जापानी एन्सेफलाइटिस टीकाकरण वाले बच्चों में लिम्फोसाइटों का पता लगाने के लिए फ्लो साइटोमीटर के बीच प्रयोगशालाओं में स्थानांतरण का मानकीकरण
Summary
इस अध्ययन में, जापानी एन्सेफलाइटिस-टीकाकरण वाले बच्चों में लिम्फोसाइटों का पता लगाने के लिए दो प्रयोगशालाओं में दो प्रवाह साइटोमीटर के बीच प्रयोगात्मक सेटिंग्स और विश्लेषण टेम्पलेट्स के हस्तांतरण की सुविधा के लिए एक विधि विकसित की गई थी। प्रवाह साइटोमीटर प्रयोगों के लिए मानकीकरण विधि अनुसंधान परियोजनाओं को कई केंद्रों में प्रभावी ढंग से आयोजित करने की अनुमति देगी।
Abstract
प्रयोगशालाओं की बढ़ती संख्या को कई प्रवाह साइटोमीटर से डेटा एकत्र करने की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से कई केंद्रों में किए गए अनुसंधान परियोजनाओं के लिए। विभिन्न प्रयोगशालाओं में दो प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करने की चुनौतियों में मानकीकृत सामग्री की कमी, सॉफ्टवेयर संगतता के मुद्दे, उपकरण सेटअप में विसंगतियां और विभिन्न प्रवाह साइटोमीटर के लिए विभिन्न कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग शामिल है। कई केंद्रों में प्रयोगात्मक परिणामों की स्थिरता और तुलनात्मकता प्राप्त करने के लिए एक मानकीकृत प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोग स्थापित करने के लिए, विभिन्न प्रवाह साइटोमीटर में मापदंडों को स्थानांतरित करने के लिए एक तेजी से और व्यवहार्य मानकीकरण विधि स्थापित की गई थी।
इस अध्ययन में विकसित तरीकों ने जापानी एन्सेफलाइटिस (जेई) -टीकाकरण वाले बच्चों में लिम्फोसाइटों का पता लगाने के लिए विभिन्न प्रयोगशालाओं में दो प्रवाह साइटोमीटर के बीच प्रयोगात्मक सेटिंग्स और विश्लेषण टेम्पलेट्स के हस्तांतरण की अनुमति दी। साइटोमीटर सेटिंग्स स्थापित करने के लिए प्रतिदीप्ति मानक मोतियों का उपयोग करके दो साइटोमीटर के बीच एक सुसंगत प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त की गई थी। विभिन्न प्रकार के उपकरणों के साथ दो प्रयोगशालाओं में तुलनीय परिणाम प्राप्त किए गए थे। इस पद्धति का उपयोग करके, हम विभिन्न उपकरणों के साथ विभिन्न प्रयोगशालाओं में जेई-टीकाकरण वाले बच्चों के प्रतिरक्षा समारोह का मूल्यांकन करने के लिए विश्लेषण को मानकीकृत कर सकते हैं, कई केंद्रों में प्रवाह साइटोमीटर के बीच डेटा और परिणामों में अंतर को कम कर सकते हैं, और प्रयोगशाला परिणामों की पारस्परिक मान्यता के लिए एक व्यवहार्य दृष्टिकोण प्रदान कर सकते हैं। प्रवाह साइटोमीटर प्रयोगों की मानकीकरण विधि कई केंद्रों में अनुसंधान परियोजनाओं के प्रभावी प्रदर्शन को सुनिश्चित करेगी।
Introduction
प्रवाह साइटोमेट्री का मानकीकरण विभिन्न प्रयोगशालाओं और अध्ययन केंद्रों में विभिन्न साइटोमीटर से प्राप्त परिणामों की तुलनात्मकता के लिए उपयोगी है, और कार्य कुशलता में सुधार के लिए परिणामों की पारस्परिक मान्यता के लिए अनुकूल है। परिदृश्यों की बढ़ती संख्या के लिए मानकीकरण की आवश्यकता होती है। दवा विकास प्रक्रिया के दौरान, फ्लो साइटोमेट्री मानकीकरण महत्वपूर्ण है, क्योंकि एक विकसित और मान्य परख प्रीक्लिनिकल से नैदानिक विश्लेषण तक पूरी दवा विकास प्रक्रिया का समर्थन करेगी। फ्लो साइटोमेट्रिक विधियों को अक्सर दवा उद्योग और सहयोगी प्रयोगशालाओं के बीच स्थानांतरित किया जाताहै। इसके अलावा, मल्टीसेंट्रिक नैदानिक अध्ययनों से तुलनीय डेटा प्राप्त करना आवश्यक है। उदाहरण के लिए, मल्टीसेंट्रिक फ्लो साइटोमेट्री2 से तुलनीय डेटा प्राप्त करने के लिए सिस्टमिक ऑटोइम्यून डिजीज मल्टीमल्टी क्लिनिकल रिसर्च प्रोजेक्ट में एक मानकीकरण वर्कफ़्लो विकसित किया गया था।
प्रवाह साइटोमेट्री विधियों का मानकीकरण चुनौतीपूर्ण है। प्रयोगशालाओं में अनुभव की जाने वाली चुनौतियों को मानकीकृत सामग्रियों की कमी, सॉफ्टवेयर संगतता के मुद्दों, उपकरण सेटअप में विसंगतियों, और विभिन्न प्रवाह साइटोमीटर के बीच विभिन्न कॉन्फ़िगरेशन के उपयोग और केंद्रों के बीच अलग-अलग गेटिंग रणनीतियोंके लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। इसलिए, प्रयोगशालाओं के बीच एक अंतर विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है। नमूना पहुंच, गुणवत्ता प्रणाली, कर्मियों की योग्यता और उपकरण विन्यास की समीक्षा की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि आवश्यकताओं को पूरा किया गया है।
वर्तमान में, जापानी एन्सेफलाइटिस (जेई) वैक्सीन के साथ टीकाकरण किए गए बच्चों में जेई 5 की घटनाओं में काफी कमी आईहै। परिधीय रक्त प्रतिरक्षा कोशिकाओं की निगरानी टीकाकरण के बाद सेल-मध्यस्थता अनुकूली प्रतिरक्षा में परिवर्तन और परिधीय रक्त लिम्फोसाइट उपसमुच्चय में परिवर्तन और टीकाकरण के प्रभावों के बीच सहसंबंध को समझने में मदद कर सकती है। पूरे रक्त के नमूनों की सीमित स्थिरता के कारण, वैक्सीन प्रभावकारिता का मूल्यांकन अक्सर कई केंद्रों में किया जाता है। इस विश्लेषण के लिए, हमने भोले सीडी 8 + या सीडी 4 + टी कोशिकाओं को सीडी 27 + सीडी 45 आरए + के रूप में, केंद्रीय मेमोरी टी कोशिकाओं (टीसीएम) को सीडी 27 + सीडी 45 आरए – के रूप में, प्रभावक मेमोरी टी कोशिकाओं (टीईएम) को सीडी 27 – सीडी 45 आरए – और टर्मिनल रूप से विभेदित प्रभावक मेमोरी टी कोशिकाओं (टीईएमआरए) को सीडी 27 – सीडी 45 आरए + के रूप में परिभाषित किया। सीडी 19 + बी कोशिकाओं को आबादी में विभाजित किया जा सकता है जो सीडी 27 बनाम आईजीडी 6,7 को व्यक्त करते हैं, भोले बी कोशिकाएं सीडी 27 एन मेमोरी बी कोशिकाओं (एमबीसी) को आईजीडी6 की अभिव्यक्ति के आधार पर पहचाना जा सकता है, और नियामक टी कोशिकाओं (ट्रेग्स) को सीडी 4 + सीडी 25 + + सीडी 127कम 8 के रूप में पहचाना जा सकता है। कई केंद्रों में प्रयोगात्मक परिणामों की स्थिरता और तुलनात्मकता प्राप्त करने के लिए एक मानकीकृत फ्लो साइटोमेट्री प्रयोग स्थापित करने के लिए, जेई-टीकाकरण वाले बच्चों के पूरे रक्त में लिम्फोसाइटों का पता लगाने के लिए विभिन्न प्रवाह साइटोमीटर में प्रोटोकॉल के हस्तांतरण की सुविधा के लिए एक तेजी से और व्यवहार्य मानकीकरण विधि स्थापित की गई थी। बीजिंग चिल्ड्रन हॉस्पिटल, कैपिटल मेडिकल यूनिवर्सिटी से छह स्वस्थ बच्चों (2 साल) की भर्ती की गई थी। 6 महीने से भी कम समय पहले लाइव-एटेन्यूएटेड जेई एसए 14-14-2 वैक्सीन के साथ प्राइम और बूस्ट टीकाकरण प्राप्त करने के बाद, स्वयंसेवकों से परिधीय रक्त के नमूने एकत्र किए गए थे। मानकीकृत प्रक्रियाओं के बाद विभिन्न उपकरणों से अत्यधिक तुलनीय डेटा प्राप्त किया गया था, जो बहुआयामी आकलन के लिए सहायक है।
Protocol
Representative Results
Discussion
परिधीय रक्त लिम्फोसाइट उपसमुच्चय के इम्यूनोफेनोटाइपिंग बच्चों में टीकाकरण के बाद सेल-मध्यस्थता अनुकूली प्रतिरक्षा में परिवर्तन को समझने में मदद कर सकते हैं। नैदानिक अनुप्रयोगों में, अप्रत्याशित ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
आरडब्ल्यू को बीजिंग नेचुरल साइंस फाउंडेशन, चीन (नंबर 7222059), नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (नंबर 82002130) द्वारा समर्थित किया गया था, एक्सजेड को मेडिकल साइंसेज के लिए सीएएमएस इनोवेशन फंड (नंबर 2019-आई 2 एम -5-026) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
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