قابلية النقل القابلة للتطوير لبروتوبلاستات ميزوفيل الذرة
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا عالي الإنتاجية لنقل ملايين بروتوبلاستات الذرة بشكل عابر لاختبار مكتبات كبيرة من البلازميدات في خلايا ميزوفيل الذرة.
Abstract
غالبا ما يتضمن نقل خلايا ميزوفيل الذرة هضم الجدران الخلوية للنبات لتكوين البروتوبلاستات ثم إدخال الحمض النووي عن طريق التثقيب الكهربائي أو البولي إيثيلين جلايكول (PEG). تم تطوير الطرق السابقة لإنتاج عشرات الآلاف من البروتوبلاستيدات المنقولة في وقت واحد. هنا ، نصف طريقة مباشرة لعزل ونقل الملايين من بروتوبلاستات الميزوفيل الورقية في الذرة (Zea mays L.). تزيل هذه العملية المبسطة بعض الخطوات الأولية الشائعة ، مثل الغسيل في W5. بالإضافة إلى ذلك ، تم تعديل خطوات مثل الطرد المركزي ، والنقل بوساطة PEG ، والحضانة للعمل مع عدد أكبر من البروتوبلاستات. تتيح القدرة على التعبير عن مكتبات كبيرة من تركيبات البلازميد إجراء تجارب على نطاق الجينوم ، مثل مقايسات المراسل المتوازية على نطاق واسع في الذرة.
Introduction
التعبير الجيني العابر هو أداة قوية في بيولوجيا النبات. لكن من الصعب نقل الخلايا النباتية؛ لأنها محاطة بجدار خلوي. هذا الحاجز أمام دخول الحمض النووي غير موجود في أنواع الخلايا الأخرى التي تمت دراستها بشكل شائع مثل خلايا الثدييات أو الحشرات. عالجت الأبحاث السابقة هذا التحدي من خلال استخدام البروتوبلاست: الخلايا النباتية التي تم هضم جدرانها الخلوية وإزالتها. على عكس أنسجة الأوراق غير المعالجة ، من السهل التعامل مع البروتوبلاستيدات النباتية في التعليق وقابلة لتقنيات النقل بوساطة التثقيب الكهربائي أو البولي إيثيلين جلايكول (PEG) 1. تحتفظ الخلايا النباتية بالكثير من وظائفها حتى بعد إزالة الجدار الخلوي. وبالتالي ، يتم استخدام البروتوبلاستيدات في مجموعة متنوعة من النباتات لدراسة وظيفة الجينات والبروتين 2,3 ، لفهم نقل الإشارة4 ، وتحديد الأهداف المحتملة لتربية النباتات5. البروتوبلاست هي أيضا وسيلة ملائمة لفحص تركيبات تحرير الجينوم في أنواع المحاصيل المتنوعة بما في ذلك القمح والبطاطس 6,7. باختصار ، لا غنى عن المقايسات العابرة في البروتوبلاست للتكنولوجيا الحيوية الزراعية.
الذرة (Zea mays L.) هي محصول الحبوب الرائد عالميا من حيث الحمولة. على هذا النحو ، فهو محور رئيسي لأبحاث علوم النبات الأساسية والتطبيقية8. ومع ذلك ، على عكس النباتات النموذجية مثل Nicotiana tabacum9 ، لا يتم إجراء التعبير العابر للجينات المحورة في أوراق الذرة السليمة بشكل روتيني. تم استخدام البروتوبلاستاج للحصول على خلايا ميزوفيل أوراق الذرة ونقلها10،11. حققت الطرق السابقة كفاءات نقل تصل إلى 75٪ باستخدام التثقيب الكهربائي وأنتجت البروتوبلاستيدات المنقولة على نطاق عشرات الآلاف10,15.
يفصل هذا البروتوكول كيفية بروتوبلاست ملايين خلايا الميزوفيل الذرة ونقلها بكفاءة مماثلة للطرق السابقة. تتمثل الخطوات الرئيسية في زراعة شتلات الذرة ، وحصاد أنسجة الأوراق ، وهضم جدار الخلية النباتية ، وتوصيل الحمض النووي البلازميد إلى الخلايا باستخدام PEG. تتمثل المساهمة الرئيسية لهذا البروتوكول في القدرة على توسيع نطاق نقل البروتوبلاست مع الحفاظ على صلاحية الخلية المطلوبة للمقايسات الوظيفية. وهذا يتيح استخدام التجارب على نطاق الجينوم ، مثل مقايسات المراسل المتوازية على نطاق واسع ، والتي يمكن أن تختبر وظيفة مئات الآلاف من المناطق في جميع أنحاء جينوم الذرة. تم استخدام هذه الطريقة مؤخرا للتحقيق في مكتبات كبيرة من عناصر الحمض النووي التنظيمية لرابطة الدول المستقلة بما في ذلك المعززات والمروجين12،13،14.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما ذكر سابقا ، فإن جودة المواد النباتية المستخدمة في البروتوبلاست ضرورية للحصول على البروتوبلاستيدات عالية الجودة16،17،18. من الأهمية بمكان اختيار أوراق صحية لا تشوبها شائبة. استخدم هذا العمل صنف الذرة البحثي الشهير B73. لم نختبر أصنافا أخرى. نمت شتلات الذرة المستخدمة في هذا البروتوكول في الظلام لأن الأوراق المأهولة تنتج البروتوبلاستيدات مع قابلية أكبر للبقاء بعد 16 ساعة من النقل مقارنة بالبروتوبلاستيدات من الأوراق الخضراء. بالنسبة للتطبيقات التي لا تتطلب حضانة بين عشية وضحاها ، سيكون من الممكن استخدام مادة الأوراق الخضراء أو الخضراء.
الخطوة الحاسمة هي قطع مادة الأوراق بشكل صحيح إلى شرائح رقيقة قبل الهضم الأنزيمي. تزيد هذه العملية من مساحة سطح خلايا النسيج المتوسط التي تتعرض لمحلول الإنزيم، وهو ما يزيد من عدد البروتوبلاستيدات المستعادة. يتم التخلص من أطراف الأوراق البعيدة ، ويتم قطع شرائح رفيعة (≤1 مم) بشفرات حلاقة جديدة ، والتي يتم تبديلها فورا عندما تبدأ في التلاشي. بالنسبة لكمية معينة من الأنسجة ، تنتج الشرائح الرقيقة المزيد من البروتوبلاستيدات بشرط استخدام التقنية الصحيحة لتقليل سحق الأوراق.
من المهم أيضا غسل البروتوبلاستيدات بشكل صحيح ، لأنها حساسة للغاية بعد خضوعها لإزالة جدار الخلية. بعد الهضم ، يتم الاحتفاظ بجميع المحاليل على الجليد ، ويتم حماية البروتوبلاستيدات الداكنة من الضوء. يتم تخزين الأسمولية ودرجة الحموضة عن طريق إجراء الغسيل في محلول MMG. لعزل البروتوبلاستيدات عن الحطام الخلوي الأقل كثافة ، يحدث الطرد المركزي عند 100 × جم. تظهر البروتوبلاستيدات التي يتم طردها بالطرد المركزي عند 200 × جم قابلية مماثلة للحياة بعد العزلة ولكنها أقل قابلية للحياة في اليوم التالي ، وتتحول إلى النصف تقريبا أيضا. نوصي بالتحقق من صلاحية البروتوبلاست عن طريق تلطيخ FDA (ثنائي أسيتات الفلوريسين) مباشرة بعد العزلة ؛ تتراوح الصلاحية الطبيعية بين 70٪ -90٪. البروتوبلاستيدات ذات الصلاحية أقل من 40٪ بعد العزل تنتج القليل من المحولات.
يكون التكوير والغسيل أسهل عند العمل مع العديد من البروتوبلاست لأنه يتم الحصول على حبيبات مرئية بوضوح بعد النقل. لهذا السبب ، يتم إجراء النقل باستخدام 1 مليون بروتوبلاست أو أكثر. عند توسيع نطاق البروتوكول ، يجب اختيار وعاء بحجم مناسب لخطوات الحضانة (أنبوب طرد مركزي 1.5 مل أو 15 مل أو 50 مل) ، ويجب تغيير حجم المحلول المستخدم في خطوات الغسيل وفقا لذلك. في أي حال ، من المفيد استخدام أجهزة الطرد المركزي في ≤10 مل من القسامات لضمان عدم بقاء البروتوبلاست في المادة الطافية. أحد ابتكارات هذا البروتوكول هو إزالة خطوة الحضانة والغسيل لمدة 1 ساعة في محلول W5 المدرج في البروتوكولات الأخرى14,19 ، والتي ثبت أنها غير ضرورية في أيدينا.
كما رأينا في دراسات أخرى ، فإن كمية ونوعية الحمض النووي كلاهما أمر بالغ الأهمية لنجاح النقل19. بالنسبة للبلازميدات في نطاق 4-6 كيلو بايت ، يتم استخدام 15 ميكروغرام من الحمض النووي لكل 1 مليون بروتوبلاست. يمكن أن تؤدي مستحضرات الحمض النووي ذات الجودة الرديئة إلى تقليل قابلية البقاء بعد النقل ، لذلك نوصي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية عند عزل البلازميدات عن البكتيريا. يتم احتضان البروتوبلاستيدات طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في الظلام للسماح بنسخ مكتبة البلازميد أو البلازميد مع تقليل الإجهاد. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، يتم استرداد ما يقرب من نصف عدد البروتوبلاستيدات المنقولة في الأصل. يتم تخفيف البروتوبلاستيدات إلى تركيز 500-1000 خلية / ميكرولتر للحضانة بين عشية وضحاها. البروتوبلاستيدات التي تركت لاحتضانها بين عشية وضحاها بتركيزات أعلى من 1000 خلية / ميكرولتر لها معدلات استرداد أقل وقابلية بقاء أقل. عند التركيزات الأعلى ، قد يساهم الحطام من البروتوبلاستيدات التالفة والميتة في موت البروتوبلاستات المجاورة. غسل البروتوبلاست بعد الحضانة بين عشية وضحاها يعمل على إزالة هذا الحطام وإزالة البلازميد الزائد.
مثل هذه البروتوكولات لها قيود على أنه ليست كل أنواع النباتات أو أنواع الأنسجة قابلة للبروتوبلاستينج. علاوة على ذلك ، قد تحدث اختلافات التعبير الجيني بسبب عملية البروتوبلاستيد.
باختصار ، قمنا بتفصيل بروتوكول بسيط وقابل للتطوير لعزل ونقل ملايين البروتوبلاستيدات القابلة للحياة من المحصول الزراعي الأساسي Z. mays. يمكن لهذه الطريقة نقل العديد من البروتوبلاستات باستخدام PEG ، مع كفاءة تحويل عالية تقريبا مثل الطرق القائمة على التثقيب الكهربائي15. يتيح العدد الصافي الأكبر للمحولات اختبار مئات أو آلاف التركيبات في تجارب واسعة النطاق مثل فحوصات المراسل المتوازية على نطاق واسع12,13. ستسمح التجارب المستقبلية على نطاق الجينوم في الذرة للعلماء بفهم أفضل للتعبير الجيني للذرة وتنظيم الجينات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني لبحوث الجينوم البشري للتدريب متعدد التخصصات في علوم الجينوم (منحة تدريب T32 رقم HG000035 إلى JT) والمعهد الوطني للصحة (NIGMS 1R35GM139532 إلى C.Q.) والمؤسسة الوطنية للعلوم (RESEARCH-PGR IOS-1748843 و PlantSynBio 2240888 إلى CQ). نشكر أندريا جالوفاتي من جامعة روتجرز على هدية بذور الذرة.
Materials
| 1.5 mL graduated microcentrifuge tubes | VWR | 490004-444 | |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tube | Corning | 05-527-90 | |
| 250 mL Pyrex glass beaker | Fisher | 50-121-5005 | |
| 40 um nylon mesh cell strainer | Fisher | 22363547 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 14-432-22 | |
| 72 cell propagation tray | T.O. Plastics | 725607C | |
| Aluminum foil | VWR | 89107-732 | |
| Bell jar | Bel-Art | F42022-0000 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-250ML | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2*2H2O) | PhytoTech Labs | C135 | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Cellulase Onozuka R-10 | Duchefa Biochemie | C8001.0010 | |
| D-Mannitol | PhytoTech Labs | M562 | |
| Dissecting scope | Reichert | Microstar IV | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermofischer Scientific | F1303 | Dissolve in acetone at 0.5% weight/volume to make a 1000X stock solution. Protect from light and store at -20 °C. |
| Fluorescence Illumination Systems | Prior | Lumen200 | |
| Fluorescence microscope | Leica | MDG36 | |
| High-capacity centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Macerozyme | Duchefa Biochemie | M8002.0005 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M292-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Maize seeds | B73 | USDA-ARS | https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473 |
| Medium binder clip | Uline | S-24649 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M5287-250G | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Adjust pH to 5.7 using KOH. Protect from light and store at room temperature. |
| Micropipette 20-200 uL | Gilson | F123601G | |
| Nanodrop microvolume spectrophotometer | Thermofischer Scientific | ND-1000 | |
| NEB 5-alpha competent E. coli | New England BioLabs | C2987H | |
| Neubauer hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| No. 9 Single-edge razor blade | Excel | 20009 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-104 | |
| Poly(ethylene) glycol 4,000 | Sigma-Aldrich | 81240-1KG | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
| Professional Grade Vermiculite | NK Lawn & Garden | G208 | |
| Round-bottom glass centrifuge tube 30 mL | Kimble Chase | 45500-30 | |
| Rubber adapter for Corex centrifuge tubes | Corning | CLS8445AO | |
| Sphagnum peat moss | Premier Horticulture | 0128P | |
| TRIzol Reagent | Thermofischer Scientific | 15596018 | |
| Tygon vacuum tubing | VWR | 76336-844 | |
| Vacuum gauge | Wika | 4269978 |
References
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -. L. Protoplasts: A useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Wang, S., Tiwari, S. B., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. AUXIN RESPONSE FACTOR7 restores the expression of auxin-responsive genes in mutant Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts. The Plant Cell. 17 (7), 1979-1993 (2005).
- Hirner, A., et al. Arabidopsis LHT1 is a high-affinity transporter for cellular amino acid uptake in both root epidermis and leaf mesophyll. The Plant Cell. 18 (8), 1931-1946 (2006).
- Hwang, I., Sheen, J. Two-component circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction. Nature. 413 (6854), 383-389 (2001).
- Tan, M. -. L. M. C., Rietveld, E. M., van Marrewijk, G. A. M., Kool, A. J. Regeneration of leaf mesophyll protoplasts of tomato cultivars (L. esculentum): Factors important for efficient protoplast culture and plant regeneration. Plant Cell Reports. 6 (3), 172-175 (1987).
- Brandt, K. M., Gunn, H., Moretti, N., Zemetra, R. S. A streamlined protocol for wheat (Triticum aestivum) protoplast isolation and transformation with CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes. Frontiers in Plant Science. 11, 769 (2020).
- Nadakuduti, S. S., et al. Evaluation of methods to assess in vivo activity of engineered genome-editing nucleases in protoplasts. Frontiers in Plant Science. 10, 110 (2019).
- OECD, Food and Agriculture Organization of the United Nations. OECD-FAO Agricultural Outlook 2021-2030. OECD, Food and Agriculture Organization of the United Nations. , (2021).
- Gallois, P., Marinho, P. Leaf disk transformation using Agrobacterium tumefaciens-expression of heterologous genes in tobacco. Plant Gene Transfer and Expression Protocols. 49, 39-48 (1995).
- Schäffner, A. R., Sheen, J. Maize rbcS promoter activity depends on sequence elements not found in dicot rbcS promoters. The Plant Cell. 3 (9), 997-1012 (1991).
- Sheen, J. Molecular mechanisms underlying the differential expression of maize pyruvate, orthophosphate dikinase genes. The Plant Cell. 3 (3), 225-245 (1991).
- Jores, T., et al. Identification of plant enhancers and their constituent elements by STARR-seq in tobacco leaves. The Plant Cell. 32 (7), 2120-2131 (2020).
- Jores, T., et al. Synthetic promoter designs enabled by a comprehensive analysis of plant core promoters. Nature Plants. 7 (6), 842-855 (2021).
- Ricci, W. A., et al. Widespread long-range cis-regulatory elements in the maize genome. Nature Plants. 5 (12), 1237-1249 (2019).
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiology. 127 (4), 1466-1475 (2001).
- Jeon, J. M., et al. Efficient transient expression and transformation of PEG-mediated gene uptake into mesophyll protoplasts of pepper (Capsicum annuum L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 88 (2), 225-232 (2007).
- Pindel, A. Optimization of isolation conditions of Cymbidium protoplasts. Folia Horticulturae. 19, 79-88 (2007).
- Ren, R., et al. Highly efficient leaf base protoplast isolation and transient expression systems for orchids and other important monocot crops. Frontiers in Plant Science. 12, 626015 (2021).
- Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nature Protocols. 2 (7), 1565-1572 (2007).
