Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo
Summary
Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.
Abstract
Las imágenes de calcio (Ca 2+) se han utilizado en gran medida para examinar la actividad neuronal, pero cada vez está más claro que el manejo subcelular de Ca2+ es un componente crucial de la señalización intracelular. La visualización de la dinámica subcelular de Ca2+ in vivo, donde las neuronas pueden estudiarse en sus circuitos nativos e intactos, ha demostrado ser técnicamente desafiante en sistemas nerviosos complejos. La transparencia y el sistema nervioso relativamente simple del nematodo Caenorhabditis elegans permiten la expresión específica de la célula y la visualización in vivo de etiquetas e indicadores fluorescentes. Entre estos se encuentran indicadores fluorescentes que han sido modificados para su uso en el citoplasma, así como varios compartimentos subcelulares, como las mitocondrias. Este protocolo permite obtener imágenes no ratiométricas de Ca 2+ in vivo con una resolución subcelular que permite el análisis de la dinámica de Ca2+ hasta el nivel de las espinas dendríticas individuales y las mitocondrias. Aquí, se utilizan dos indicadores codificados genéticamente disponibles con diferentes afinidades de Ca 2+ para demostrar el uso de este protocolo para medir los niveles relativos de Ca2+ dentro del citoplasma o la matriz mitocondrial en un solo par de interneuronas excitatorias (AVA). Junto con las manipulaciones genéticas y las observaciones longitudinales posibles en C. elegans, este protocolo de imagen puede ser útil para responder preguntas sobre cómo el manejo de Ca2+ regula la función neuronal y la plasticidad.
Introduction
Los iones de calcio (Ca2+) son portadores altamente versátiles de información en muchos tipos de células. En las neuronas, el Ca2+ es responsable de la liberación dependiente de la actividad de los neurotransmisores, la regulación de la motilidad del citoesqueleto, el ajuste fino de los procesos metabólicos, así como muchos otros mecanismos necesarios para el mantenimiento y la función neuronal adecuados 1,2. Para garantizar una señalización intracelular efectiva, las neuronas deben mantener bajos los niveles basales de Ca2+ en su citoplasma3. Esto se logra mediante mecanismos cooperativos de manejo de Ca 2+, incluida la absorción de Ca2+ en orgánulos como el retículo endoplásmico (RE) y las mitocondrias. Estos procesos, además de la disposición de los canales iónicos permeables al Ca 2+ en la membrana plasmática, dan como resultado niveles heterogéneos de Ca2+ citoplasmático en toda la neurona.
La heterogeneidad de Ca 2+ durante el reposo y la activación neuronal permite la regulación diversa y específica de la ubicación de los mecanismos dependientes de Ca 2+ 1. Un ejemplo de los efectos específicos de la concentración de Ca 2+ es la liberación de Ca2+ del RE a través de los receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (InsP 3). Se requieren niveles bajos de Ca2+ en combinación con InsP3 para la apertura del poro permeable al calcio del receptor. Alternativamente, los niveles altos de Ca2+ inhiben directa e indirectamente el receptor4. La importancia de la homeostasis del Ca 2+ para la función neuronal adecuada está respaldada por la evidencia que sugiere que la manipulación y señalización intracelular del Ca2+ interrumpido es un paso temprano en la patogénesis de los trastornos neurodegenerativos y el envejecimiento natural 5,6. Específicamente, la absorción y liberación anormal de Ca2+ por el RE y las mitocondrias están relacionadas con la aparición de disfunción neuronal en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington 6,7.
El estudio de la dishomeostasis de Ca 2+ durante el envejecimiento natural o la neurodegeneración requiere la observación longitudinal de los niveles de Ca2+ con resolución subcelular en un organismo vivo e intacto en el que se mantiene la arquitectura celular nativa (es decir, la disposición de las sinapsis y la distribución de los canales iónicos). Con este fin, este protocolo proporciona orientación sobre el uso de dos sensores de Ca 2+ codificados genéticamente fácilmente disponibles para registrar la dinámica de Ca2+ in vivo con alta resolución espacial y temporal. Los resultados representativos adquiridos utilizando el método descrito en C. elegans demuestran cómo la expresión de indicadores de Ca 2+ en el citoplasma o matriz mitocondrial de neuronas individuales puede permitir la adquisición rápida de imágenes fluorescentes (hasta 50 Hz) que ilustran la dinámica de Ca 2+ con la capacidad adicional de discernir los niveles de Ca 2+ dentro de estructuras individuales similares a espinas y mitocondrias individuales.
Protocol
Representative Results
Discussion
La primera consideración al implementar el método descrito implica la selección de un indicador Ca2+ con características ideales para la pregunta de investigación dada. Los indicadores citoplasmáticos de Ca 2+ suelen tener una alta afinidad por el Ca 2+, y la sensibilidad de estos indicadores al Ca2+ está inversamente relacionada con la cinética (tasa de encendido/apagado)16,17. Esto significa que la sensibilida…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (R01- NS115947 otorgado a F. Hoerndli). También nos gustaría agradecer al Dr. Attila Stetak por el plásmido pAS1.
Materials
| 100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
| Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
| Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
| CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
| Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
| Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
| Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
| FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
| FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
| GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
| ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
| ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52a | |
| IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
| Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
| Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
| Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
| pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
| pBSKS | Stratagene | ||
| pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
| Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
| Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
| Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
| Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
| Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |
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