短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

1.一般的な方法と材料 選択した哺乳類細胞培養に適した培地を準備し、使用前に37°Cで20分間予熱します。 材料の表に記載されているように、必要な材料を事前に準備してください。オートクレーブガラス製品、プラスチック製品、およびバッファーストック。 表 1 の説明に従ってバッファーを準備します。成分を最終容量に希釈する前に、濃縮HClまたはNaOHを使用してストック溶液のpHを調整します。 2. 哺乳類細胞株の調製 10%ウシ胎児血清(FBS)と100 μg/mLペニシリン/ストレプトマイシン溶液を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)でHEK 293T細胞を増殖させます。5%CO2を供給した加湿インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。定期的にセルを分割します。 剥離する前に、成長表面を覆うのに十分なリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液で細胞を洗い流してください。 PBSを取り外し、トリプシン-EDTA溶液の超薄層を追加します。 5%CO2 を備えた加湿インキュベーター内で細胞を37°Cで5分間、または細胞が剥離するまでインキュベートします(顕微鏡観察下では分散しているように見えます)。 完全なDMEMを加えてトリプシン-EDTA溶液を10倍に希釈し、不活性化して細胞をカウントします。 1.5 x 105 細胞/mLを6ウェルプレートにプレートし、テストする2つのウェル/条件を考慮します。 細胞を5%CO2を含む加湿インキュベーター内で37°Cで48時間インキュベートします。注:細胞株に適した培地とサプリメントの種類については、製造元の説明書を確認してください。また、トリプシン-EDTAの量やインキュベーション時間は細胞株によって異なります。一部の細胞型は、このプロトコルで報告されたものよりも速く/遅く成長します。したがって、播種濃度は事前にテストする必要があります。 3.総タンパク質収穫量 細胞が増殖しているウェルから培地を除去します。 6ウェルプレートの各ウェルを1 mLのPBSで洗浄します。 PBS を破棄します。 プレートを氷上に移動し、ステップ3.5に進むか、乾燥プレートを-80°Cで凍結して溶解を促進します。 200 μLの溶解バッファーを各ウェルに加えます。 セルスクレーパーを使用して、セルを切り離したり壊したりします。 2つのウェルに由来する細胞抽出液を同じ1.5 mLチューブに移します。 タンパク質抽出物を含むチューブを氷上に30分間置きます。 細胞ライセートを17,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 各上清を予冷チューブに移します。注:PD条件ごとに合計10個の6-10 7 セルが推奨されます。細胞溶解とタンパク質の採取は、氷冷バッファーを使用して行う必要があります。プロテアーゼ阻害剤は、タンパク質の分解を防ぐために溶解バッファーに添加する必要があります。 4. タンパク質濃度測定 生産者が示すように、ブラッドフォード試薬をdH2Oで5倍に希釈して調製します。 試薬1 mLを1 cmキュベットに入れ、サンプルを1 μL加え、転倒混合します。 暗所で室温で5〜10分間インキュベートします。 595 nmでの吸光度を読み取ります。 1.5 mgのタンパク質に相当するタンパク質抽出物の量を計算し、溶解バッファーを使用してすべてのサンプルを最終容量600 μLにします。 使用するまでサンプルを氷上に保管してください。注:バッファー適合性の推奨事項に従って、他のタンパク質濃度決定方法を使用できます。いずれの場合も、溶解バッファーはブランクとして使用する必要があります。多くの試薬はジチオスレイトール(DTT)と互換性がありません。タンパク質定量(DTTを最終濃度1 mMまで)の後にのみDTTまたは他の還元剤を添加することをお勧めします。 5.ビーズの準備 チューブをフリックして、保存バッファー内のビーズを混合します。 100 μLのスラリー媒体/サンプルを計算し、その容量を磁気ラックに入れます。 ビーズウォッシュ保存液を取り出し、1 mLの溶解バッファー/チューブを加えてビーズを洗浄し、手動で反転させます。 磁気ラックを使用してバッファーを取り外します。 洗浄手順を繰り返します。 スラリー培地の初期容量に等しい量の溶解バッファーを加え、チューブをフリックして混合し、サンプルと同じ数の1.5 mLチューブに培地を均一に分注します。 ビードブロッキング磁気ラックを使用してバッファーを除去し、溶解バッファーで調製した酵母tRNAの0.25 mg/mL溶液600 μLを追加します。 回転ホイール上で室温で1時間インキュベートします。 磁気ラックを使用してtRNA溶液を除去します。 600 μLの溶解バッファーを加え、手動で混合して洗浄します。 洗浄ステップを繰り返し、バッファーを廃棄します。 6.ビードローディング 最初の100 μLのスラリー培地(現在はブロックビーズ)を含む各チューブについて、600 μLの溶解バッファー中に200 μgのRNAオリゴヌクレオチドを調製します。 オリゴをビーズに加え、回転させながら室温で1時間インキュベートします。 溶液を取り出し、600 μLの溶解バッファーを加え、室温でチューブを5分間回転させてビーズを2回洗浄します。 バッファーを破棄します。注意: ビーズをボルテックスしないでください、代わりにフリックします。必要な場合を除いて、ピペッティングステップの数を制限します。可能であれば、カット、1 mLチップを使用してください。ビーズスラリー培地/サンプルの量は、ビーズの結合能力と総タンパク質の開始量に依存します。RNAオリゴがかなりの量の二次構造を有すると予測される場合は、まず80°Cで10分間変性させた後、室温でゆっくりと冷却するか、30°Cで1時間インキュベートしてリフォールドすることをお勧めします。ローディングに必要な量を最適化し、RNAの再利用の可能性を評価するために、ビーズローディング後にRNAオリゴを回収し、残存濃度を決定することをお勧めします。 7. ビーズへのタンパク質結合 注意: 今後は、可能であれば、4°Cで手順を実行してください。 600 μLのタンパク質溶液から5%の容量を取り、さらに分析するためにINPUT(IN)として保持します(1.5 mgのタンパク質が600 μLに溶解するため、5%は30 μLおよび75 μgのタンパク質に相当します)。 残りのタンパク質混合物をロードしたビーズの各チューブに加え、4°Cで一晩ゆっくりと回転させます。 8.非特異的結合剤の洗浄 磁気ラックを使用して、バインドされていない部分を取り外します。容量の5%を保存し、FLOWTHROUGH(FT)としてラベル付けします(非結合容量は約600 μLなので、さらに分析するために30 μLを保管してください)。 ビーズに1 mLの洗浄バッファー1を加え、4°Cで5分間回転させます。 バッファーを破棄します。 手順 8.2 と 8.3 を繰り返します。 ビーズに洗浄バッファー2 1 mLを加え、4°Cで5分間回転させます。 上澄み液を捨てる。 9. 特定のバインダーの溶出 100 μLの溶出バッファー1または溶出バッファー2をビーズに加えます。 フリックして手動で混合し、室温で5分間インキュベートします。 チューブをサーモミキサーに入れ、95°Cで5分間激しく振とうします。 チューブを磁気ラックに入れ、溶出した画分をきれいなチューブに集めます。 ベンチ遠心分離機でビーズをすばやく回転させ、溶出液の回収率を最大化します。 さらなる分析のために、総溶出液(EL)容量の5%を節約します(総容量は100 μLなので、5 μLを別のチューブに分けます)。 必要に応じて、タンパク質濃度は、溶出バッファーをブランクとして使用することにより、セクション4のように決定できます。注:タンパク質濃度が決定されるまで、溶出バッファーへのDTTの添加を控えることをお勧めします。タンパク質定量が不要な場合、または還元剤と互換性のあるタンパク質定量キットが利用可能な場合は、最初から1 mM DTTを溶出バッファーに添加できます。このプロトコルでは、溶出バッファー1(1 M NaClを含む)と溶出バッファー2(2 M NaClを含む)の両方をテストしました。イオン強度の増加による標的タンパク質の溶出効率の差は認められませんでしたが、最も適切なバッファーを確立する前に両方の条件をテストすることをお勧めします。溶出バッファー中の塩の存在が多いことがさらなる分析の限界となる場合、溶出バッファー中の界面活性剤の量が非常に少ないため、バッファー交換が可能です。別の方法として、溶出液を所望の塩濃度に達するように希釈することができる。 10. 質量分析によるタンパク質結合剤の同定 アセトン沈殿溶出したタンパク質を冷(-20°C)アセトンで4倍に希釈して濃縮します。 チューブをボルテックスし、-20°Cで一晩インキュベートします。 17,000 x g で4°Cで30分間スピンします。 上清を静かに取り除き、ペレットが完全に乾くまでアセトンを蒸発させます。 溶液中のタンパク質消化50 μLの変性バッファーを加えてタンパク質ペレットを溶解します。 DTTを最終濃度5 mMまで添加し、55°Cで30分間タンパク質を還元します。 サンプルを室温で冷却し、ヨードアセトアミド(IAA)を10 mMの濃度で15分間添加してタンパク質アルキル化反応を進めます。 適切な酵素(トリプシン、LysC)を使用してタンパク質を消化し、サンプルを37°Cで一晩インキュベートします。 1 μLの10%トリフルオロ酢酸(TFA)を加えて消化を停止します。 ペプチドをクリーンアップし、前述のようにカスタム逆相C18マイクロカラムに濃縮します19。 C18チップからペプチドをバッファーBで溶出します。 真空遠心分離機を使用して有機成分を除去し、さらなる分析のためにペプチドを5 μLの0.1%ギ酸に再懸濁します。注:あるいは、非特異的結合剤を洗浄した直後にタンパク質消化を「オンビーズ」で実行できるため(ステップ8.1〜8.6)、プロトコルが高速になります。ただし、最適な実験タンパク質配列カバレッジを保証するために、溶液消化の標準と比較して「ビーズ上」固定化タンパク質を作動させる酵素の効率をテストすることをお勧めします。 液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)分析カラム(C18-固定相)を接続し、運転中は45°Cに保ちます。 シングルカラム構成で、キャピラリーフィンガータイトフィッティング(20 μm x 550 mm)を介して、LCポンプの6ポートロータリーバルブの出口にカラムを接続します。 LC 設定を次のように調整します。制御された圧力(980 bar)下でペプチドをバッファーAにロードします。 5%-20%のバッファーBグラジエントを300 nL/minで59分間適用し、続いて20%-30%のバッファーBグラジエントを15分間、30%-65%のバッファーBグラジエントを5分間適用します。 バッファーBの濃度を5分間で最大95%まで増加させ、さらに95%バッファーBで5分間のアイソクラティックステップを追加して、洗浄ステップを追加します。 質量分析計をデータ依存取得(DDA)モードで操作して、MSイベントとMSMSイベントを自動的に切り替えます。 MS イベントと MSMS イベントに対して、自動ゲイン制御 (AGC) ターゲット値 3 x 106 と 1 x 105 を使用して、ループ カウントを 15 に定義します。 最大許容イオン蓄積時間を、分解能60 KのMSの場合は20 ms、分解能15 KのMSMSの場合は100 msに設定します。 28%の正規化された衝突エネルギーを使用して、20秒の動的排除時間で高衝突解離(HCD)フラグメンテーション実験を実行します。 ソースパラメータを次のように操作します。スプレー電圧:1.7 kV毛細管電圧:275°Cシースも補助ガスも使用しない注:このプロトコルでは、超高速液体クロマトグラフィー(UHPLC)質量分析(MS)分析は、ハイブリッドトリプル四重極orbitrap装置と組み合わせたLCシングルカラムセットアップを使用して特別に実行されています(材料表)。他のLCMSシステムも使用できますが、パラメータの適応が推奨されます。 データ分析[読み込み] ボタンを使用して、生ファイルをインポートします。 [ 実験の設定 ] ボタンをクリックして、実験名を定義します。 グループ固有のパラメータセクションを入力して、識別に関連するすべてのパラメータを指定します。消化に使用される酵素:トリプシン/ P胸の谷間を逃した:最大3つ修正済み修飾: カルバミドメチル化可変修飾:N-アセチル(タンパク質)、酸化(M) UniprotKB などのパブリック データベースから入手できる更新された FASTA ファイルをアップロードします。 選択したデータベースのソースに応じて正しい解析ルールを指定します。 タンパク質とペプチドの両方について、親子関係の偽発見率(FDR)値= 1を定義します。 ラベルフリー定量(LFQ)オプションをラベルフリー定量タブに追加します。 LFQ 比の最小カウントは 2 に保ちます。注:ここでは、MaxQuant24 とPerseusソフトウェア25 を使用して、タンパク質の定量とその後の統計分析をそれぞれ実行するデータ分析について説明します。しかしながら、データ分析は、他の任意の市販または無料のバイオインフォマティクスを用いて行うことができる。FDRは、ターゲットデコイデータベースベースのアプローチ26を使用して推定されます。FDRが0.01に等しいペプチドおよびタンパク質は、同定されたペプチドおよびタンパク質が1%の偽陽性を含むと予想されることを意味する。 統計解析タンパク質グループ.txtファイルをロードして、タンパク質レベルで統計解析を実行します。 LFQ 値をメイン列として定義します。 カテゴリ列に基づいて行をフィルタリングすることにより、「逆」と「汚染物質」を削除します。 カテゴリ注釈行を使用して、さまざまな実験条件をグループ化します。 データ行列を減らし、以前に定義した各グループの有効な値の数を選択します。 実験条件により適した統計的検定を選択します(すなわち、 t検定、複数サンプル検定ANOVA)。 FDRベースの計算で有意なヒントのカットオフを決定します。通常、0.01 と 0.05 の両方が調整済み p 値のしきい値として受け入れられます。 火山プロット表現を使用して、 t検定統計量に基づく差分解析の結果を視覚化します。 最終結果テーブルをさらに編集するために、最終マトリックスを.txt形式でエクスポートします。注:構成フォルダーには、グローバルプロテオミクス実験で一般的な汚染物質と見なされるケラチンなどのタンパク質を含むFASTAファイルが含まれており、出力テーブルでは+のフラグが付けられています。本研究では、2つのサンプル条件を持ち、統計分析に t検定を使用します。 11. ウェスタンブロットによる結果検証 サンプル調製適切な量の4xサンプルローディングバッファーをIN、FT、およびELの各アリコートに追加します。 サンプルを95°Cで5分間煮沸します。 チューブの上部から蒸発したサンプルを回収するための高速スピン。 SDS-PAGEとゲル転写サンプルを4%〜12%の変性ポリアクリルアミドゲルにロードします。 MES SDSランニングバッファーを使用して、120 Vで1.5時間ゲルを実行します。 製造元の指示に従って、半乾式転写カセットを使用してニトロセルロース膜上にゲルを移します。15 V で 10 分の転送をお勧めします。 免疫検出穏やかに攪拌しながら、10%ウシ血清アルブミン(BSA)で室温で1時間膜をブロックします。 製造元の指示に従って、5%BSAで調製した一次抗体をTBSTに追加します。穏やかに攪拌しながら、4°Cで一晩または室温で1時間放置します。 膜をTBSTで3回、毎回5分間洗浄します。 TBSTで調製した二次抗体を撹拌下で室温で1時間添加する。 膜をTBSTで3回、毎回5分間洗浄します。 ブロットイメージャーを使用して結果を視覚化します。注:当社のRNAの既知のバインダーであるTDP-43を検出するために、組換えウサギモノクローナル抗体を使用し、メンブレンとともに4°Cで一晩放置しました。 二次抗体として抗ウサギIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を用いたが、蛍光二次抗体も同様に機能する。メンブレン上の抗体を可視化するために、メンブレンをクラリティウエスタンECL基質とともに1分間インキュベートしてから、ChemiDocイメージングシステムでイメージングしました。