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Medicine

Registro ecocardiográfico en cerdos miniatura despiertos

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/64943
, , , , , ,
1Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute,University of Utah, 2Department of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy,University of Utah

Summary

Se describe una construcción de carro simple, construida para realizar ecocardiografía de investigación en minicerdos despiertos de pie, junto con consideraciones de construcción, técnicas de entrenamiento e imágenes de ultrasonido representativas.

Abstract

La ecocardiografía utiliza ondas ultrasónicas para evaluar de forma no invasiva la estructura y función cardíaca y es el estándar de atención para la evaluación y monitorización cardíaca. El cerdo miniatura, o minipig, se utiliza cada vez más como modelo de enfermedad cardíaca en la investigación médica. Los cerdos son notoriamente difíciles de sujetar y manejar de manera segura y, por lo tanto, la ecocardiografía de investigación en esta especie casi siempre se realiza bajo anestesia o sedación intensa. Los anestésicos y sedantes afectan universalmente la función cardiovascular y pueden causar depresión del gasto cardíaco y la presión arterial, aumentos o disminuciones en la frecuencia cardíaca y la resistencia vascular sistémica, cambios en el ritmo eléctrico y alteración del flujo sanguíneo coronario. Por lo tanto, la ecocardiografía sedada o anestesiada puede no representar con precisión la progresión de la enfermedad cardíaca en modelos animales grandes, lo que limita el valor traslacional de estos estudios importantes. Este artículo describe un nuevo dispositivo que permite la ecocardiografía de pie despierto en minicerdos. Además, se describen las técnicas de entrenamiento utilizadas para enseñar a los cerdos a tolerar este procedimiento indoloro y no invasivo sin la necesidad de anestésicos que alteren la hemodinámica. La ecocardiografía de pie despierto representa una forma segura y factible de realizar la prueba de monitorización cardíaca más común en minicerdos para la investigación cardiovascular.

Introduction

La insuficiencia cardíaca es una carga creciente para las instituciones médicas en los Estados Unidos y en el extranjero, con una prevalencia mundial de 38 millones de pacientes1. Aproximadamente 19 millones de muertes en todo el mundo se atribuyeron a enfermedades cardiovasculares en 2020, lo que demuestra un aumento del 18,7% desde 20102. El desarrollo de nuevas terapias es lento para ponerse al día con esta tendencia alarmante. La insuficiencia cardíaca es, por lo tanto, un área crítica de investigación, y la importancia de las herramientas de alta fidelidad para capturar el desarrollo y la progresión de la enfermedad no puede ser exagerada.

La ecocardiografía es actualmente la herramienta clínicamente más importante para medir de forma no invasiva la progresión de la enfermedad cardíaca, pero en modelos de investigación con animales grandes, puede ser difícil de implementar3. La ecocardiografía utiliza ondas ultrasónicas para evaluar la estructura y función cardíaca y es el estándar de atención en el ámbito clínico para la evaluación y monitorización cardíaca4. Los modelos animales preclínicos grandes de enfermedades cardíacas, como los cerdos, desempeñan un papel crítico en la traducción de la ciencia básica al desarrollo de la terapéutica cardiovascular5. Se deduce, entonces, que traducir la ecocardiografía a modelos animales grandes en el desarrollo de estas terapias es una parte importante de este esfuerzo crítico.

Los cerdos son una de varias especies comúnmente utilizadas como modelos animales grandes de isquémica, sobrecarga de presión y simulaciones de ritmo rápido de insuficiencia cardíaca 5,6. Los cerdos son especialmente importantes en los estudios preclínicos, ya que los mecanismos compensatorios neurohormonales y la remodelación cardíaca reflejan estrechamente la fisiopatología humana 6,7. Más recientemente, los cerdos miniatura, o minipigs, han demostrado ser prometedores como un modelo de comorbilidades múltiples de enfermedad cardíaca, con obesidad, hipertensión, hipercolesterolemia y diabetes que resultan confiablemente en disfunción cardíaca y remodelación 8,9.

La realización segura de ecocardiografía en la mayoría de los animales grandes requiere sedación intensa o anestesia general. Sin embargo, todos los fármacos anestésicos y sedantes deprimen la función cardíaca de manera dosis-dependiente10,11. Los anestésicos y sedantes pueden causar depresión del gasto cardíaco y de la presión arterial, aumento o disminución de la frecuencia cardíaca y de la resistencia vascular sistémica, cambios en el ritmo eléctrico y alteración del flujo sanguíneo coronario12. En la mayoría de los casos, los anestésicos reducen el tono simpático, disminuyendo el retorno venoso y disminuyendo la presión arterial13. Es importante destacar que los anestésicos también afectan los parámetros ecocardiográficos, complicando la interpretación de este examen en el monitoreo de la enfermedad cardíaca en modelos animales14. La ecocardiografía despierta es la representación más cercana de la función cardíaca nativa.

Aquí se describe un dispositivo de restricción porcina, fácilmente aceptado por los minicerdos despiertos, que se puede utilizar para el monitoreo ecocardiográfico básico sin requerir la administración de anestésicos que alteran la hemodinámica.

Protocol

La construcción y el uso del carro de ecocardiografía se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares de manejo y entrenamiento de animales del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Utah. 1. Consideraciones para construir el carro de ecocardiografía Construir un artilugio que permita el acceso a las ventanas de imágenes de ecocardiografía lateral y ventral de pie. Use un carrito con lados altos, frente y espalda para evitar que los cerdos trepen o salten durante la ecocardiografía. Use un carro ajustable a lo largo y ancho para acomodar cerdos de varios tamaños y edades; Sin embargo, en estudios de investigación en los que todos los cerdos son del mismo tamaño, raza y edad, esto puede no ser necesario. Procure una rampa antideslizante para montar y desmontar el carro. Los cerdos prefieren caminar hacia adelante, por lo que un desmonte hacia atrás no es deseable. En este ejemplo, se utilizó una rampa desmontable, de modo que podría desconectarse de un extremo después de montar el carro y luego moverse al otro extremo del carro para desmontarlo. Use un carro con ruedas con ruedas de bloqueo, ya que esto permite que el artilugio se mueva del almacenamiento a la habitación del animal. Para cumplir con las normas de limpieza y desinfección del vivero, utilice material de plástico, metal y caucho. Finalmente, incluya un comedero desmontable en la parte delantera del carro para proporcionar a los cerdos una distracción durante la ecocardiografía. 2. Especificaciones de construcción de carros NOTA: Los cerdos utilizados en nuestro estudio fueron cerdos miniatura de Yucatán y Gotinga de 5 a 10 meses de edad, y, por lo tanto, nuestro carro fue construido con este tamaño en mente. Si bien se podría construir una estructura similar desde cero, para disminuir parte del trabajo de construcción, comience desde un carro utilitario de servicio pesado prefabricado (Figura 1). Se recomienda bloquear las ruedas. Cortar y quitar la parte delantera y trasera del carro de servicios públicos, y reemplazar con puertas construidas de tubería de PVC y eslabón de cadena. Utilice el material de eslabón de la cadena para colgar un comedero con ganchos o mosquetones (Figura 2). Con la eliminación de la parte delantera y trasera, la integridad y la resistencia de sujeción del plástico se reducen, por lo que para cerdos más grandes y pesados, refuerce con barras de metal en la parte inferior de los estantes del carro. Cree una abertura en el piso superior del carro que sea lo suficientemente grande como para pasar una mano sosteniendo una sonda de ultrasonido. Conserve una cubierta de plástico ajustada a la parte superior de la abertura, que se pueda quitar para el acceso a la ecocardiografía subxifoidea una vez que los cerdos estén de pie de forma segura en el carro (Figura 3). Como ajuste personalizado, use culata de aluminio (por ejemplo, tubo cuadrado, barra y chapa metálica) para construir una rampa de montaje / desmontaje de metal con refuerzos para sujetar al carro modificado en ciertos puntos de fijación. Agregue un acolchado de goma extraíble para el agarre con pernos y ojales (Figura 4). Cree un mecanismo de bisagra para las puertas laterales, con pasadores simples utilizados para estrechar el área de pie del cerdo para mejorar la sujeción (Figura 5). Esto proporciona un ajuste perfecto para el cerdo dentro del carro y asegura que los cerdos estén sujetos en una dirección orientada hacia adelante sin la capacidad de darse la vuelta. 3. Entrenar a los minipigs para que se paren en el carro Los cerdos deben ser entrenados para comer del comedero durante un período prolongado de tiempo, subir la rampa y bajar la rampa. Llenar el comedero con una golosina congelada prolonga el tiempo de reposo de los cerdos. Use combinaciones como jugo, bebida de reemplazo de comidas o yogur con cereales y comida estándar, galletas y / o barras de frutas. Congele estas combinaciones juntas para crear comederos congelados de larga duración (Figura 6). Otra opción a considerar es retener la comida normal del animal y en su lugar alimentarlo en el comedero del carrito durante el período de ecocardiografía. Antes de enseñar a los cerdos a comer las golosinas congeladas en el artilugio, introduzca los comederos congelados en el suelo, fomentando el reconocimiento del comedero como una golosina de alto valor. Entrene a los cerdos para que acepten ecocardiogramas de pie durante 5-7 días, con una sesión de entrenamiento por día. Realice los pasos siguientes para ello.Introduzca a los cerdos en el carro rodeando el carro con golosinas de alto valor (galletas o cereales) durante 1-2 días. Introduzca a los cerdos en la rampa durante 1-2 días colocando golosinas de alto valor a lo largo de la rampa y proporcionando recompensas adicionales cuando los cerdos suban por la rampa. Permita que los cerdos se paren en el carro sin activar las restricciones laterales o las puertas (que pueden inducir miedo), y proporcione comederos congelados en la puerta principal durante 2-3 días. Durante los últimos 1-2 días, mientras los cerdos comen de los comederos, coloque la sonda de ultrasonido con gel de ultrasonido sobre los cerdos para acostumbrarlos a la sensación de contacto con la sonda. Después de este régimen de entrenamiento, los cerdos permitirán fácilmente que se cierren las restricciones y las puertas y se realice un ultrasonido para la adquisición de imágenes de ecocardiografía. 4. Adquisición de imágenes Obtenga imágenes en el carro de ecocardiografía, lo que permite el posicionamiento de la sonda en las siguientes posiciones, como se describe a continuación.Tome imágenes a través de los lados del carro a la axila derecha e izquierda. Estas posiciones se utilizan para obtener los planos de imagen paraesternal derecho e izquierdo. Tome imágenes a través del piso del carro hasta la región subxifoidea para obtener vistas apicales. Tome imágenes para imágenes en modo B y modo M desde estas posiciones de pie. Para un procedimiento simulado de grabación de eco despierto, consulte el Vídeo 1. En el video, el sujeto animal está representado por una muñeca minipig de tamaño real, restringida como un minipig real con espacio de movimiento limitado en el carrito. También se muestra la mejor ventana de acceso y el posicionamiento de la sonda de ecocardiografía de grabación.

Representative Results

Aquí se presentan las imágenes representativas adquiridas en un minipig de Yucatán a los 8 meses de edad aproximadamente. El animal nunca fue sedado y estaba disfrutando de alimentos o comederos congelados durante la adquisición de la imagen. El carro de ecocardiografía es principalmente útil para obtener imágenes simples para calcular los volúmenes de la cámara ventricular izquierda y la fracción de eyección (FE) de imágenes y videos en modo B o M. Las imágenes más sensibles, como las imágenes vasculares o el Doppler tisular, pueden resultar demasiado desafiantes con esta técnica, ya que los cerdos despiertos conservan una movilidad limitada y el marco de tiempo de imágenes está limitado por la duración de la alimentación. El laboratorio utiliza una máquina de ultrasonido junto a la cama sin capacidades de análisis de imágenes post-hoc. Por lo tanto, los videos y las imágenes fijas requieren procesamiento utilizando software de edición y medición utilizando un software de análisis de imágenes científicas. Se obtuvieron imágenes en modo M de vista transversal de eje corto (Figura 7) a través de los lados del carro, que se utilizaron para el análisis del diámetro interno del ventrículo izquierdo en sístole y diástole (LVIDs y LVIDd, respectivamente) y el posterior cálculo de la fracción de eyección (FE), donde EF = (EDV – ESV)/EDV × 100% (EDV: volumen diastólico final; ESV: volumen sistólico final) basado en volúmenes calculados con la fórmula de Teichholz (volumen = 7D3/[2,4 + D]) (D: diámetro lineal del VI)15. En la Tabla 1 se incluyen datos representativos generados a partir de cuatro exploraciones en modo M obtenidas de dos minicerdos, así como datos generados a partir de exploraciones en modo M registradas de los mismos animales durante sesiones de eco sedadas. Como era de esperar, la FE generada a partir de sesiones de eco sedado tendió a ser menor que la FE de la sesión de eco consciente. También se obtuvieron imágenes paraesternales en modo B de vista de eje largo desde los lados del carro (Figura 8). El método de longitud de área para calcular el FE fue utilizado con estas imágenes en modo B16. En primer lugar, el VED ventricular izquierdo se calculó a partir de la longitud del eje mayor del ventrículo izquierdo diastólico final y el área de la cámara utilizando la fórmula VED = (0,85 × área2)/longitud. La VSE ventricular izquierda se calculó de la misma manera utilizando las mediciones sistólicas. La fracción de eyección se calculó entonces como EF = (EDV – ESV)/EDV × 100%. Los datos representativos generados a partir de ocho escaneos en modo B obtenidos de dos minipigs se incluyen en la Tabla 2. A modo de comparación, también se incluyen los datos generados a partir de exploraciones en modo B registradas de los mismos animales durante las sesiones de eco sedado. Usando las imágenes en modo B, la EF generada a partir de sesiones de eco sedado y consciente se emparejó estrechamente entre sí (Tabla 2). Figura 1: Vista lateral del carro de ecocardiografía. El carro de ecocardiografía se construye utilizando un carro utilitario de servicio pesado prefabricado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Vista de la cabeza del carro de ecocardiografía. La parte delantera y trasera del carro prefabricado se reemplazan con puertas batientes hechas de tubería de PVC y eslabón de cadena (A), que también acomoda un comedero colgante (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Vista superior del carro de ecocardiografía. Se crea una abertura en el piso superior del carro para pasar una mano que sostiene una sonda de ultrasonido. Se instala una pieza de plástico para un montaje y desmontaje seguros del carro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Rampa de aluminio. Una rampa de aluminio está unida a la parte delantera o trasera del carro, y se agrega acolchado de goma extraíble para el agarre con pernos y ojales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Puerta lateral. Las bisagras se crean para las puertas laterales, con pasadores para permitir un tamaño y una restricción más precisos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Golosinas para sesiones de eco consciente. Las combinaciones de jugo, bebida de reemplazo de comida o yogur combinadas con cereales y comida estándar, galletas y / o barras de frutas se congelan para crear comederos congelados de larga duración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Un escaneo representativo del modo M obtenido de un animal consciente. Análisis de imagen de muestra para calcular la fracción de eyección del ventrículo izquierdo a partir de imágenes en modo M. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8: Un escaneo representativo en modo B obtenido de un animal consciente. Análisis de imagen de muestra para calcular la fracción de eyección del ventrículo izquierdo a partir de imágenes en modo B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Media ± SD LVIDd (cm) LVIDs (cm) FE (%) Eco consciente (N=4/2) 3,8 ± 0,5 2.5 ± 0.5 64,3 ± 5,4 Eco sedado (N=4/2) 3.9 ± 0.2 3.0 ± 0.0 48,5 ± 7,9 EF: fracción de eyección; DE: desviación estándar. N = 4 ecoexploraciones obtenidas de dos animales Tabla 1: Comparación de los parámetros generados a partir de imágenes en modo M registradas en minipigs sedados versus minipigs conscientes confinados en el carro. LV-MALd (cm) LV-MALs (cm) LV-CAd (cm2) LV-CA (cm2) FE (%) Eco consciente (N=8/2) 5,8 ± 0,8 4,5 ± 0,6 18,6 ± 5,0 10,7 ± 2,8 57,3 ± 5,2 Eco sedado (N=8/2) 5,9 ± 0,5 4,8 ± 0,4 21,8 ± 2,7 13.1 ± 2.4 55,3 ± 9,0 LV-MAL: longitud del eje mayor del ventrículo izquierdo; LV-CA: área de la cámara ventricular izquierda; EF: fracción de eyección; DE: desviación estándar. N=8 ecoexploraciones obtenidas de 2 animales Tabla 2: Comparación de los parámetros generados a partir de imágenes en modo B registradas en minipigs sedados versus minipigs conscientes confinados en el carro. Video 1: Un procedimiento simulado de registro de ecocardiograma despierto realizado en una muñeca minipig de tamaño real usando el carrito de ecocardiografía. Haga clic aquí para descargar este video.

Discussion

El carro de ecocardiografía representa un método fácilmente replicable para monitorear la estructura y función del corazón en un importante modelo de investigación cardíaca, el minipig. La novedad del carro radica en la capacidad de capturar imágenes ecocardiográficas sin su mayor advertencia: la necesidad de usar anestésicos o sedantes que cambian la función cardíaca de los animales y alteran las mismas medidas utilizadas para evaluar los efectos de la terapéutica cardíaca. Además, el carro es seguro, económico y un objetivo de entrenamiento fácil para los cerdos.

Los autores primero identificaron las características deseadas del carro y luego trabajaron estrechamente con un carpintero para diseñar el producto. Las técnicas estándar de entrenamiento de refuerzo positivo fueron fáciles y rápidas para enseñar a los cerdos a aceptar sin miedo el carro y utilizarlo. Con la práctica de la ecografía, los autores pudieron encontrar y registrar rápidamente planos de imágenes de ecocardiografía bidimensionales estándar para su posterior procesamiento. Durante estos ecocardiogramas de pie, nunca se administraron sedantes o anestésicos y, por lo tanto, los videos y las imágenes fueron representativos de la función cardíaca despierta.

La construcción del carro de ecocardiografía es relativamente simple para un carpintero o personal de mantenimiento experimentado después de identificar las características clave importantes para el grupo de investigación (por ejemplo, ajuste de tamaño, altura o puntos de acceso de la sonda de ultrasonido). Durante el proceso de construcción, las características del carro se pueden modificar para adaptarse a las necesidades individuales de los laboratorios. Los materiales son en gran medida baratos, y la construcción del carro puede ahorrar en el costo de realizar ecocardiogramas con los sedantes y anestésicos que se usan normalmente.

Las limitaciones de la técnica incluían el movimiento y el marco de tiempo limitado para obtener las imágenes. Si bien el carro se podía ajustar a diferentes tamaños para contener a los cerdos, y mientras que los animales no podían darse la vuelta y solo podían moverse unos centímetros en cada dirección, los animales aún eran capaces de moverse dentro de los límites del carro. Una puerta principal, un paracaídas de compresión o un poste, como los que se usan con animales de granja, podrían proporcionar una mejor restricción con capacitación adicional. Del mismo modo, las imágenes exitosas se basaron en que los animales se distraían con su alimentación o golosinas congeladas durante los ecocardiogramas. Por lo general, esto permitió aproximadamente 15 minutos de imágenes, lo que no siempre fue suficiente para obtener todas las imágenes deseadas. La capacidad de reemplazar fácilmente el comedero o agregar alimento mientras el animal permaneció restringido puede tener una duración prolongada de la imagen. Finalmente, debido a las dos limitaciones anteriores, las técnicas de imagen más sensibles, como el Doppler tisular, resultaron difíciles de realizar en el carro de ecocardiografía de pie.

Otros modelos experimentales porcinos a menudo utilizan técnicas de manipulación no anestésica, como la eslinga Panepinto17 disponible comercialmente. Sin embargo, los autores encontraron que la técnica del cabestrillo era más engorrosa para entrenar cerdos, y el cabestrillo no proporcionó al ultrasonógrafo acceso a los planos de imagen necesarios para la ecocardiografía. Otras aplicaciones potenciales para el carro de ecocardiografía podrían incluir otros procedimientos no dolorosos, como la ecografía abdominal, la observación de lesiones cutáneas o la obtención de muestras de sangre de un puerto de acceso vascular. Los autores a menudo utilizan el carro para sujetar fácilmente a los cerdos para realizar electrocardiogramas y programar marcapasos, por ejemplo.

En conclusión, la técnica de ecocardiografía despierta descrita es fácil de realizar y valiosa para obtener imágenes ecográficas básicas del corazón sin la depresión cardiovascular típica del uso anestésico o sedante. Esta técnica se puede utilizar para comparar imágenes anestesiadas con imágenes despiertas en animales grandes o para el monitoreo diario de la progresión de la enfermedad cardíaca en el valioso modelo traslacional preclínico porcino de enfermedad cardíaca e insuficiencia cardíaca.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los fondos para esta investigación incluyen NIH-T32 (T.H.), R01HL133286 (TT.H.), R01HL094414 (R.M.S.), R01HL138577 (R.M.S.), R01HL159983 y R21AG074593 (R.M.S. y TT.H.). Extendemos nuestra gratitud a todos los miembros del grupo de investigación, investigadores adjuntos y personal del Instituto de Investigación y Capacitación Cardiovascular Nora Eccles Harrison y Medicina Comparada de la Universidad de Utah. También nos gustaría extender nuestro agradecimiento al Dr. Joseph Palatinus MD PhD por su valiosa capacitación y asistencia en ecocardiografía.

Materials

Access Ramp N/A – shop built 58" L x 18" W. Rise of 19" not to exceed 22.5 degree angle. Any removable aluminum ramp with capacity to hold weight of pigs
Fence Feeder with Clips DuraFlex  E011772 Feed trough with clips for hanging on chain link, used for frozen treats or feed to distract pigs during echocardiography
Heavy Duty Utility Cart Baxter Medical Equipment & Supplies Cart # unk / 45x25x33"; Pipes, sch 40 PVC  Made of heavy plastic, with three shelves
Image Analysis Software Image J FIJI  https://imagej.net/software/fiji/ Free scientific image analysis software
Lumify Ultrasound with S4-1 Phased Array Transducer Philips FUS6884 Handheld bedside ultrasound with cardiac probe, used with a tablet device and proprietary software
Video Editing Software Adobe Premiere Pro 2022 https://www.adobe.com/products/premiere.html Commen software part of Adobe Creative Cloud.
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Hogen, T., Li, J., Balmaceda, P., Ha, T., Brown, G. W., Shaw, R. M., Hong, T. Echocardiography Recording in Awake Miniature Pigs. J. Vis. Exp. (195), e64943, doi:10.3791/64943 (2023).
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