Субклеточная визуализация обработки кальция нейронами in vivo

Ионы кальция (^Ca2+) являются универсальными носителями информации во многих типах клеток. В нейронах Ca²⁺ отвечает за зависящее от активности высвобождение нейротрансмиттеров, регуляцию подвижности цитоскелета, тонкую настройку метаболических процессов, а также за многие другие механизмы, необходимые для правильного поддержания и функционирования нейронов ^1,2. Чтобы обеспечить эффективную внутриклеточную передачу сигналов, нейроны должны поддерживать низкий базальный уровень Ca²⁺ в своей цитоплазме³. Это достигается совместными механизмами обработки Ca2+, включая поглощение Ca²⁺ органеллами, такими как эндоплазматический ретикулум (ER) и митохондрии. Эти процессы, в дополнение к расположению Ca 2+-проницаемых ионных каналов в плазматической мембране, приводят к гетерогенным уровням цитоплазматического Ca²⁺ по всему нейрону.

Гетерогенность^Ca2+ во время покоя и активации нейронов обеспечивает разнообразную, специфическую для местоположения регуляцию Ca²⁺-зависимых механизмов¹. Одним из примеров специфических для концентрации эффектов Ca 2+ является высвобождение Ca ²⁺ из ER через рецепторы инозитол-1,4,5-трисфосфата (InsP 3). Низкие уровни Ca²⁺ в сочетании с InsP₃ необходимы для открытия кальций-проницаемой поры рецептора. В качестве альтернативы, высокие уровни Ca²⁺ как прямо, так и косвенно ингибируют рецептор⁴. Важность гомеостаза Ca 2+ для правильной функции нейронов подтверждается данными, свидетельствующими о том, что нарушение внутриклеточной обработки и передачи сигналов Ca²⁺ является ранним шагом в патогенезе нейродегенеративных расстройств и естественного старения ^5,6. В частности, аномальное поглощение и высвобождение Ca²⁺ скорой помощью и митохондриями связано с началом дисфункции нейронов при болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона ^6,7.

Изучение дисгомеостаза Са 2+ при естественном старении или нейродегенерации требует продольного наблюдения уровней Са²⁺ с субклеточным разрешением в живом, интактном организме, в котором поддерживается нативная клеточная архитектура (т. е. расположение синапсов и распределение ионных каналов). С этой целью этот протокол содержит рекомендации по использованию двух легкодоступных, генетически закодированных датчиков Ca 2+ для записи динамики Ca²⁺ in vivo с высоким пространственным и временным разрешением. Репрезентативные результаты, полученные с помощью описанного метода у C. elegans, демонстрируют, как экспрессия показателей Ca 2+ в цитоплазме или митохондриальном матриксе отдельных нейронов может позволить быстро получать флуоресцентные изображения (до 50 Гц), которые иллюстрируют динамику Ca 2+ с дополнительной способностью различать уровни Ca ²⁺ в отдельных позвоночных структурах и отдельных митохондриях.