ml ijskoude MMG toe aan de enzymoplossing. Filtreer door een celzeef van 40 μm in een centrifugebuis van 50 ml.OPMERKING: Houd alle oplossingen op ijs voor de volgende stappen tot de toevoeging van de PEG. Houd de protoplasten bedekt met folie om blootstelling aan licht te minimaliseren. Splits het filtraat in gelijke volumes van elk 10 ml. Giet elk volume in een glazen centrifugebuis met ronde bodem en draai gedurende 4 minuten bij 100 x g bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en voeg 1 ml ijskoude MMG toe aan elke buis. Resuspensie van de pellets door de buizen voorzichtig rond te draaien en te tikken. Combineer de monsters in een enkele glazen centrifugebuis met ronde bodem. Voeg MMG toe aan een totaal volume van 5 ml. Draai 3 minuten terug op 100 x g bij kamertemperatuur. Wassen met 5 ml MMG en 3 minuten laten draaien op 100 x g bij kamertemperatuur. Herhaal de was met 5 ml MMG en draai gedurende 3 minuten op 100 x g bij kamertemperatuur. Na het draaien van de tweede wasbeurt, observeer of het supernatant helder is. Als het bewolkt blijft, voer dan een derde wasbeurt uit. Resuspendeer de protoplasten in 1 ml MMG. Dek losjes af met folie en houd op ijs. Bepaal de protoplastopbrengst en controleer de levensvatbaarheid.Voeg in een microcentrifugebuis van 1,5 ml 4 μl protoplasten en 72 μl MMG bij elkaar op. Voeg in een microcentrifugebuis van 1,5 ml 1 μL 0,5% fluoresceïnediacetaat (FDA) stockoplossing toe aan 49 μL MMG om een 20x werkende oplossing te maken. Voeg 4 μL FDA-werkoplossing toe aan de buis met de verdunde protoplasten. Incubeer gedurende 5 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Laad 11 μL van het protoplastmengsel op een hemocytometer. Plaats onder een brightfield lichtmicroscoop. Bevestig visueel dat de cellen geen celwanden hebben. Tel vervolgens het aantal protoplasten. Gebruik deze telling om het totale aantal verkregen protoplasten te schatten. Tel vervolgens het aantal protoplasten dat groen fluoresceert onder UV-licht wanneer het wordt gekleurd met de FDA. Succesvolle protoplastisolaties leveren een levensvatbaarheid op van 70%-90%. 4. PEG-gemedieerde transfectie Begin met de geschatte protoplastconcentratie uit stap 3.17 en pas aan tot ~10.000 protoplasten/μL. Als de concentratie laag is, centrifugeer dan gedurende 3 minuten bij 100 x g en resuspensie in MMG tot een concentratie van ~ 10.000 protoplasten / μL. Meng ~ 1.000.000 protoplasten met 15 μg DNA in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Vul het mengsel aan met MMG tot 114,4 μL en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Resuspendeer de protoplasten door op de zijkant van de buis te tikken. Voeg 105,6 μL 25% PEG-oplossing toe aan de protoplasten om een eindgewicht/volume van 12% PEG te bereiken. Meng voorzichtig door 5-10 keer om te keren. Protoplasten in PEG-oplossing zijn kwetsbaar; Schud de buis niet. Incubeer gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur.OPMERKING: De transfectie kan worden opgeschaald in veelvouden van de volumes die in stap 4.2 en stap 4.3 worden gegeven. Zo kunnen bijvoorbeeld 10 miljoen protoplasten en 150 μg DNA worden gesuspendeerd in 1.444 μL MMG en worden behandeld met 1.056 μL PEG-oplossing in een centrifugebuis van 50 ml. Verdun met 5 volumes incubatieoplossing. Meng voorzichtig door inversie. Draai 4 minuten terug op 100 x g bij kamertemperatuur.OPMERKING: Als u opschaalt, splitst u de protoplasten in meerdere glazen buizen met ronde bodem die elk niet meer dan 10 ml bevatten om volledige pelletering te garanderen. Schaal het volume van de incubatieoplossing dat wordt gebruikt voor het wassen proportioneel op. Verwijder het supernatant door pipetteren. Wassen met 1-5 ml incubatieoplossing en gedurende 3 minuten draaien op 100 x g bij kamertemperatuur. Resuspendeer de protoplasten in de incubatieoplossing tot een concentratie van 500-1.000 cellen/μL. Incubeer de protoplasten in het donker ‘s nachts (~16 uur) bij kamertemperatuur. 5. Protoplast herstel en expressie verificatie Draai de protoplasten 4 minuten op 100 x g bij kamertemperatuur. OPMERKING: Als u opschaalt, splitst u de protoplasten in meerdere glazen buizen met ronde bodem die elk niet meer dan 10 ml bevatten. Wassen met 1-5 ml incubatieoplossing en gedurende 3 minuten draaien op 100 x g bij kamertemperatuur. Resuspendeer en combineer in 1-5 ml incubatieoplossing. Als de protoplasten worden getransfecteerd met een fluorescerend reportergen (bijv. GFP), neem dan een aliquot om de transfectie-efficiëntie te controleren. Tel met behulp van een hemocytometer eerst het totale aantal protoplasten met behulp van brightfield-lichtmicroscopie. Tel vervolgens de fractie fluorescerende protoplasten onder UV-licht. Centrifugeer de protoplasten gedurende 3 minuten op 100 x g bij kamertemperatuur.OPMERKING: De protoplasten zijn nu klaar voor downstream-toepassingen zoals RNA-extractie met fenol en guanidine-isothiocyanaat.