JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Kısa Biyotinile RNA Kullanan RNA Bağlayıcı Proteinlerin Optimize Edilmiş Kantitatif Aşağı Çekme Analizi

Published: February 17, 2023
doi:
10.3791/64923
, , , ,
1Center for Human Technology,Italian Institute of Technology (IIT), 2Department of Experimental Oncology,European Institute of Oncology (IEO), 3Department of Biology and Biotechnologies ‘Charles Darwin’,Sapienza University of Rome

Summary

Burada, insan hücrelerinden toplam protein ekstraktını, biyotinile RNA ile kaplanmış streptavidin boncuklarını ve kütle spektrometri analizini kullanarak, spesifik RNA dizilerinin protein interaktörlerini ortaya çıkarmak, ölçmek ve doğrulamak için optimize edilmiş bir in vitro yöntem sunuyoruz.

Abstract

Protein-RNA etkileşimleri, gen ekspresyonunu ve hücresel fonksiyonları transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası seviyelerde düzenler. Bu nedenle, ilgilenilen bir RNA’nın bağlanma ortaklarını tanımlamak, birçok hücresel sürecin arkasındaki mekanizmaları ortaya çıkarmak için büyük önem taşımaktadır. Bununla birlikte, RNA molekülleri, bazı RNA bağlayıcı proteinlerle, özellikle de kanonik olmayanlarla geçici ve dinamik olarak etkileşime girebilir. Bu nedenle, bu tür RBP’leri izole etmek ve tanımlamak için geliştirilmiş yöntemlere büyük ölçüde ihtiyaç vardır.

Bilinen bir RNA dizisinin protein ortaklarını verimli ve nicel olarak tanımlamak için, hücresel toplam protein ekstraktından başlayarak etkileşen tüm proteinlerin aşağı çekilmesine ve karakterizasyonuna dayanan bir yöntem geliştirdik. Streptavidin kaplı boncuklara önceden yüklenmiş biyotinillenmiş RNA kullanarak protein aşağı çekilmesini optimize ettik. Kavramın bir kanıtı olarak, nörodejenerasyonla ilişkili protein TDP-43’ü bağladığı bilinen kısa bir RNA dizisi ve farklı bir nükleotid bileşiminin negatif kontrolünü, ancak aynı uzunlukta kullandık. Boncukları maya tRNA ile bloke ettikten sonra, biyotinile RNA dizilerini streptavidin boncuklarına yükledik ve HEK 293T hücrelerinden toplam protein ekstresi ile inkübe ettik. İnkübasyondan ve spesifik olmayan bağlayıcıları çıkarmak için birkaç yıkama adımından sonra, etkileşen proteinleri, en yaygın kullanılan protein niceleme reaktifleri ve kütle spektrometrisi için numune hazırlama ile uyumlu yüksek tuzlu bir çözelti ile salgıladık. TDP-43’ün bilinen RNA bağlayıcı ile gerçekleştirilen pull-down’daki zenginleşmesini, kütle spektrometrisi ile negatif kontrole kıyasla ölçtük. Aynı tekniği, hesaplamalı olarak ilgilendiğimiz RNA’mızın veya kontrolümüzün benzersiz bağlayıcıları olduğu tahmin edilen diğer proteinlerin seçici etkileşimlerini doğrulamak için kullandık. Son olarak, TDP-43’ün uygun bir antikorla saptanması yoluyla protokolü western blot ile doğruladık.

Bu protokol, fizyolojik koşullara yakın bir RNA’nın protein ortaklarının incelenmesine izin verecek ve benzersiz ve öngörülemeyen protein-RNA etkileşimlerinin ortaya çıkarılmasına yardımcı olacaktır.

Introduction

RNA bağlayıcı proteinler (RBP’ler), mRNA ekleme, RNA hücresel lokalizasyonu, translasyon, modifikasyon ve bozunma 1,2,3 gibi süreçlerde yer aldıkları için transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası gen regülasyonunda önemli oyuncular olarak ortaya çıkmıştır. İki makromolekül arasındaki bu tür etkileşimler son derece koordineli, hassas bir şekilde dengelenmiş ve fonksiyonel ve işleme merkezlerinin oluşumu için gereklidir. Bu merkezlerdeki varyasyonlar veya düzensizlikler, ince düzenlenmiş protein-RNA ağlarını bozma potansiyeline sahiptir ve kanser4,5 ve nörodejeneratif bozukluklar 6,7,8 dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıkları ile giderek daha fazla ilişkilidir. RNA molekülleri ve protein bağlanma ortakları arasındaki etkileşimler ya kararlı ve deneysel olarak doğrulanması kolay ya da oldukça dinamik, geçici ve karakterize edilmesi daha zor olabilir.

Son yıllarda, bu etkileşimleri anlamak için yoğun çabalar sarf edilmiştir. En köklü yöntemler arasında, protein pull-down testleri (PD’ler), ribonükleoprotein (RNP) komplekslerini ve diğer protein-RNA etkileşim ağlarını oluşturan ana oyuncuları çözmek için muhtemelen en çok takdir edilen ve yaygın olarak kullanılan yaklaşımlardır 3,9,10. PD’ler, RNA (RIP)11,12 veya protein (CLIP)13,14’ün immünopresipitasyonu gibi geniş bir bilgilendirici teknikler şemsiyesi içerir. Bu RNA-PD protokollerinden bazıları, proteinler15 için yem olarak bilinen bir RNA’yı, çoğunlukla biyotin gibi yüksek afiniteli etiketlerden yararlanarak kullanır. Bu durumda, biyotinillenmiş bir RNA’nın etkileşim ortakları, RNA’nın streptavidin kaplı boncuklar üzerine sabitlenmesiyle tespit edilebilir ve RNP’lerin verimli izolasyonunu sağlar. Bu yaklaşımların ana sınırlamaları genellikle biyotinile probların tasarımı ve hedef proteinleri bağlama yeteneklerinin test edilmesidir. Bu amaçla, eğer varsa, ilgili proteinin yayınlanmış CLIP verilerine güvenmek yararlı olabilir, çünkü bunlar, hedef protein13,16 ile etkileşimlerin zirvelerine karşılık gelen kısa RNA bölgelerini yüksek hassasiyetle ortaya çıkarırlar. Aynı bölgeler, PD’ler için problar geliştirmek için kullanılabilir. Bu tür RNA yemlerini tasarlamak için alternatif bir yöntem, ligandların üstel zenginleştirme (SELEX)17 ile sistematik evrimi olabilir; bu, aptamerlerin in vitro seleksiyon yoluyla, kapsamlı bir randomize kütüphaneden başlayarak ve bir dizi PCR güdümlü optimizasyon döngüsü yoluyla tasarlanmasını sağlar. Bununla birlikte, SELEX karmaşık ve zaman alıcıdır ve nihai sonuçlar büyük ölçüde ilk kütüphaneye bağlıdır. Burada sunulan protokolde kullanılacak RNA yemini seçmek için, belirli bir proteinin belirli RNA dizilerine tercihli bağlanmasını öngören algoritma kedisiRAPID’in hesaplama gücü aracılığıyla de novo olarak tasarlanmış bir RNA yeminin kullanılmasından oluşan başka bir yaklaşım daha kullanılmıştır 18,19,20.

Burada tanıtılan protokol, deterjan, denatüre edici maddeler veya yüksek sıcaklıklar kullanılmadan, fizyolojiye yakın koşullarda spesifik protein ortaklarını ortaya çıkarmak için optimize edilmiş bir RNA-PD’nin bir versiyonudur. Yüksek oranda saflaştırılmış streptavidin ile kovalent olarak kaplanmış nano-süperparamanyetik boncuklara ve spesifik bir in silico tasarımlı biyotinile RNA’nın yem olarak kullanılmasına dayanır. Bu protokol, biyotinile RNA moleküllerinin bağlanma ortaklarını doğal koşullarda izole etmek için hızlı ve verimli bir yöntem sağlar ve çok çeşitli aşağı akış uygulamaları için potansiyel sunar. Bu protokolü test etmek için, daha önce protein TAR DNA bağlayıcı protein 43’ü (TDP-43) yüksek afinite ve özgüllükle bağlamak için tasarlanmış 10 nükleotid tek sarmallı RNA aptamer dizisikullanıldı 20. HEK 293T hücre lizatlarından başlayarak, biyotinile RNA aptamerinin interaktörleri, hipertonik bir tampon kullanılarak RNA yeminden ayrılan örnekler üzerinde yapılan kütle-spektrometri analizi ile tanımlanmıştır. Bu analiz, TDP-43’ün tercih edilen bağlayıcı olarak başarılı bir şekilde tanımlandığını ve nicelleştirildiğini doğruladı.

Bu protokol, protein interaktörlerinin sadece kısa, in vitro sentezlenmiş RNA oligonükleotid kullanılarak başarılı bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Ayrıca, in silico tasarımlı RNA aptamerlerinin PD probları21,22 olarak kullanılması, hedefler için önemli ölçüde azaltılmış maliyetlerle özgüllüğü garanti eder.

Protocol

1. Genel yöntemler ve materyaller Seçilen memeli hücre kültürü için uygun ortamı hazırlayın ve kullanmadan önce 20 dakika boyunca 37 ° C’de önceden ısıtın. Gerekli malzemeyi, Malzeme Tablosunda açıklandığı gibi önceden hazırlayın. Otoklav cam eşyalar, plastik eşyalar ve tampon stokları. Arabellekleri Tablo 1’de açıklandığı gibi hazırlayın. Bileşenleri son hacimlerine seyreltmeden önce konsantre HCl veya NaOH kullanarak stok çözeltilerinin pH’ını ayarlayın. 2. Memeli hücre hattı hazırlığı Dulbecco’nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) fetal sığır serumu (FBS) ve 100 μg / mL penisilin / streptomisin çözeltisi ile desteklenmiş HEK 293T hücrelerini büyütün. Bunları% 5 CO2 ile sağlanan nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C’de inkübe edin. Hücreleri rutin olarak bölün. Ayırmadan önce, hücreleri büyüyen yüzeyi örtmek için yeterli fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi ile durulayın. PBS’yi çıkarın ve ultra ince bir tripsin-EDTA çözeltisi tabakası ekleyin. Hücreleri 37 ° C’de, 5 dakika boyunca% 5 CO2 ile sağlanan nemlendirilmiş bir inkübatörde veya hücreler ayrılana kadar inkübe edin (mikroskobik gözlem altında dağılmış görünmelidirler). Tripsin-EDTA çözeltisini, inaktive etmek ve hücreleri saymak için tam DMEM ekleyerek on kat seyreltin. Plaka 1.5 x 105 hücreli / mL, test edilecek iki kuyucuk / koşul göz önüne alındığında, 6 delikli plakalarda. Hücreleri 37 ° C’de 48 saat boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.NOT: Hücre hattına uygun ortam ve ek tip için üretici talimatlarını kontrol edin. Ayrıca, tripsin-EDTA’nın miktarı ve inkübasyon süresi hücre hattına bağlıdır. Bazı hücre tipleri bu protokolde bildirilenden daha hızlı / daha yavaş büyür; Bu nedenle, tohumlama konsantrasyonu önceden test edilmelidir. 3. Toplam protein hasadı Ortam, hücrelerin büyüdüğü kuyucuklardan çıkarın. 6 delikli plakaların her bir kuyucuğunu 1 mL PBS ile yıkayın. PBS’yi atın. Plakaları buz üzerinde hareket ettirin ve ya adım 3.5 ile devam edin ya da lizisi kolaylaştırmak için kuru plakaları -80 ° C’de dondurun. Her bir oyuğa 200 μL lizis tamponu ekleyin. Hücreleri ayırmak ve kırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. İki kuyudan türeyen hücre ekstraktını aynı 1.5 mL tüpe aktarın. Protein ekstraktını içeren tüpü 30 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Hücre lizatlarını 17.000 x g’de 4 ° C’de 15 dakika boyunca santrifüj edin. Her süpernatantı önceden soğutulmuş bir tüpe aktarın.NOT: Her PD koşulu için toplam 10adet 6-10 7 hücre önerilir. Hücre lizisi ve protein hasadı buz gibi soğuk tamponlarla yapılmalıdır. Protein yıkımını önlemek için lizis tamponuna proteaz inhibitörleri eklenmelidir. 4. Protein konsantrasyonu tayini Bradford reaktifini, üretici tarafından belirtildiği gibi, dH2O’da beş kat seyrelterek hazırlayın. 1 cm’lik bir küvete 1 mL reaktif dağıtın, numunenin 1 μL’sini ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Karanlıkta oda sıcaklığında 5-10 dakika inkübe edin. Absorbansı 595 nm’de okuyun. 1.5 mg proteine karşılık gelen protein ekstraktının hacmini hesaplayın ve lizis tamponunu kullanarak tüm numuneleri 600 μL’lik son bir hacme getirin. Numuneleri kullanana kadar buz üzerinde tutun.NOT: Tampon uyumluluğu önerilerini takiben başka herhangi bir protein konsantrasyonu belirleme yöntemi kullanılabilir. Her durumda, lizis tamponu boş olarak kullanılmalıdır. Birçok reaktif, ditiyotreitol (DTT) ile uyumlu değildir. DTT veya diğer indirgeyici ajanların sadece protein miktarından sonra eklenmesi önerilir (DTT, 1 mM’lik nihai konsantrasyona). 5. Boncuk hazırlama Boncukları, tüpü hareket ettirerek depolama tamponlarında karıştırın. 100 μL bulamaç ortamı/numunesi hesaplayın ve hacmi manyetik bir rafa yerleştirin. Boncuk yıkamaDepolama çözeltisini çıkarın ve 1 mL lizis tamponu / tüpü ekleyerek boncukları yıkayın ve manuel olarak ters çevirin. Manyetik rafı kullanarak tamponu çıkarın. Yıkama adımını tekrarlayın. Bulamaç ortamının başlangıç hacmine eşit bir lizis tamponu hacmi ekleyin, tüpü hareket ettirerek karıştırın ve ortamı numuneler olduğu kadar 1,5 mL tüpe eşit olarak dağıtın. Boncuk engellemeManyetik rafı kullanarak tamponu çıkarın ve lizis tamponunda hazırlanan 0.25 mg / mL’lik bir maya tRNA çözeltisinden 600 μL ekleyin. Dönen bir tekerlek üzerinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Manyetik rafı kullanarak tRNA çözeltisini çıkarın. 600 μL lizis tamponu ekleyin ve manuel olarak karıştırarak yıkayın. Yıkama adımını tekrarlayın ve tamponu atın. 6. Boncuk yükleme İlk 100 μL bulamaç ortamını (şimdi bloke edilmiş boncuklar) içeren her tüp için 600 μL lizis tamponunda 200 μg RNA oligonükleotid hazırlayın. Oligo’yu boncuklara ekleyin ve dönerken oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Çözeltiyi çıkarın, 600 μL lizis tamponu ekleyin ve tüpleri oda sıcaklığında 5 dakika döndürerek boncukları iki kez yıkayın. Arabelleği atın.NOT: Boncukları asla vorteks etmeyin, bunun yerine hafifçe vurun. Gerekmedikçe pipetleme adımlarının sayısını sınırlayın. Mümkün olduğunda, kesik, 1 mL uçları kullanın. Boncuk bulamacı ortamının/numunesinin miktarı, boncukların bağlanma kabiliyetine ve toplam proteinlerin başlangıç miktarına bağlıdır. RNA oligosunun önemli miktarda ikincil yapıya sahip olduğu tahmin ediliyorsa, önce 10 dakika boyunca 80 ° C’de denatüre edilmesini ve daha sonra oda sıcaklığında yavaşça soğutulmasını veya 1 saat boyunca 30 ° C’de inkübe edilerek yeniden düzenlenmesini öneririz. Boncuk yüklemesinden sonra RNA oligosunun geri kazanılması ve yükleme için gerekli miktarın optimize edilmesi ve RNA’nın yeniden kullanılma olasılığını değerlendirmek için kalan konsantrasyonun belirlenmesi önerilmektedir. 7. Boncuklara protein bağlanması NOT: Şu andan itibaren, mümkün olduğunda, adımları 4 °C’de gerçekleştirin. 600 μL protein çözeltisinden% 5’lik bir hacim alın ve daha fazla analiz için GİRİŞ (IN) olarak saklayın (1.5 mg protein 600 μL’de çözülür, bu nedenle% 5’i 30 μL ve 75 μg proteine karşılık gelir). Kalan protein karışımını her bir yüklü boncuk tüpüne ekleyin ve gece boyunca 4 ° C’de yavaşça dönmeye bırakın. 8. Spesifik olmayan bağlayıcıların yıkanması Manyetik rafı kullanarak bağlanmamış fraksiyonu çıkarın. Hacmin% 5’ini kaydedin ve FLOWTHROUGH (FT) olarak etiketleyin (bağlanmamış hacim yaklaşık 600 μL’dir, bu nedenle daha fazla analiz için tekrar 30 μL tutun). Boncuklara 1 mL yıkama tamponu 1 ekleyin ve 4 ° C’de 5 dakika dönmeye bırakın. Arabelleği atın. 8.2 ve 8.3 numaralı adımları yineleyin. Boncuklara 1 mL yıkama tamponu 2 ekleyin ve 4 °C’de 5 dakika dönmeye bırakın. Supernatan’ı atın. 9. Belirli bağlayıcıların elüsyonu Boncuklara 100 μL elüsyon tamponu 1 veya elüsyon tamponu 2 ekleyin. Hafifçe vurarak manuel olarak karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Tüpleri bir termomiksere yerleştirin ve 95 ° C’de 5 dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın. Tüpü manyetik rafa yerleştirin ve salınan fraksiyonu temiz bir tüpe toplayın. Elüatın geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için boncukları bir tezgah santrifüjü ile hızlı bir şekilde döndürün. Daha sonraki analizler için toplam ELUATE (EL) hacminin% 5’ini kaydedin (toplam hacim 100 μL’dir, bu nedenle 5 μL’yi başka bir tüpe ayırın). Gerekirse, protein konsantrasyonu, bölüm 4’teki gibi, elüsyon tamponunu boş olarak kullanarak belirlenebilir.NOT: Protein konsantrasyonu belirlenene kadar elüsyon tamponuna DTT eklemekten kaçınılması önerilir. Protein nicelleştirmesi gerekli değilse veya indirgeyici madde uyumlu protein niceleme kitleri mevcutsa, elüsyon tamponuna başlangıçtan itibaren 1 mM DTT eklenebilir. Bu protokolde, hem elüsyon tamponu 1 (1 M NaCl içeren) hem de elüsyon tamponu 2 (2 M NaCl ile) test edildi. Hedef proteinin elüsyon etkinliğinde artan iyonik mukavemet ile bir fark gözlenmemiştir, ancak en uygun tamponu oluşturmadan önce her iki koşulun da test edilmesi önerilir. Elüsyon tamponunda yüksek miktarda tuz bulunması daha fazla analiz için bir sınırlama oluşturuyorsa, elüsyon tamponundaki çok düşük miktarda deterjan tampon değişimine izin verir. Alternatif olarak, elüat istenen tuz konsantrasyonuna ulaşmak için seyreltilebilir. 10. Protein bağlayıcılarının kütle spektrometrisi ile tanımlanması Aseton çökeltmesiSalınan proteinleri soğuk (-20 °C) asetonda dört kat seyrelterek konsantre edin. Vorteks ve tüpü gece boyunca -20 ° C’de inkübe edin. 4 °C’de 30 dakika boyunca 17.000 x g’de döndürün. Süpernatantı yavaşça çıkarın ve pelet tamamen kuruyana kadar asetonun buharlaşmasına izin verin. Çözelti içi protein sindirimi50 μL denatürasyon tamponu ekleyerek protein peletini çözün. DTT’yi 5 mM’lik son konsantrasyona ekleyerek 55 ° C’de 30 dakika boyunca protein azalmasına izin verin. Numuneleri oda sıcaklığında soğutun ve protein alkilasyon reaksiyonuna devam edin, 15 dakika boyunca 10 mM’lik bir konsantrasyonda iyodoasetamid (IAA) ekleyin. Proteinleri uygun bir enzim (tripsin, LysC) kullanarak sindirin ve numuneleri gece boyunca 37 ° C’de inkübe edin. 1 μL% 10 trifloroasetik asit (TFA) ekleyerek sindirimi durdurun. Peptitleri, daha önce açıklandığı gibi özel bir ters faz C18 mikro sütununda temizleyin ve konsantre edin19. Peptitleri C18 ucundan Tampon B ile uzaklaştırın. Bir vakum santrifüjü kullanarak organik bileşeni çıkarın ve daha fazla analiz için peptitleri 5 μL% 0.1 formik asit içinde yeniden askıya alın.NOT: Alternatif olarak, protein sindirimi, spesifik olmayan bağlayıcıları yıkadıktan hemen sonra (adım 8.1-8.6) “boncuklar üzerinde” gerçekleştirilebilir, böylece protokol daha hızlı hale getirilir. Bununla birlikte, optimal deneysel protein dizisi kapsamını garanti etmek için, çözelti sindirimindeki standarda kıyasla “boncuklar üzerinde” hareketsiz proteinlerle çalışan enzimin etkinliğinin test edilmesi önerilir. Sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS)Analitik sütunu (C18-sabit faz) takın ve çalışma sırasında 45 °C’de tutun. Kolonu, LC pompasının altı portlu döner valfinin çıkışına, tek sütunlu bir konfigürasyonda kılcal parmak sızdırmaz bir bağlantı parçasından (20 μm x 550 mm) bağlayın. LC ayarlarını aşağıdaki gibi yapın:Peptitleri kontrollü basınç altında (980 bar) Tampon A’ya yükleyin. 59 dakika boyunca 300 nL/dak’da %5- Tampon B gradyanı uygulayın, ardından 15 dakika boyunca – Tampon B gradyanı ve 5 dakika boyunca – Tampon B gradyanı uygulayın. Tampon B konsantrasyonunu 5 dakika boyunca ‘e kadar artırarak bir yıkama adımı ve Tampon B’de 5 dakikalık izokratik bir adım ekleyin. MS ve MSMS olayları arasında otomatik olarak geçiş yapmak için kütle spektrometresini veriye bağımlı alma (DDA) modunda çalıştırın. MS ve MSMS olayları için sırasıyla 3 x 106 ve 1 x 105 otomatik kazanç denetimi (AGC) hedef değerini kullanarak 15’e eşit bir döngü sayısı tanımlayın. İzin verilen maksimum iyon biriktirme süresini 60 K çözünürlüğe sahip MS için 20 ms’ye, 15 K çözünürlüğe sahip MSMS için 100 ms’ye ayarlayın. 20 sn dinamik dışlama süresine sahip, ‘lik normalleştirilmiş çarpışma enerjisi kullanarak yüksek çarpışma ayrışması (HCD) parçalanma deneyi gerçekleştirin. Kaynak parametreleri aşağıdaki gibi çalıştırın:Püskürtme gerilimi: 1.7 kVKapiler gerilim: 275 °CNe kılıf ne de yardımcı gaz kullanılırNOT: Bu protokolde, ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (UHPLC) kütle spektrometrik (MS) analizi, hibrit üçlü kuadrupol orbitrap cihazına (Malzeme Tablosu) bağlanmış bir LC tek sütun kurulumu kullanılarak özel olarak gerçekleştirilmiştir. Diğer LCMS sistemleri kullanılabilir, ancak parametrelerin uyarlanması önerilir. Veri analiziHam dosyaları içe aktarmak için Yükle düğmesini kullanın. Deneme Ayarla düğmesini tıklayarak deneme adlarını tanımlayın. Tanımlamayla ilgili tüm parametreleri belirtmek için gruba özgü parametreler bölümüne girin:Sindirim için kullanılan enzim: Tripsin/PKaçırılan bölünmeler: üçe kadarSabit modifikasyon: KarbamidometilasyonDeğişken modifikasyon: N-asetil (Protein), Oksidasyon (M) UniprotKB gibi genel veritabanlarından edinilebilen güncellenmiş bir FASTA dosyasını karşıya yükleyin. Seçilen veritabanının kaynağına göre doğru ayrıştırma kurallarını belirtin. Hem proteinler hem de peptitler için bir ebeveynlik yanlış keşif oranı (FDR) değeri = 1 tanımlayın. Etiketsiz Miktar Belirleme sekmesindeki etiketsiz niceleme (LFQ) seçeneğini ekleyin. Minimum LFQ oranı sayısını ikide tutun.NOT: Burada, sırasıyla protein nicelleştirmesi ve müteakip istatistiksel analiz gerçekleştirmek için MaxQuant24 ve Perseus yazılımı25’i kullanarak veri analizini açıklıyoruz. Bununla birlikte, veri analizi, ticari olarak temin edilebilen veya ücretsiz herhangi bir biyoinformatik ile gerçekleştirilebilir. FDR, hedef aldatıcı veritabanı tabanlı bir yaklaşım kullanılarak tahmin edilir26. Peptit ve protein FDR, 0.01’e eşittir, tanımlanan peptitlerin ve proteinlerin yanlış pozitiflerin% 1’ini içermesi beklendiği anlamına gelir. İstatistiksel analizProtein düzeyinde istatistiksel analiz yapmak için protein grupları.txt dosyasını yükleyin. LFQ değerlerini ana sütunlar olarak tanımlayın. Satırları kategorik sütuna göre filtreleyerek “ters” ve “kirleticileri” kaldırın. Farklı deneysel koşulları gruplandırmak için kategorik ek açıklama satırlarını kullanın. Önceden tanımlanmış grupların her birinde geçerli değerlerin sayısını seçerek veri matrisini azaltın. Deneysel koşullara daha uygun istatistiksel testi seçin (örneğin, t-testi, çoklu örneklem testi ANOVA). FDR tabanlı bir hesaplama ile önemli ipuçları için bir kesim belirleyin. Tipik olarak, hem 0,01 hem de 0,05, düzeltilmiş p değeri için eşik olarak kabul edilir. Bir volkan grafiği gösterimi kullanarak t-testi istatistiklerine dayanan diferansiyel analizlerin sonuçlarını görselleştirin. Son sonuç tablosunun daha fazla düzenlenmesi için son matrisi .txt biçimde dışa aktarın.NOT: Yapılandırma klasörü, çıktı tablosunda + ile işaretlenmiş küresel proteomik deneylerde yaygın kirleticiler olarak kabul edilen keratinler gibi proteinleri içeren bir FASTA dosyası içerir. Bu çalışmada iki örneklem koşuluna sahip olan bu çalışmada istatistiksel analiz için t-testi kullanılmıştır. 11. Western blot ile sonuçların doğrulanması Numune hazırlamaHer bir IN, FT ve EL alikotuna uygun hacimde 4x numune yükleme arabelleği ekleyin. Numuneleri 95°C’de 5 dakika kaynatın. Buharlaşmış numuneyi tüplerin üstünden kurtarmak için hızlı döndürün. SDS-PAGE ve jel transferiNumuneleri% 4 -% 12 oranında denatüre edici bir poliakrilamid jel üzerine yükleyin. Jeli MES SDS çalışma tamponu ile 120 V’ta 1,5 saat boyunca çalıştırın. Jeli, üretici talimatlarını izleyerek yarı kuru bir transfer kaseti ile bir nitroselüloz membran üzerine aktarın. 15 V’ta 10 dakikalık bir transfer yapmanızı öneririz. İmmün tespitiNazikçe çalkalarken membranı oda sıcaklığında 1 saat boyunca sığır serum albümini (BSA) ile bloke edin. Üreticinin talimatlarına göre, TBST’de% 5 BSA’da hazırlanan birincil antikoru ekleyin. Gece boyunca 4 ° C’de veya oda sıcaklığında 1 saat boyunca hafif ajitasyon altında bekletin. Membranı TBST ile üç kez, her seferinde 5 dakika boyunca yıkayın. TBST’de hazırlanan ikincil antikoru ajitasyon altında oda sıcaklığında 1 saat boyunca ekleyin. Membranı TBST ile üç kez, her seferinde 5 dakika boyunca yıkayın. Bir leke görüntüleyici kullanarak sonuçları görselleştirin.NOT: RNA’mızın bilinen bir bağlayıcısı olan TDP-43’ü tespit etmek için, rekombinant tavşan monoklonal antikoru kullanıldı ve gece boyunca 4 ° C’de membranla bırakıldı. İkincil bir antikor olarak, anti-tavşan IgG yaban turpu peroksidaz (HRP) kullanıldı, ancak floresan ikincil bir antikor da işe yarayacaktı. Membran üzerindeki antikorları görselleştirmek için membran, ChemiDoc görüntüleme sistemi ile görüntülemeden önce 1 dakika boyunca Clarity Western ECL substratı ile inkübe edildi.

Representative Results

Önerilen protokolün geçerliliğini doğrulamak için, burada sunulan PD deneyleri, TDP-4320’yi spesifik olarak bağlamak için siliko olarak tasarlanmış biyotinile RNA aptamer ile gerçekleştirildi. Bu RNA, protein hedefini yüksek bağlanma afinitesi (K,d = 90 nM)20 ile bağlar. Burada, 5′-CGGUGUUGCU-3′ dizisindeki bu RNA, “+RNA” adıyla anılır. Negatif bir kontrol olarak, burada “-RNA” olarak adlandırılan +RNA’nın ters tamamlayıcı dizisi kullanıldı. Sırası 5′-AGCAACACCG-3’tür. -RNA, TDP-43’e (Kd = 1.5 μM)19’a karşı önemli ölçüde daha düşük bir bağlanma afinitesi gösterir. Burada açıklanan protokolün amacı doğrultusunda, bu RNA oligonükleotidleri, streptavidin boncuklarına bağlanmaya izin vermek için bir biyotin molekülüne konjuge edilmiş olarak satın alınmıştır. +RNA, 3′ ucunda, biyotin ile nükleik asidin fosfat grubu arasında 15 atomlu bir trietilen glikol ara parçası içeren bir biyotin-TEG ile satın alındı; -RNA bunun yerine 5′ ucunda, bir amino-C6 bağlayıcı aracılığıyla nükleik aside konjuge edilmiş bir biyotin içeriyordu. Bununla birlikte, RNA yeminin tasarımı sağlamsa ve bağlayıcı ile RNA arasında yapısal veya kimyasal bir girişim olmadığı sürece, biyotin konjugasyonu ve diğer bağlayıcı uzunlukları için başka pozisyonlar kullanılabilir. PD’den sonra +RNA probuna bağlı olarak bulunan ana proteinin kimliğinin bilinmesi, hem kütle spektrometrisi (MS) hem de batı lekesi (WB) kullanılarak elüattaki TDP-43’ün tanımlanmasıyla protokolün doğrulanmasını sağlamıştır (Şekil 1). MS analizi, +RNA veya -RNA kullanılarak gerçekleştirilen dört PD replikası üzerinde gerçekleştirildi (Şekil 2). +RNA ve -RNA interaktomlarının tanımlanması bu protokolün kapsamı dışındadır, ancak protokolün doğruluğunu doğrulayan bazı sonuçlar bildirilmiştir. Not olarak, önemli ölçüde zenginleştirilmiş proteinleri bir volkan grafiğinde çizmek, toplam protein içeriğinin ve +RNA’dan salınan zenginleştirilmiş proteinlerin, -RNA’dan geri kazanılandan önemli ölçüde daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 2). Bu, aynı uzunluk ve yapısal içeriğe (doğrusal) sahip olmasına rağmen, +RNA’nın, yüksek tuzla elüsyon adımına kadar tutulan daha fazla sayıda spesifik etkileşim oluşturabileceği anlamına gelir. Bunun yerine, -RNA’nın yıkama adımları sırasında bozulan daha fazla sayıda spesifik olmayan temas kurması muhtemeldir. Beklendiği gibi, TDP-43, +RNA20’nin benzersiz bir interaktörü olarak tanımlandı; +RNA ile gerçekleştirilen dört PD replikası için ortalama etiketsiz niceleme (LFQ) 31.96 ± 0.56 iken, protein -RNA’nın interaktörleri arasında tanımlanmamıştır. Ek olarak, +RNA’nın tüm benzersiz interaktörleri arasında, TDP-43’ün en bol zenginleştirilmiş protein olduğu bulunmuştur. Protokolü daha da doğrulamak için, şirket içi algoritma kedisiRAPID18,19, başka hangi proteinlerin spesifik olarak +RNA veya -RNA’yı bağlayacağını hesaplamalı olarak tahmin etmek için kullanıldı. Özellikle, insan proteomunu oluşturan proteinlerle +RNA ve -RNA için etkileşim skorları, önceki çalışmamızda tanımlandığı gibi catRAPID ‘etkileşim eğilimi’ özelliği kullanılarak hesaplanmıştır27. Yüksek güvenle puanlanan proteinler arasında, HNRNPH3’ün seçici olarak +RNA’ya (+RNA etkileşim skoru = 1.01; -RNA etkileşim skoru = 0.21) ve PCBP2’nin özellikle -RNA (+RNA etkileşim skoru = -0.5; -RNA etkileşim skoru = 0.31) ile etkileşime gireceği tahmin edilmiştir (Şekil 3A). Ek olarak, RBM41 proteininin her iki RNA oligonükleotidi için de karışık olduğu tahmin edildi (+RNA etkileşim skoru = 0.4; -RNA etkileşim skoru = 0.39) (Şekil 3A). MS analizi, sırasıyla +RNA ve -RNA’nın PD’sinde HNRNPH3 ve PCBP2’nin varlığını doğrularken, RBM41’in her ikisiyle de etkileşime girdiği bulundu (Şekil 3B). WB, sonuçları daha fazla doğrulamak için ve protokol optimizasyonu sırasında TDP-43’ün varlığını tespit etmek için kullanıldı (Şekil 4). Burada açıklanan prosedürde, farklı aşamalarda farklı örnekler toplanmıştır. Giriş numunesi (IN), lizis tamponunda seyreltilmiş toplam proteinlerden oluşuyordu. Akış (FT), RNA’yı bağlamayan proteinlerin fraksiyonunu temsil eden, biyotinile RNA ile önceden kaplanmış streptavidin boncukları ile toplam proteinlerin bir gecede inkübasyonundan sonra elde edildi. Son olarak, elüat (EL), incelenen RNA’yı spesifik olarak tanıyan tüm proteinleri içeriyordu, çünkü FT ve EL adımları arasında 150 mM tuz ve% 0.1 triton-X ile üç yıkama adımı en zayıf etkileşimleri ortadan kaldırmış olmalıydı. Her replika için, aynı miktarda (% 5 v / v) IN, FT ve EL, bir SDS-PAGE üzerinde paralel olarak çalıştırıldı ve bir anti-TDP-43 antikoru ile boyandı (Şekil 4). +RNA durumunda, TDP-43 bandı IN ve EL’de gözlendi, bu da toplam protein ekstraktında başlangıçtan itibaren mevcut olan proteinin, yıkama adımları sırasında +RNA tarafından tutulduğunu ve sadece sonunda yüksek bir tuz tamponu ile salındığını gösteriyor. TDP-43, -RNA için IN’de de mevcuttu, ancak proteine karşılık gelen bant FT’de de görülebilir, bu da bu RNA’nın TDP-43’e bağlanmadığını gösterir. EL’de TDP-43 bandının bulunmaması bu sonucu doğrulamaktadır. Protokolün optimizasyonu sırasında, RNA dizilerine spesifik olarak bağlanmış proteinlerin elüsyonu, hem 1 M NaCl (EB1) içeren bir elüsyon tamponu hem de 2 M NaCl (EB2) ile tamamlanmış bir elüsyon tamponu ile incelenmiştir (Şekil 4). Her iki EB ile elde edilen elüatlar bir SDS-PAGE üzerinde karşılaştırıldı ve anti-TDP-43 antikoru ile lekelendi. Elde edilen görüntüler daha sonra iki tamponla salınan TDP-43 miktarındaki herhangi bir farkı ölçmek için ImageJ28 ile analiz edildi. Genel olarak, anlamlı bir fark gözlenmedi ve bu tahlillerde, 1 M tuzun, en güçlü protein-RNA etkileşimlerini bile bozmak için yeterli olduğu sonucuna vardık. Genel olarak, MS ve WB’ler için burada bildirilen sonuçlar, bu protokolün belirli bir RNA’nın protein interaktörlerini belirli bir şekilde yakalamada etkili olduğunu ve aşağı akış analizi ile uyumlu tamponlarda elüsyonu sağladığını göstermektedir. Şekil 1: Önerilen protokolde kullanılan deneysel boru hattının taslağı . (A) Biyotinile RNA oligonükleotid, lizis tamponunda uygun konsantrasyonda hazırlanır. (B) Manyetik streptavidin boncukları yıkanır, maya tRNA ile bloke edilir ve biyotinile RNA ile yüklenir. (C) Kültürlü memeli hücre hatlarından elde edilen toplam protein ekstraktı boncuk-RNA karışımına eklenir. (D) Spesifik olmayan etkileşimleri ortadan kaldırmak için birden fazla yıkama yapılır. (E) Spesifik protein interaktörleri, hipertonik bir çözelti ile RNA’dan ayrılır. (F) İnteraktörlerin kimliği kütle spektrometrisi ile ortaya çıkar ve spesifik durumlar batı lekesi ile doğrulanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Etiketsiz MS bazlı protein ölçümü için analitik strateji . (A) Sökülen proteinler gece boyunca soğuk asetonda çökeltilir. Proteinler daha sonra denatüre edilir ve çözelti içi bir sindirim gerçekleştirilir. Proteolitik peptitler konsantre edilir ve tuzdan arındırılır. (B) Peptitler “av tüfeği yaklaşımı” kullanılarak LC-MS/ MS ile analiz edilir. (C) Ham veri işleme ve analizi, sırasıyla MaxQuant ve Perseus yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. (D) İstatistiksel olarak anlamlı zenginleştirilmiş proteinler bir volkan grafiğinde gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Tahmin edilen etkileşim eğilimleri ile +RNA ve -RNA’nın deneysel olarak belirlenmiş etkileşimleri arasındaki korelasyon. (A) HNRNPH3, PCBP2 ve RBM41’e göre kediHIZLI etkileşim skorları, +RNA için HNRNPH3’ün ve -RNA için PCBP2’nin tercihli bağlanmasını gösterirken, RBM41’in her iki RNA dizisini de ayrım gözetmeksizin bağladığı tahmin edilmektedir. (B) +RNA ve -RNA ile gerçekleştirilen pull-down’lardan kütle spektrometrisi analizi ile belirlenen etiketsiz niceleme ortalamaları. Analiz, HNRNPH3’ün yalnızca + RNA’yı, PCBP2’nin yalnızca -RNA’yı bağladığını ve RBM41’in her ikisini de eşit şekilde bağladığını doğrulamaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Seçilen RNA dizilerinin interaktörleri arasında TDP-43’ün varlığının/yokluğunun Batı leke doğrulaması. WB membranı anti-TDP-43 antikoru ile tedavi edilmiştir. IN = giriş; FT = akış; EL (EB1) = elüzyon tamponu 1 ile elüsyon; EL (EB2) = elüzyon tamponu 2 ile elüsyon; “+” işareti, +RNA ile gerçekleştirilen aşağı çekmeden türetilen örnekleri gösterir; “-” işareti, -RNA ile gerçekleştirilen aşağı çekmeden türetilen örnekleri gösterir; Şerit 1 bir protein merdiveni içerir. TDP-43 bir okla gösterilir. Dünya Bankası, TDP-43’ün +RNA interaktörleri arasında bulunduğunu, ancak -RNA interaktörleri arasında bulunmadığını göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Arabellek Adı Kompozisyon 10x Tranfer arabelleği 250 mM tris, 1.92 M glisin, %1 SDS, metanol. Önceden kullanımda 10 kat seyreltin PD 20X MES SDS çalışma arabelleği 1 M MES, 1 M tris, %2 SDS, 20 mM EDTA. PH’ı 7,3’e ayarlayın. Önceden kullanımda 20 kat seyreltin 4x Numune yükleme tamponu 0.25 M Tris baz, 0.28 M SDS, gliserol, 2-merkapto-etanol, 4 mg/ml bromfenol mavisi Elüsyon tamponu 1 20 mM fosfat pH 7,5, 1 M NaCl, 0,5 mM EDTA, % 0,1 Triton X-100, 1 mM DTT (nicelleştirmeden sonra eklenecektir) Elüsyon tamponu 2 20 mM fosfat pH 7,5, 2 M NaCl, 0,5 mM EDTA, % 0,1 Triton X-100, 1 mM DTT (miktarlamadan sonra eklenecektir) Lizis tamponu 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, %0,1 Triton X-100, 1 mM DTT ve proteaz inhibitörleri Tween-20 ile Tris tamponlu salin 1 M Tris-HCl pH 7,4, 3 M NaCl, %2,0 Ara-20 Yıkama tamponu 1 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, %0,1 Triton TM X-100, 1 mM DTT ve proteaz inhibitörleri Yıkama tamponu 2 25 mM Hepes pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, % 0,1 Triton X-100, 1 mM DTT ve proteaz inhibitörleri Arabellek A % 0.1 formik asit MS Arabellek B asetonitril, %0.1 formik asit Denatürasyon tamponu 8M üre, 50 mM Tris-HCl Tablo 1: PD ve MS tamponları. Aşağı çekme deneyleri (PD) veya kütle spektrometrisi analizi (MS) için kullanılan tamponların isimleri ve bileşimi.

Discussion

Bu çalışma, protein interaktörlerini yakalamak için biyotinile RNA oligonükleotidleri ile gerçekleştirilen bir PD protokolünün optimizasyonunu bildirmektedir. Burada açıklanan protokolün uygulanması basittir, çok az malzeme gerektirir ve son derece güvenilir sonuçlar üretir. Daha da önemlisi, bu protokolün en yeni yönleri, tamamen siliko olarak tasarlanmış ve protein hedefine özgü bir RNA yeminin kullanılmasından ve streptavidini biyotinden deterjan ve yüksek sıcaklık işlemiyle ayırmak yerine, RNA yemine bağlı tüm proteinlerin yüksek tuzlu bir çözelti ile etkileşimlerini doğrudan bozarak elden çıkarılmasından oluşur.

Bu protokol, biyotin ve streptavidin arasındaki bağın gücünden yararlanır29,30. Seçilen streptavidin boncuklarına göre, biyotinile RNA’nın yüklenmesi, devam etmeden önce test edilmeli ve ölçülmelidir. Ayrıca, RNA üç boyutlu katlanma, boncuklar üzerindeki yükleme verimliliğini etkileyebilir, çünkü biyotinin streptavidin’e maruz kalmasını sınırlayabilir. Boncukların biyotinile edilmemiş tRNA ile bloke edilmesi, boncuklarla spesifik olmayan etkileşimleri sınırlayarak sonuçların temizliğini arttırır. Yükleme tamponu ve elüsyon tamponu, çıkış yönündeki uygulamalara bağlı olarak seçilmelidir. Burada, uygulamaların çoğuna uygun ve potansiyel protein komplekslerini korumak için geliştirilen çok hafif koşullar önerilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem oldukça uyarlanabilir; Kullanıcı herhangi bir hücre çizgisini ve herhangi bir RNA boyutunu seçebilir ve yapının bağlanma özellikleri üzerindeki etkisini belirlemek için RNA’nın katlanmasından / açılmasından sonra protokolü tekrarlamaya karar verebilir.

Bu protokolün bir diğer orijinal yönü, sonuçların doğruluğunu sağlamak için in silico tahmin araçlarının kullanılmasıdır20. Hangi proteinlerin ilgilenilen RNA’nın interaktörleri olarak tanımlanması gerektiğini önceden bilmek, protokolün teknik yönlerini doğrulamanın benzeri görülmemiş bir avantajını sağlar. Örneğin, basit bir WB analizi kullanarak, özel enstrümantasyon gerektiren ve daha maliyetli olan MS analizine geçmeden önce protokolün farklı adımlarından türetilen örneklerde bilinen bir protein hedefinin varlığını doğrulamak mümkündür. Ek olarak, bir hedef proteine özgü de novo RNA’yı tasarlamak için şirket içi bir protein-RNA tahmin algoritması olan catRAPID20’yi kullanma yöntemi yakın zamanda bildirilmiştir. Yakın zamana kadar, bir hedef protein için DNA / RNA aptamerlerini tasarlamak için mevcut tek boru hattı, SELEX (üstel zenginleştirme yoluyla ligandların sistematik evrimi) yaklaşımı31 idi. In silico yöntemi, RNA aptamerlerinin çok daha hızlı ve uygun maliyetli bir tasarımını sağlar.

Bu yöntemin ana sınırlamaları, nükleaz içermeyen tamponlarda ve aletlerde çalışma ihtiyacı ile ilişkilidir. Ayrıca, de novo tarafından tasarlanmış bir RNA ile PD’den önce bir hedef protein arasındaki bağlanmanın in vitro olarak doğrulanması gerekli görülürse, proteinin üretilmesi ve saflaştırılması ve bağlanmanın biyofiziksel yaklaşımlarla belirlenmesi gerekir. Bu, monoklonal antikorların üretimi ile paylaşılan bir sınırlamadır.

Bu küçük sorunlara rağmen, burada sunulanlar gibi RNA-protein etkileşimlerini haritalamak için güvenilir yöntemler, bilim adamlarını makromoleküler ağları ve kanser, kardiyomiyopatiler, diyabet, mikrobiyal enfeksiyonlar ve genetik ve nörodejeneratif bozukluklarla ilgili olanlar gibi birçok fizyolojik ve patolojik mekanizmanın karmaşık ana aktörlerini ortaya çıkarmaya yaklaştırabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, sunulan destek için Prof. Tartaglia ve Dr. Cuomo’nun araştırma grubuna teşekkür eder. E.Z., 754490 sayılı Marie Sklodowska-Curie hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programının MINDED bursundan fon aldı.

Materials

6-well tissue culture plates  VWR 10861-554 CELLS
Cell scrapers BIOSIGMA  10153 CELLS
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium  (DMEM) Thermo Fisher Scientfic 11995065 CELLS
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil Thermo Fisher Scientfic 10500064 CELLS
Phosphate Buffer Saline (PBS, Waltham, MA) Thermo Fisher Scientfic 14190169 CELLS
Trypsin (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientfic 15050065 CELLS
Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP) Cellsignal 7070 PD
Biotinylated RNA Eurofins Custom RNA oligonucleotides PD
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418 PD
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml Biorad 1705061 PD
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Merck – Sigma Aldrich 5056489001 PD
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well Invitrogen NP0321BOX PD
Recombinant anti-TDP43 antibody Abcam ab109535 PD
Ribonucleic acid, transfer from baker's yeast (S. cerevisiae) Merck – Sigma Aldrich R5636-1ML PD
Streptavidin Mag Sepharose Merck – Sigma Aldrich GE28-9857-99 PD
Trans-Blot Turbo RTA Mini 0.2 µm PVDF Transfer Kit Biorad 1704272 PD
Acetone Thermo Fisher Scientfic 022928.K2 MS
C18 cartridge Thermo Fisher Scientfic 13-110-018 MS
Dithiothreitol  (DTT) Thermo Fisher Scientfic 20290 MS
EASY-Spray HPLC Columns Thermo Scientific ES902 MS
iodoacetamide (IAA)  Sigma Aldrich S.r.l. I6125 MS
Lys-C/Trypsin Promega V5073 MS
Trifluoroacetic acid (TFA) Thermo Fisher Scientfic 28904 MS
Urea Thermo Fisher Scientfic J75826.A7 MS
Equipment
ChemiDoc imaging system Bio-Rad CELLS
Dyna Mag -2 , Magnetic rack Invitrogen CELLS
Forma Series 3 water jacketed C02 incubator Thermo Scientific PD
PROTEAN II xi cell , power supply for PAGE applications Bio-Rad PD
Rotating wheel, rotator SB3 Stuart PD
Water bath set at 37 °C VWR PD
XCell SureLock Mini-Cell electrophoresis system ThermoFisher Scientific MS
Easy-nLC 1200 UHPLC Thermo Scientific MS
Q exactive Mass Spectrometer Thermo Scientific MS
Software Version
MaxQuant 2.0.3.0 MS
Perseus 1.6.14.0 MS
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcárcel, J., Hentze, M. W. RNA-binding proteins in human genetic disease. Nature Reviews Genetics. 22 (3), 185-198 (2021).
  2. Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
  3. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  4. Cooper, T. A., Wan, L., Dreyfuss, G. RNA and disease. Cell. 136 (4), 777-793 (2009).
  5. Qin, H., et al. RNA-binding proteins in tumor progression. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 90 (2020).
  6. Nussbacher, J. K., Tabet, R., Yeo, G. W., Lagier-Tourenne, C. Disruption of RNA metabolism in neurological diseases and emerging therapeutic interventions. Neuron. 102 (2), 294-320 (2019).
  7. Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. Journal of Genetics and Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
  8. Maziuk, B., Ballance, H. I., Wolozin, B. Dysregulation of RNA binding protein aggregation in neurodegenerative disorders. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 89 (2017).
  9. Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (5), 1557-1562 (2006).
  10. Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
  11. Weidmann, C. A., Mustoe, A. M., Jariwala, P. B., Calabrese, J. M., Weeks, K. M. Analysis of RNA-protein networks with RNP-MaP defines functional hubs on RNA. Nature Biotechnology. 39 (3), 347-356 (2021).
  12. Graindorge, A., et al. In-cell identification and measurement of RNA-protein interactions. Nature Communications. 10 (1), 5317 (2019).
  13. Ule, J., Hwang, H. W., Darnell, R. B. The future of cross-linking and immunoprecipitation (CLIP). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (8), 032243 (2018).
  14. Ascano, M., Hafner, M., Cekan, P., Gerstberger, S., Tuschl, T. Identification of RNA-protein interaction networks using PAR-CLIP. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (2), 159-177 (2012).
  15. McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biology. 15 (1), 203 (2014).
  16. Sugimoto, Y., et al. Analysis of CLIP and iCLIP methods for nucleotide-resolution studies of protein-RNA interactions. Genome Biology. 13 (8), (2012).
  17. Bayat, P., et al. SELEX methods on the road to protein targeting with nucleic acid aptamers. Biochimie. 154, 132-155 (2018).
  18. Armaos, A., Colantoni, A., Proietti, G., Rupert, J., Tartaglia, G. G. CatRAPID omics v2.0: Going deeper and wider in the prediction of protein-RNA interactions. Nucleic Acids Research. 49, 72-79 (2021).
  19. Agostini, F., et al. CatRAPID omics: A web server for large-scale prediction of protein-RNA interactions. Bioinformatics. 29 (22), 2928-2930 (2013).
  20. Zacco, E., et al. Probing TDP-43 condensation using an in silico designed aptamer. Nature Communications. 13 (1), 3306 (2022).
  21. Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42 (2), 13 (2014).
  22. Zhang, Y., Lai, B. S., Juhas, M. Recent advances in aptamer discovery and applications. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
  23. UniProt Consortium. UniProt: the Universal Protein Knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Research. 51, 523-531 (2023).
  24. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  25. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  26. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  27. Bellucci, M., Agostini, F., Masin, M., Tartaglia, G. G. Predicting protein associations with long noncoding RNAs. Nature Methods. 8 (6), 444-445 (2011).
  28. Gallo-Oller, G., Ordoñez, R., Dotor, J. A new background subtraction method for Western blot densitometry band quantification through image analysis software. Journal of Immunological Methods. 457, 1-5 (2018).
  29. Weissinger, R., Heinold, L., Akram, S., Jansen, R. P., Hermesh, O. RNA proximity labeling: A new detection tool for RNA-protein interactions. Molecules. 26 (8), 2270 (2021).
  30. Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
  31. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).

Tags

RNA-binding ProteinsPull-down AnalysisBiotinylated RNAProtein ComplexesHEK 293T CellsLysis BufferMagnetic BeadsYeast TRNARNA Oligonucleotide

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Crua Asensio, N., Rizzieri, S., Cuomo, A., Tartaglia, G. G., Zacco, E. An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA. J. Vis. Exp. (192), e64923, doi:10.3791/64923 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image