In dieser Arbeit stellen wir eine optimierte in vitro Methode vor, um Proteininteraktoren spezifischer RNA-Sequenzen aufzudecken, zu quantifizieren und zu validieren, wobei Gesamtproteinextrakt aus menschlichen Zellen, Streptavidin-Kügelchen, die mit biotinylierter RNA beschichtet sind, und Massenspektrometrie-Analysen verwendet werden.
Protein-RNA-Interaktionen regulieren die Genexpression und zelluläre Funktionen auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene. Aus diesem Grund ist die Identifizierung der Bindungspartner einer RNA von großer Bedeutung, um die Mechanismen hinter vielen zellulären Prozessen aufzudecken. RNA-Moleküle können jedoch vorübergehend und dynamisch mit einigen RNA-bindenden Proteinen (RBPs) interagieren, insbesondere mit nicht-kanonischen Proteinen. Daher sind verbesserte Methoden zur Isolierung und Identifizierung solcher RBPs dringend erforderlich.
Um die Proteinpartner einer bekannten RNA-Sequenz effizient und quantitativ zu identifizieren, haben wir eine Methode entwickelt, die auf dem Pull-down und der Charakterisierung aller interagierenden Proteine, ausgehend von zellulärem Gesamtproteinextrakt, basiert. Wir optimierten den Protein-Pulldown mit biotinylierter RNA, die auf Streptavidin-beschichteten Beads vorgeladen war. Als Proof-of-Concept verwendeten wir eine kurze RNA-Sequenz, von der bekannt ist, dass sie das Neurodegeneration-assoziierte Protein TDP-43 bindet, und eine Negativkontrolle mit einer anderen Nukleotidzusammensetzung, aber gleicher Länge. Nachdem wir die Beads mit Hefe-tRNA blockiert hatten, luden wir die biotinylierten RNA-Sequenzen auf die Streptavidin-Beads und inkubierten sie mit dem Gesamtproteinextrakt aus HEK 293T-Zellen. Nach Inkubation und mehreren Waschschritten zur Entfernung unspezifischer Bindemittel eluierten wir die interagierenden Proteine mit einer Hochsalzlösung, die mit den am häufigsten verwendeten Proteinquantifizierungsreagenzien und mit der Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie kompatibel ist. Wir quantifizierten die Anreicherung von TDP-43 im Pull-Down, der mit dem bekannten RNA-Binder durchgeführt wurde, im Vergleich zur Negativkontrolle mittels Massenspektrometrie. Wir verwendeten die gleiche Technik, um die selektiven Wechselwirkungen anderer Proteine zu verifizieren, von denen computergestützt vorhergesagt wurde, dass sie einzigartige Bindemittel unserer RNA von Interesse oder der Kontrolle sind. Schließlich validierten wir das Protokoll mittels Western Blot durch den Nachweis von TDP-43 mit einem geeigneten Antikörper.
Dieses Protokoll wird die Untersuchung der Proteinpartner einer RNA von Interesse unter nahezu physiologischen Bedingungen ermöglichen und dazu beitragen, einzigartige und unvorhergesehene Protein-RNA-Interaktionen aufzudecken.
RNA-bindende Proteine (RBPs) haben sich zu entscheidenden Akteuren bei der transkriptionellen und posttranskriptionellen Genregulation entwickelt, da sie an Prozessen wie dem Spleißen von mRNA, der zellulären Lokalisierung, Translation, Modifikation und dem Abbau von RNA beteiligt sind 1,2,3. Solche Wechselwirkungen zwischen den beiden Makromolekülen sind hochgradig koordiniert, präzise ausbalanciert und essentiell für die Bildung von Funktions- und Verarbeitungszentren. Variationen oder Dysregulationen innerhalb dieser Hubs haben das Potenzial, die fein regulierten Protein-RNA-Netzwerke zu stören und werden zunehmend mit einer Vielzahl menschlicher Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter Krebs 4,5 und neurodegenerative Erkrankungen 6,7,8. Die Wechselwirkungen zwischen RNA-Molekülen und ihren Proteinbindungspartnern können entweder stabil und experimentell leicht zu validieren sein, oder hochdynamisch, transient und schwieriger zu charakterisieren sein.
In den letzten Jahren wurden intensive Anstrengungen unternommen, um diese Wechselwirkungen zu verstehen. Unter den etabliertesten Methoden sind Protein-Pull-Down-Assays (PDs) wahrscheinlich die am meisten geschätzten und am häufigsten verwendeten Ansätze, um die Hauptakteure zu entschlüsseln, aus denen Ribonukleoprotein-Komplexe (RNP) und andere Protein-RNA-Interaktionsnetzwerke bestehen 3,9,10. PDs umfassen ein breites Spektrum an informativen Techniken, wie z. B. die Immunpräzipitation entweder der RNA (RIP)11,12 oder des interessierenden Proteins (CLIP)13,14. Einige dieser RNA-PD-Protokolle verwenden eine bekannte RNA als Köder für Proteine15, am häufigsten unter Ausnutzung von Tags mit hoher Affinität wie Biotin. In diesem Fall können die Interaktionspartner einer biotinylierten RNA durch Verankerung der RNA auf Streptavidin-beschichteten Beads nachgewiesen werden, was eine effiziente Isolierung der RNPs ermöglicht. Die Haupteinschränkungen dieser Ansätze sind in der Regel das Design der biotinylierten Sonden und die Prüfung ihrer Fähigkeit, Zielproteine zu binden. Zu diesem Zweck könnte es sinnvoll sein, sich auf veröffentlichte CLIP-Daten des interessierenden Proteins zu stützen, sofern verfügbar, da sie mit hoher Präzision die kurzen RNA-Regionen zeigen, die den Peaks der Wechselwirkungen mit dem Zielprotein entsprechen13,16. Dieselben Regionen könnten für die Entwicklung von Sonden für Parkinson-Inson verwendet werden. Eine alternative Methode zur Entwicklung solcher RNA-Köder könnte die systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX)17 sein, die das Design von Aptameren durch In-vitro-Selektion ermöglichen, ausgehend von einer umfassenden randomisierten Bibliothek und über eine Reihe von PCR-gesteuerten Optimierungszyklen. SELEX ist jedoch komplex und zeitaufwändig, und die Endergebnisse hängen stark von der ursprünglichen Bibliothek ab. Um den RNA-Köder auszuwählen, der in dem hier vorgestellten Protokoll verwendet werden soll, wurde ein weiterer Ansatz ausgenutzt, der darin besteht, einen RNA-Köder zu verwenden, der de novo mit Hilfe der Rechenleistung des Algorithmus catRAPID entwickelt wurde, der die bevorzugte Bindung eines gegebenen Proteins an bestimmte RNA-Sequenzen vorhersagt18,19,20.
Bei dem hier vorgestellten Protokoll handelt es sich um eine Version einer RNA-PD, die für die Eluierung spezifischer Proteinpartner unter nahezu physiologischen Bedingungen optimiert ist, ohne den Einsatz von Detergenzien, Denaturierungsmitteln oder hohen Temperaturen. Es beruht auf nano-superparamagnetischen Kügelchen, die kovalent mit hochreinem Streptavidin beschichtet sind, und der Verwendung einer spezifischen, in silico entwickelten biotinylierten RNA als Köder. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und effiziente Methode, um die Bindungspartner von biotinylierten RNA-Molekülen unter nativen Bedingungen zu isolieren, und bietet das Potenzial für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen. Um dieses Protokoll zu testen, wurde eine 10-Nukleotid-Einzelstrang-RNA-Aptamer-Sequenz verwendet, die zuvor entwickelt wurde, um das Protein TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) mit hoher Affinität und Spezifität zu binden20. Ausgehend von HEK 293T-Zelllysaten wurden die Interaktoren des biotinylierten RNA-Aptamers mittels massenspektrometrischer Analyse an Proben identifiziert, die mit einem hypertonen Puffer vom RNA-Köder gelöst wurden. Diese Analyse bestätigte die erfolgreiche Identifizierung und Quantifizierung von TDP-43 als bevorzugtes Bindemittel.
Dieses Protokoll ermöglicht die erfolgreiche Identifizierung von Proteininteraktoren mit nur einem kurzen, in vitro synthetisierten RNA-Oligonukleotid. Darüber hinaus garantiert die Verwendung von in silico designten RNA-Aptameren als PD-Sonden21,22 Spezifität für die Targets bei deutlich reduzierten Kosten.
Diese Arbeit berichtet über die Optimierung eines PD-Protokolls, das mit biotinylierten RNA-Oligonukleotiden durchgeführt wurde, um deren Proteininteraktoren zu erfassen. Das hier beschriebene Protokoll ist einfach durchzuführen, benötigt wenig Material und liefert sehr zuverlässige Ergebnisse. Wichtig ist, dass die neuartigsten Aspekte dieses Protokolls in der Verwendung eines RNA-Köders bestehen, der vollständig in silico entwickelt wurde und spezifisch für das Proteinziel ist, und der Elution aller Proteine, die an den RNA-Köder gebunden sind, indem ihre Wechselwirkungen mit einer Lösung mit hohem Salzgehalt direkt unterbrochen werden, anstatt das Streptavidin mit Detergens und Hochtemperaturbehandlung vom Biotin zu dissoziieren.
Dieses Protokoll macht sich die Stärke der Bindung zwischen Biotin und Streptavidinzunutze 29,30. Entsprechend den gewählten Streptavidin-Kügelchen muss die Beladung der biotinylierten RNA getestet und quantifiziert werden, bevor fortgefahren wird. Außerdem könnte die dreidimensionale Faltung der RNA die Beladungseffizienz der Beads beeinflussen, da sie die Exposition des Biotins gegenüber dem Streptavidin begrenzen könnte. Das Blockieren der Beads mit nicht-biotinylierter tRNA verbessert die Reinheit der Ergebnisse, indem unspezifische Wechselwirkungen mit den Beads begrenzt werden. Der Beladungspuffer und der Elutionspuffer müssen in Abhängigkeit von den nachgeschalteten Anwendungen gewählt werden. Hier wurden sehr milde Bedingungen vorgeschlagen, die für die Mehrzahl der Anwendungen geeignet sind und entwickelt wurden, um potentielle Proteinkomplexe zu erhalten. Diese Methode ist jedoch sehr anpassungsfähig; Der Benutzer kann eine beliebige Zelllinie und eine beliebige RNA-Größe auswählen und sich entscheiden, das Protokoll nach dem Falten/Entfalten der RNA zu wiederholen, um den Einfluss der Struktur auf die Bindungseigenschaften zu bestimmen.
Ein weiterer origineller Aspekt dieses Protokolls ist die Verwendung von In-silico-Vorhersagewerkzeugen, um die Korrektheit der Ergebnisse sicherzustellen20. Im Voraus zu wissen, welche Proteine als Interaktoren der interessierenden RNA identifiziert werden sollten, bietet den beispiellosen Vorteil, die technischen Aspekte des Protokolls zu validieren. Mit einer einfachen WB-Analyse ist es beispielsweise möglich, das Vorhandensein eines bekannten Proteinziels in den Proben zu überprüfen, die aus den verschiedenen Schritten des Protokolls stammen, bevor mit der MS-Analyse fortgefahren wird, was spezielle Instrumente erfordert und teurer ist. Darüber hinaus wurde kürzlich über eine Methode berichtet, mit der cat RAPID20, ein interner Protein-RNA-Vorhersagealgorithmus, verwendet werden kann, um de novo RNA spezifisch für ein Zielprotein zu entwerfen. Bis vor kurzem war die einzige verfügbare Pipeline zur Entwicklung von DNA/RNA-Aptameren für ein Zielprotein der SELEX-Ansatz (systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung)31. Die In-silico-Methode ermöglicht ein wesentlich schnelleres und kostengünstigeres Design von RNA-Aptameren.
Die Haupteinschränkungen dieser Methode sind mit der Notwendigkeit verbunden, in nukleasefreien Puffern und Werkzeugen zu arbeiten. Wenn es als notwendig erachtet wird, die Bindung zwischen einer de novo-designten RNA und einem Zielprotein vor der Parkinson-Krankheit in vitro zu bestätigen, muss das Protein hergestellt und gereinigt und die Bindung mit biophysikalischen Ansätzen bestimmt werden. Dies ist eine Einschränkung, die mit der Produktion von monoklonalen Antikörpern geteilt wird.
Trotz dieser kleineren Probleme können zuverlässige Methoden zur Kartierung von RNA-Protein-Interaktionen, wie die hier vorgestellte, Wissenschaftler näher an die Enthüllung makromolekularer Netzwerke und komplexer Hauptakteure vieler physiologischer und pathologischer Mechanismen bringen, wie z. B. solche, die an Krebs, Kardiomyopathien, Diabetes, mikrobiellen Infektionen sowie genetischen und neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich bei der Forschungsgruppe von Prof. Tartaglia und Dr. Cuomo für die angebotene Unterstützung. Das E.Z. erhielt eine Förderung aus dem MINDED-Stipendium des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Fördervereinbarung Nr. 754490.
6-well tissue culture plates | VWR | 10861-554 | CELLS |
Cell scrapers | BIOSIGMA | 10153 | CELLS |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientfic | 11995065 | CELLS |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil | Thermo Fisher Scientfic | 10500064 | CELLS |
Phosphate Buffer Saline (PBS, Waltham, MA) | Thermo Fisher Scientfic | 14190169 | CELLS |
Trypsin (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientfic | 15050065 | CELLS |
Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP) | Cellsignal | 7070 | PD |
Biotinylated RNA | Eurofins | Custom RNA oligonucleotides | PD |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | PD |
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Biorad | 1705061 | PD |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Merck – Sigma Aldrich | 5056489001 | PD |
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | PD |
Recombinant anti-TDP43 antibody | Abcam | ab109535 | PD |
Ribonucleic acid, transfer from baker's yeast (S. cerevisiae) | Merck – Sigma Aldrich | R5636-1ML | PD |
Streptavidin Mag Sepharose | Merck – Sigma Aldrich | GE28-9857-99 | PD |
Trans-Blot Turbo RTA Mini 0.2 µm PVDF Transfer Kit | Biorad | 1704272 | PD |
Acetone | Thermo Fisher Scientfic | 022928.K2 | MS |
C18 cartridge | Thermo Fisher Scientfic | 13-110-018 | MS |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientfic | 20290 | MS |
EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | ES902 | MS |
iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich S.r.l. | I6125 | MS |
Lys-C/Trypsin | Promega | V5073 | MS |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientfic | 28904 | MS |
Urea | Thermo Fisher Scientfic | J75826.A7 | MS |
Equipment | |||
ChemiDoc imaging system | Bio-Rad | CELLS | |
Dyna Mag -2 , Magnetic rack | Invitrogen | CELLS | |
Forma Series 3 water jacketed C02 incubator | Thermo Scientific | PD | |
PROTEAN II xi cell , power supply for PAGE applications | Bio-Rad | PD | |
Rotating wheel, rotator SB3 | Stuart | PD | |
Water bath set at 37 °C | VWR | PD | |
XCell SureLock Mini-Cell electrophoresis system | ThermoFisher Scientific | MS | |
Easy-nLC 1200 UHPLC | Thermo Scientific | MS | |
Q exactive Mass Spectrometer | Thermo Scientific | MS | |
Software | Version | ||
MaxQuant | 2.0.3.0 | MS | |
Perseus | 1.6.14.0 | MS |