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Registro ecocardiográfico em porcos em miniatura acordados

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/64943
, , , , , ,
1Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute,University of Utah, 2Department of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy,University of Utah

Summary

Uma construção de carrinho simples, construída para realizar ecocardiografia de pesquisa em miniporcos acordados em pé, é descrita, juntamente com considerações de construção, técnicas de treinamento e imagens de ultrassom representativas.

Abstract

A ecocardiografia utiliza ondas ultra-sônicas para avaliar de forma não invasiva a estrutura e a função cardíaca e é o padrão de tratamento para avaliação e monitoramento cardíaco. O porco em miniatura, ou miniporco, está sendo cada vez mais usado como modelo de doença cardíaca na pesquisa médica. Os porcos são notoriamente difíceis de conter e manusear com segurança e, portanto, a pesquisa ecocardiográfica nesta espécie é quase sempre realizada sob anestesia ou sedação pesada. Os anestésicos e sedativos afetam universalmente a função cardiovascular e podem causar depressão do débito cardíaco e da pressão arterial, aumento ou diminuição da frequência cardíaca e da resistência vascular sistêmica, alterações no ritmo elétrico e alteração do fluxo sanguíneo coronariano. Portanto, a ecocardiografia sedada ou anestesiada pode não retratar com precisão a progressão da doença cardíaca em modelos animais de grande porte, limitando o valor translacional desses importantes estudos. Este artigo descreve um novo dispositivo que permite a ecocardiografia em pé acordado em miniporcos. Além disso, são descritas técnicas de treinamento para ensinar porcos a tolerar esse procedimento indolor e não invasivo, sem a necessidade de anestésicos que alterem hemodinamicamente. A ecocardiografia em pé acordado representa uma maneira segura e viável de realizar o teste de monitorização cardíaca mais comum em miniporcos para pesquisa cardiovascular.

Introduction

A insuficiência cardíaca é uma carga crescente para as instituições médicas nos Estados Unidos e no exterior, com uma prevalência mundial de 38 milhões depacientes1. Aproximadamente 19 milhões de mortes no mundo foram atribuídas a doenças cardiovasculares em 2020, demonstrando um aumento de 18,7% em relação a 20102. O desenvolvimento de novas terapias demora a acompanhar essa tendência alarmante. A insuficiência cardíaca é, portanto, uma área crítica de pesquisa, e a importância de ferramentas de alta fidelidade para capturar o desenvolvimento e a progressão da doença não pode ser exagerada.

A ecocardiografia é atualmente a ferramenta clinicamente mais importante para medir de forma não invasiva a progressão da doença cardíaca, mas em modelos de pesquisa com grandes animais, sua implementação pode ser desafiadora3. A ecocardiografia utiliza ondas ultra-sônicas para avaliar a estrutura e a função cardíaca e é o padrão de tratamento no ambiente clínico para avaliação e monitorização cardíaca4. Modelos pré-clínicos de doenças cardíacas de grandes animais, como suínos, desempenham um papel crítico na tradução da ciência básica para o desenvolvimento de terapêuticas cardiovasculares5. Conclui-se, então, que a tradução da ecocardiografia para modelos animais de grande porte no desenvolvimento dessas terapêuticas é parte importante desse esforço crítico.

Os suínos são uma das várias espécies comumente utilizadas como modelos animais de grande porte de simulações isquêmicas, de sobrecarga pressórica e de ritmo rápido de insuficiência cardíaca 5,6. Os suínos são especialmente importantes em estudos pré-clínicos, pois os mecanismos compensatórios neuro-hormonais e o remodelamento cardíaco espelham de perto a fisiopatologia humana 6,7. Mais recentemente, porcos em miniatura, ou miniporcos, têm se mostrado promissores como um modelo de múltiplas comorbidades de doença cardíaca, com obesidade, hipertensão, hipercolesterolemia e diabetes resultando de forma confiável em disfunção e remodelamento cardíaco 8,9.

A realização segura da ecocardiografia na maioria dos animais de grande porte requer sedação pesada ou anestesia geral. Entretanto, todos os fármacos anestésicos e sedativos deprimem a função cardíaca de forma dose-dependente10,11. Anestésicos e sedativos podem causar depressão do débito cardíaco e da pressão arterial, aumento ou diminuição da frequência cardíaca e da resistência vascular sistêmica, alterações do ritmo elétrico e alteração do fluxo sanguíneo coronariano12. Na maioria dos casos, os anestésicos reduzem o tônus simpático, diminuindo o retorno venoso e diminuindo a pressão arterial13. É importante ressaltar que os anestésicos também afetam os parâmetros ecocardiográficos, dificultando a interpretação desse exame na monitorização de doença cardíaca em modelos animais14. A ecocardiografia acordada é a representação mais próxima da função cardíaca nativa.

Descreve-se aqui um dispositivo de contenção porcina, prontamente aceito por miniporcos acordados, que pode ser usado para monitorização ecocardiográfica básica sem a necessidade da administração de anestésicos que alteram hemodinamicamente.

Protocol

A construção e o uso do carrinho de ecocardiografia foram realizados de acordo com as normas de manejo e treinamento de animais do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Utah. 1. Considerações para a construção do carrinho de ecocardiografia Construa uma engenhoca que permita o acesso às janelas de imagem da ecocardiografia lateral e ventral. Use um carrinho com laterais altas, frente e costas para evitar que os porcos subam ou saltem durante a ecocardiografia. Use um carrinho ajustável em comprimento e largura para acomodar porcos de vários tamanhos e idades; No entanto, em estudos de pesquisa em que todos os porcos são do mesmo tamanho, raça e idade, isso pode não ser necessário. Procure uma rampa antiderrapante para montagem e desmontagem do carrinho. Os porcos preferem andar para a frente, então um desmonte para trás é indesejável. Neste exemplo, uma rampa destacável foi utilizada, de modo que ela poderia ser desconectada de uma extremidade após a montagem do carrinho e, em seguida, movida para a outra extremidade do carrinho para desmontagem. Use um carrinho de rodas com rodas de travamento, pois isso permite que a engenhoca seja movida do armazenamento para o quarto dos animais. Para cumprir as normas de limpeza e desinfecção do biotério, use material plástico, metal e borracha. Finalmente, inclua um cocho de alimentação destacável na frente do carrinho para proporcionar aos porcos uma distração durante o ecocardiograma. 2. Especificações de construção do carrinho NOTA: Os porcos utilizados em nosso estudo foram suínos Yucatán e Gottingen em miniatura com idades entre 5 e 10 meses de idade e, portanto, nossa carroça foi construída com este tamanho em mente. Embora uma estrutura semelhante pudesse ser construída do zero, para diminuir parte do trabalho de construção, comece a partir de um carrinho de serviço pesado pré-fabricado (Figura 1). Rodas de travamento são recomendadas. Corte e retire a frente e a parte traseira do carrinho utilitário, e substitua por portões construídos com cano de PVC e elo de corrente. Use o material do elo de corrente para pendurar um cocho de alimentos usando ganchos ou mosquetões (Figura 2). Com a remoção da frente e de trás, a integridade e a resistência de retenção do plástico são reduzidas, portanto, para porcos maiores e mais pesados, reforce com barras metálicas na parte inferior das prateleiras do carrinho. Crie uma abertura no piso superior do carrinho que seja grande o suficiente para passar uma mão segurando uma sonda de ultrassom. Retenha uma peça plástica de tampa encaixada na parte superior da abertura, que pode ser removida para acesso à ecocardiografia subxifóide assim que os porcos estiverem em segurança no carrinho (Figura 3). Como um ajuste personalizado, use estoque de alumínio (por exemplo, tubo quadrado, barra e chapa metálica) para construir uma rampa de montagem/desmontagem de metal com reforços para anexar ao carrinho modificado em determinados pontos de fixação. Adicione estofamento de borracha removível para aderência usando parafusos e grommets (Figura 4). Crie um mecanismo de dobradiça para os portões laterais, com pinos simples usados para estreitar a área de pé do porco para melhorar a contenção (Figura 5). Isso proporciona um ajuste confortável para o porco dentro da carroça e garante que os porcos sejam contidos em uma direção voltada para a frente, sem a capacidade de se virar. 3. Treinar os miniporcos para ficarem em pé na carroça Os porcos devem ser treinados para comer do cocho por um período prolongado de tempo, subir a rampa e descer a rampa. Encher o cocho com uma guloseima congelada prolonga o tempo de pé dos porcos. Use combinações como suco, bebida substituta de refeição ou iogurte com cereais e ração padrão, biscoitos e/ou barras de frutas. Congele essas combinações para criar cochos de tratamento congelado de longa duração (Figura 6). Outra opção a considerar é reter a refeição normal do animal e, em vez disso, alimentá-lo no cocho no carrinho durante o período de ecocardiografia. Antes de ensinar os porcos a comer as guloseimas congeladas na engenhoca, introduza os cochos congelados no chão, incentivando o reconhecimento do cocho como fornecendo uma guloseima de alto valor. Treine os porcos para aceitar ecocardiogramas em pé por 5-7 dias, com uma sessão de treinamento por dia. Execute as seguintes etapas para fazer isso.Apresente os porcos ao carrinho cercando o carrinho com guloseimas de alto valor (biscoitos ou cereais) por 1-2 dias. Apresente os porcos na rampa por 1-2 dias, colocando guloseimas de alto valor ao longo da rampa e fornecendo recompensas adicionais quando os porcos subirem a rampa. Permita que os porcos fiquem em pé no carrinho sem acionar as restrições laterais ou portões (o que pode induzir medo), e forneça cochos congelados no portão da frente por 2-3 dias. Durante os últimos 1-2 dias, enquanto os porcos comem dos cochos, coloque a sonda de ultrassom com gel de ultrassom nos porcos para acostumá-los à sensação de contato com a sonda. Após esse regime de treinamento, os porcos permitirão facilmente que as contenções e portões sejam fechados e a ultrassonografia seja realizada para a aquisição de imagens ecocardiográficas. 4. Aquisição de imagens Obter imagens no carrinho de ecocardiografia, o que permite o posicionamento da sonda nas seguintes posições, conforme descrito a seguir.Tire imagens pelas laterais do carrinho nas axilas direita e esquerda. Essas posições são usadas para obter os planos paraesternais direito e esquerdo. Tire imagens através do chão do carrinho até a região subxifóide para obter vistas apicais. Tire imagens para imagens em modo B e modo M a partir dessas posições em pé. Para um procedimento simulado de gravação de eco acordado, consulte o Vídeo 1. No vídeo, o animal é representado por um boneco miniporco de tamanho real, limitado como um miniporco real com espaço de movimento limitado no carrinho. A melhor janela de acesso e posicionamento da sonda de gravação ecocardiográfica também são mostrados.

Representative Results

As imagens representativas adquiridas em um miniporco Yucatán com aproximadamente 8 meses de idade são apresentadas aqui. O animal nunca foi sedado e estava desfrutando de ração ou cochos congelados durante a aquisição das imagens. O carrinho de ecocardiografia é primariamente útil para a obtenção de imagens simples para o cálculo dos volumes das câmaras do ventrículo esquerdo e da fração de ejeção (FE) a partir de imagens e vídeos nos modos B ou M. Imagens mais sensíveis, como imagens vasculares ou Doppler tecidual, podem ser muito desafiadoras com essa técnica, pois os porcos acordados mantêm mobilidade limitada e o tempo de imagem é limitado pela duração da alimentação. O laboratório usa um aparelho de ultrassom à beira do leito sem recursos de análise de imagem post-hoc. Portanto, os vídeos e imagens estáticas requerem processamento usando software de edição e medição usando um software de análise científica de imagens. Imagens em modo M transversal de eixo curto (Figura 7) foram obtidas pelas laterais do carrinho, as quais foram utilizadas para a análise do diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole e diástole (IDVE e IDVE, respectivamente) e posterior cálculo da fração de ejeção (FE), onde FE = (VDE – VF)/VED × 100% (VDF: volume diastólico final; VSF: volume sistólico final) com base nos volumes calculados pela fórmula de Teichholz (volume = 7D3/[2,4 + D]) (D: diâmetro linear do VE)15. Dados representativos gerados a partir de quatro varreduras em modo M obtidos de dois miniporcos estão incluídos na Tabela 1, bem como dados gerados a partir de varreduras em modo M registrados dos mesmos animais durante sessões de eco sedados. Como esperado, a FE gerada a partir de sessões de eco sedadas tendeu a ser menor do que a FE da sessão de eco consciente. Imagens modo-B em eixo longo paraesternal também foram obtidas nas laterais do carrinho (Figura 8). O método área-comprimento para o cálculo da FE foi utilizado com essas imagensmodo-B16. Primeiro, o VDF do ventrículo esquerdo foi calculado a partir do comprimento diastólico final do eixo principal do ventrículo esquerdo e da área da câmara usando a fórmula VDF = (0,85 × área2)/comprimento. A VSF do ventrículo esquerdo foi calculada da mesma forma por meio das medidas sistólicas. A fração de ejeção foi então calculada como FE = (EDV – ESV)/EDV × 100%. Os dados representativos gerados a partir de oito varreduras em modo B obtidos de dois miniporcos estão incluídos na Tabela 2. Para comparação, também são incluídos dados gerados a partir de varreduras em modo B gravadas dos mesmos animais durante sessões de eco sedado. Utilizando as imagens modo-B, as FE geradas a partir das sessões de eco sedado e consciente foram estreitamente pareadas entre si (Tabela 2). Figura 1: Vista lateral do carrinho de ecocardiografia. O carrinho de ecocardiografia é construído usando um carrinho utilitário pesado pré-fabricado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Vista cefálica do carrinho de ecocardiografia. A frente e a parte traseira do carrinho pré-fabricado são substituídas por portões articulados feitos de tubo de PVC e elo de corrente (A), que também acomoda um cocho de alimentos suspenso (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Vista superior do carrinho de ecocardiografia. Uma abertura é criada no piso superior do carrinho para passar uma mão segurando uma sonda de ultrassom. Uma peça de plástico é montada para montagem e desmontagem segura do carrinho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Rampa de alumínio. Uma rampa de alumínio é fixada à frente ou atrás do carrinho, e o estofamento de borracha removível é adicionado para aderência usando parafusos e grommets. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Portão lateral. As dobradiças são criadas para os portões laterais, com pinos para permitir um dimensionamento e retenção mais precisos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Tratamento para sessões de eco consciente. Combinações de suco, bebida substituta de refeição ou iogurte combinadas com cereais e ração padrão, biscoitos e/ou barras de frutas são congeladas para criar cochos congelados de longa duração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: Varredura representativa do modo M obtida de um animal consciente. Análise de imagens de amostras para cálculo da fração de ejeção do ventrículo esquerdo a partir de imagens modo-M. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8: Varredura representativa do modo B obtida de um animal consciente. Análise de imagens para cálculo da fração de ejeção do ventrículo esquerdo a partir do modo B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Média ± DP LVIDd (cm) LVIDs (cm) FE (%) Eco Consciente (N=4/2) 3,8 ± 0,5 2.5 ± 0.5 64,3 ± 5,4 Eco sedado (n=4/2) 3.9 ± 0.2 3,0 ± 0,0 48,5 ± 7,9 FE, fração de ejeção; DP, desvio padrão. N = 4 ecoexames obtidos de dois animais Tabela 1: Comparação dos parâmetros gerados a partir de imagens em modo M registradas em miniporcos sedados versus miniporcos conscientes constrangidos no carrinho. MAL-MALd LV (cm) MAL-MAL LV (cm) VE-CAd (cm2) AC-VE (cm2) FE (%) Eco Consciente (N=8/2) 5.8 ± 0.8 4,5 ± 0,6 18,6 ± 5,0 10.7 ± 2.8 57,3 ± 5,2 Eco sedado (n=8/2) 5,9 ± 0,5 4.8 ± 0.4 21,8 ± 2,7 13.1 ± 2.4 55.3 ± 9.0 MAL-VE, comprimento do eixo maior do ventrículo esquerdo; VE-AC, área da câmara ventricular esquerda; FE, fração de ejeção; DP, desvio padrão. N=8 ecovarreduras obtidas de 2 animais Tabela 2: Comparação dos parâmetros gerados a partir de imagens em modo B registradas em miniporcos sedados versus miniporcos conscientes constrangidos no carrinho. Vídeo 1: Simulado de gravação de ecocardiograma acordado realizado em boneca miniporco de tamanho real utilizando o carrinho de ecocardiografia. Clique aqui para baixar este vídeo.

Discussion

O carrinho de ecocardiografia representa um método facilmente replicável para monitorar a estrutura e função cardíaca em um importante modelo de pesquisa cardíaca, o miniporco. A novidade do carrinho está na capacidade de captar imagens ecocardiográficas sem sua maior ressalva: a necessidade do uso de anestésicos ou sedativos que alterem a função cardíaca dos animais e alterem as próprias medidas utilizadas para avaliar os efeitos da terapêutica cardíaca. Além disso, o carrinho é seguro, barato e um alvo de treinamento fácil para porcos.

Os autores primeiro identificaram as características desejadas do carrinho e, em seguida, trabalharam em estreita colaboração com um carpinteiro para projetar o produto. As técnicas padrão de treinamento de reforço positivo foram fáceis e rápidas para ensinar os porcos a aceitar sem medo o carrinho e utilizá-lo. Com a prática ultrassonográfica, os autores foram capazes de encontrar e registrar rapidamente planos de imagem ecocardiográficos bidimensionais padrão para processamento posterior. Durante esses ecocardiogramas em pé, nunca foram administrados sedativos ou anestésicos e, portanto, os vídeos e imagens eram representativos da função cardíaca acordada.

A construção do carrinho de ecocardiografia é relativamente simples para um carpinteiro ou faz-tudo experiente depois de identificar as principais características importantes para o grupo de pesquisa (por exemplo, ajuste de tamanho, altura ou pontos de acesso à sonda de ultrassom). Durante o processo de construção, as características do carrinho podem ser alteradas para atender às necessidades individuais dos laboratórios. Os materiais são em grande parte baratos, e a construção do carrinho pode economizar no custo da realização de ecocardiogramas com os sedativos e anestésicos normalmente usados.

As limitações da técnica incluíram o movimento e o tempo limitado para obtenção das imagens. Enquanto a carroça podia ser ajustada para tamanhos variados para conter os porcos, e enquanto os animais não podiam se virar e só podiam se mover alguns centímetros em cada direção, os animais ainda eram capazes de se mover dentro dos limites da carroça. Um headgate, squeeze chute ou stanchion, como os usados com animais de fazenda, poderiam potencialmente fornecer melhor contenção com treinamento adicional. Da mesma forma, o sucesso da imagem dependia de os animais serem distraídos por sua ração ou guloseimas congeladas durante os ecocardiogramas. Tipicamente, isso permitia aproximadamente 15 min de imagem, o que nem sempre era suficiente para a obtenção de todas as imagens desejadas. A capacidade de substituir facilmente o cocho de alimento ou adicionar ração enquanto o animal permaneceu contido pode ter duração de imagem prolongada. Finalmente, devido a ambas as limitações acima, técnicas de imagem mais sensíveis, como o Doppler tecidual, mostraram-se difíceis de serem realizadas no carrinho de ecocardiografia em pé.

Outros modelos experimentais suínos frequentemente utilizam técnicas de manipulação não anestésicas, como a tipoia de Panepinto disponível comercialmente17. No entanto, os autores acharam a técnica de sling mais complicada para o treinamento de porcos, e a tipoia não forneceu ao ultrassonografista acesso aos planos de imagem necessários para a ecocardiografia. Outras aplicações potenciais para o carrinho de ecocardiografia podem incluir outros procedimentos não dolorosos, como ultrassonografia abdominal, observação de lesões cutâneas ou obtenção de amostras de sangue de uma via de acesso vascular. Os autores frequentemente utilizam o carrinho para conter facilmente porcos para realizar eletrocardiogramas e programar marca-passos, por exemplo.

Em conclusão, a técnica de ecocardiografia acordada descrita é de fácil execução e valiosa para a obtenção de imagens ultrassonográficas básicas do coração sem a depressão cardiovascular típica do uso de anestésicos ou sedativos. Essa técnica pode ser utilizada para comparar imagens anestesiadas com imagens acordadas em animais de grande porte ou para o monitoramento diário da progressão da doença cardíaca no valioso modelo translacional pré-clínico porcino de doença cardíaca e falência.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O financiamento para esta pesquisa inclui NIH-T32 (T.H.), R01HL133286 (TT.H.), R01HL094414 (R.M.S.), R01HL138577 (R.M.S.), R01HL159983 e R21AG074593 (R.M.S. e TT.H.). Estendemos nossa gratidão a todos os membros do grupo de pesquisa, pesquisadores adjuntos e funcionários do Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute and Comparative Medicine da Universidade de Utah. Também gostaríamos de estender nosso agradecimento ao Dr. Joseph Palatinus, MD, PhD, por seu valioso treinamento e assistência em ecocardiografia.

Materials

Access Ramp N/A – shop built 58" L x 18" W. Rise of 19" not to exceed 22.5 degree angle. Any removable aluminum ramp with capacity to hold weight of pigs
Fence Feeder with Clips DuraFlex  E011772 Feed trough with clips for hanging on chain link, used for frozen treats or feed to distract pigs during echocardiography
Heavy Duty Utility Cart Baxter Medical Equipment & Supplies Cart # unk / 45x25x33"; Pipes, sch 40 PVC  Made of heavy plastic, with three shelves
Image Analysis Software Image J FIJI  https://imagej.net/software/fiji/ Free scientific image analysis software
Lumify Ultrasound with S4-1 Phased Array Transducer Philips FUS6884 Handheld bedside ultrasound with cardiac probe, used with a tablet device and proprietary software
Video Editing Software Adobe Premiere Pro 2022 https://www.adobe.com/products/premiere.html Commen software part of Adobe Creative Cloud.
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Hogen, T., Li, J., Balmaceda, P., Ha, T., Brown, G. W., Shaw, R. M., Hong, T. Echocardiography Recording in Awake Miniature Pigs. J. Vis. Exp. (195), e64943, doi:10.3791/64943 (2023).
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