Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi
Summary
Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans’ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.
Abstract
Kalsiyum (Ca 2 +) görüntüleme, nöronal aktiviteyi incelemek için büyük ölçüde kullanılmıştır, ancak hücre altı Ca2 + kullanımının hücre içi sinyallemenin çok önemli bir bileşeni olduğu giderek daha açık hale gelmektedir. Nöronların yerli, bozulmamış devrelerinde incelenebildiği hücre altıCa2 + dinamiklerinin in vivo olarak görselleştirilmesi, karmaşık sinir sistemlerinde teknik olarak zor olduğunu kanıtlamıştır. Nematodun Caenorhabditis elegans’ın saydamlığı ve nispeten basit sinir sistemi, floresan etiketlerinin ve göstergelerinin hücreye özgü ekspresyonunu ve in vivo görselleştirilmesini sağlar. Bunlar arasında, sitoplazmada ve mitokondri gibi çeşitli hücre altı bölmelerde kullanılmak üzere modifiye edilmiş floresan göstergeler bulunmaktadır. Bu protokol, Ca 2+ dinamiklerinin bireysel dendritik dikenler ve mitokondri seviyesine kadar analizine izin veren bir hücre altı çözünürlükle in vivo olarak orantısız Ca2 + görüntülemeyi mümkün kılar. Burada, farklı Ca 2 + afinitelerine sahip iki mevcut genetik olarak kodlanmış gösterge, bu protokolün tek bir uyarıcı internöron çiftinde (AVA) sitoplazma veya mitokondriyal matris içindeki göreceli Ca2 + seviyelerini ölçmek için kullanımını göstermek için kullanılır. C. elegans’ta mümkün olan genetik manipülasyonlar ve uzunlamasına gözlemlerle birlikte, bu görüntüleme protokolü, Ca2+ kullanımının nöronal fonksiyonu ve plastisiteyi nasıl düzenlediğine ilişkin soruları cevaplamak için yararlı olabilir.
Introduction
Kalsiyum iyonları (Ca2+), birçok hücre tipinde çok yönlü bilgi taşıyıcılarıdır. Nöronlarda, Ca2+, nörotransmitterlerin aktiviteye bağlı salınımından, sitoiskelet motilitesinin düzenlenmesinden, metabolik süreçlerin ince ayarından ve ayrıca uygun nöronal bakım ve fonksiyon 1,2 için gerekli diğer birçok mekanizmadan sorumludur. Etkili hücre içi sinyalleşmeyi sağlamak için, nöronlar sitoplazma3’lerinde düşük bazal Ca2 + seviyelerini korumalıdır. Bu, Ca2 + ‘nın endoplazmik retikulum (ER) ve mitokondri gibi organellere alımı da dahil olmak üzere işbirlikçi Ca2 + taşıma mekanizmaları ile gerçekleştirilir. Bu işlemler, plazma zarındakiCa2 + geçirgen iyon kanallarının düzenlenmesine ek olarak, nöron boyunca heterojen sitoplazmik Ca2 + seviyelerine neden olur.
Dinlenme ve nöronal aktivasyon sırasında Ca 2 + heterojenliği, Ca2 + bağımlı mekanizmaların çeşitli, yere özgü düzenlenmesine izin verir1. Ca 2 + ‘nın konsantrasyona özgü etkilerinin bir örneği, Ca2 + ‘nın ER’den inositol 1,4,5-trisfosfat (InsP3) reseptörleri yoluyla salınmasıdır. Reseptörün kalsiyum geçirgen gözeneklerinin açılması için InsP3 ile kombinasyon halinde düşük Ca2 + seviyeleri gereklidir. Alternatif olarak, yüksek Ca2 + seviyeleri hem doğrudan hem de dolaylı olarak reseptör4’ü inhibe eder. Ca2+ homeostazının uygun nöronal fonksiyon için önemi, bozulmuş hücre içi Ca2+ kullanımı ve sinyalizasyonunun nörodejeneratif bozuklukların ve doğal yaşlanmanın patogenezinde erken bir adım olduğunu gösteren kanıtlarla desteklenmektedir 5,6. Spesifik olarak, ER ve mitokondri tarafından anormal Ca2 + alımı ve salınımı Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve Huntington hastalığı 6,7’de nöronal disfonksiyonun başlangıcı ile bağlantılıdır.
Doğal yaşlanma veya nörodejenerasyon sırasında Ca 2+ dishomeostazının incelenmesi, doğal hücresel mimarinin (yani, sinapsların düzenlenmesi ve iyon kanallarının dağılımı) korunduğu canlı, sağlam bir organizmada hücre altı çözünürlükle Ca2 + seviyelerinin uzunlamasına gözlemlenmesini gerektirir. Bu amaçla, bu protokol, Ca 2+ dinamiklerini yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle in vivo olarak kaydetmek için kolayca bulunabilen, genetik olarak kodlanmış iki Ca2+ sensörünün kullanımı konusunda rehberlik sağlar. C. elegans’ta tarif edilen yöntem kullanılarak elde edilen temsili sonuçlar, tek nöronların sitoplazmasında veya mitokondriyal matrisindeCa2+ göstergelerinin ekspresyonunun, tek omurga benzeri yapılar ve bireysel mitokondri içindeki Ca2+ seviyelerini ayırt etme yeteneği ile Ca2 + dinamiklerini gösteren floresan görüntülerin (50 Hz’e kadar) hızlı bir şekilde elde edilmesine nasıl izin verebileceğini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan yöntemi uygularken göz önünde bulundurulması gereken ilk husus, verilen araştırma sorusu için ideal özelliklere sahip bir Ca2+ göstergesinin seçilmesini içerir. Sitoplazmik Ca 2+ göstergeleri tipik olarak Ca2+ için yüksek bir afiniteye sahiptir ve bu göstergelerin Ca2 + ‘ya duyarlılığı kinetik (açma / kapama oranı) ile ters orantılıdır 16,17. Bu, Ca2+ duyarlılığının v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir (R01- NS115947, F. Hoerndli’ye verilmiştir). Ayrıca pAS1 plazmidi için Dr. Attila Stetak’a teşekkür ederiz.
Materials
| 100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
| Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
| Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
| CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
| Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
| Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
| Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
| FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
| FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
| GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
| ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
| ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52a | |
| IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
| Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
| Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
| Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
| pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
| pBSKS | Stratagene | ||
| pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
| Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
| Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
| Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
| Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
| Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |
References
- Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).
- Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
- Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
- Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
- Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).
- Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
- Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer’s disease. Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).
- Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook. , (2006).
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
- Ogama, T. A beginner’s guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
- Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
- Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
- Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
- de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
- Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
- Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
- Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).
- Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
- Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).
- Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
- O’Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
- Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
- Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
- Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262 (2014).
- Cho, J. -. H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
- Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).
- Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Calcium homeostasis in aging neurons. Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).
- Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).
- Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
- Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).
