Hier presenteren we een geoptimaliseerde in vitro methode om eiwitinteractoren van specifieke RNA-sequenties te ontdekken, kwantificeren en valideren, met behulp van totaal eiwitextract uit menselijke cellen, streptavidineparels bedekt met gebiotinyleerd RNA en massaspectrometrie-analyse.
Eiwit-RNA-interacties reguleren genexpressie en cellulaire functies op transcriptioneel en post-transcriptioneel niveau. Om deze reden blijft het identificeren van de bindende partners van een RNA van belang van groot belang om de mechanismen achter veel cellulaire processen te onthullen. RNA-moleculen kunnen echter tijdelijk en dynamisch interageren met sommige RNA-bindende eiwitten (RBP’s), vooral met niet-canonieke eiwitten. Daarom zijn verbeterde methoden om dergelijke RBP’s te isoleren en te identificeren hard nodig.
Om de eiwitpartners van een bekende RNA-sequentie efficiënt en kwantitatief te identificeren, ontwikkelden we een methode op basis van de pull-down en karakterisering van alle interagerende eiwitten, uitgaande van cellulair totaal eiwitextract. We optimaliseerden de eiwit pull-down met behulp van gebiotinyleerd RNA vooraf geladen op streptavidin-gecoate kralen. Als proof of concept gebruikten we een korte RNA-sequentie waarvan bekend is dat deze het neurodegeneratie-geassocieerde eiwit TDP-43 bindt en een negatieve controle van een andere nucleotidesamenstelling maar dezelfde lengte. Na het blokkeren van de kralen met gist-tRNA, laadden we de gebiotinyleerde RNA-sequenties op de streptavidin-kralen en incubeerden ze met het totale eiwitextract van HEK 293T-cellen. Na incubatie en verschillende wasstappen om niet-specifieke bindmiddelen te verwijderen, hebben we de interagerende eiwitten geëlueerd met een zoutrijke oplossing, compatibel met de meest gebruikte eiwitkwantificeringsreagentia en met monstervoorbereiding voor massaspectrometrie. We kwantificeerden de verrijking van TDP-43 in de pull-down uitgevoerd met het bekende RNA-bindmiddel in vergelijking met de negatieve controle door massaspectrometrie. We gebruikten dezelfde techniek om de selectieve interacties van andere eiwitten te verifiëren waarvan computationeel werd voorspeld dat ze unieke bindmiddelen zijn van ons RNA van belang of van de controle. Tot slot hebben we het protocol gevalideerd door western blot via de detectie van TDP-43 met een geschikt antilichaam.
Dit protocol zal de studie van de eiwitpartners van een RNA van belang in bijna-fysiologische omstandigheden mogelijk maken, waardoor unieke en onvoorspelbare eiwit-RNA-interacties worden ontdekt.
RNA-bindende eiwitten (RBP’s) zijn naar voren gekomen als cruciale spelers in transcriptionele en post-transcriptionele genregulatie, omdat ze betrokken zijn bij processen zoals mRNA-splicing, RNA-cellulaire lokalisatie, translatie, modificatie en afbraak 1,2,3. Dergelijke interacties tussen de twee macromoleculen zijn sterk gecoördineerd, nauwkeurig uitgebalanceerd en essentieel voor de vorming van functionele en verwerkingshubs. Variaties of ontregeling binnen deze hubs hebben het potentieel om de fijn gereguleerde eiwit-RNA-netwerken te verstoren en worden in toenemende mate geassocieerd met een verscheidenheid aan menselijke ziekten, waaronder kanker4,5 en neurodegeneratieve aandoeningen 6,7,8. De interacties tussen RNA-moleculen en hun eiwitbindende partners kunnen stabiel en gemakkelijk experimenteel te valideren zijn, of zeer dynamisch, van voorbijgaande aard en moeilijker te karakteriseren.
In de afgelopen jaren zijn er intensieve inspanningen geleverd om deze interacties te begrijpen. Onder de meest gevestigde methoden zijn eiwit pull-down assays (PD’s) waarschijnlijk de meest gewaardeerde en meest gebruikte benaderingen om de belangrijkste spelers te ontrafelen die ribonucleoproteïne (RNP) -complexen en andere eiwit-RNA-interactienetwerken vormen 3,9,10. PD’s omvatten een brede paraplu van informatieve technieken, zoals de immunoprecipitatie van het RNA (RIP) 11,12 of het eiwit (CLIP) 13,14 van belang. Sommige van deze RNA-PD-protocollen gebruiken een bekend RNA als lokaas voor eiwitten15, meestal door gebruik te maken van tags met een hoge affiniteit zoals biotine. In dit geval kunnen de interactiepartners van een gebiotinyleerd RNA worden gedetecteerd door het RNA te verankeren op streptavidin-gecoate kralen, waardoor een efficiënte isolatie van de RNP’s mogelijk is. De belangrijkste beperkingen van deze benaderingen zijn meestal het ontwerp van de gebiotinyleerde sondes en het testen van hun vermogen om doeleiwitten te binden. Voor dit doel kan het nuttig zijn om te vertrouwen op gepubliceerde CLIP-gegevens van het eiwit van belang, indien beschikbaar, omdat ze met hoge precisie de korte RNA-regio’s onthullen die overeenkomen met pieken van interacties met het doeleiwit13,16. Deze zelfde regio’s kunnen worden gebruikt om sondes voor PD’s te ontwikkelen. Een alternatieve methode om dergelijke RNA-lokaas te ontwerpen zou de systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX)17 kunnen zijn, die het ontwerp van aptameren mogelijk maakt door middel van in vitro selectie, uitgaande van een uitgebreide gerandomiseerde bibliotheek en via een reeks PCR-gestuurde optimalisatiecycli. SELEX is echter complex en tijdrovend en de uiteindelijke resultaten zijn sterk afhankelijk van de initiële bibliotheek. Om het RNA-aas te selecteren dat in het hier gepresenteerde protocol moet worden gebruikt, werd nog een andere benadering gebruikt, bestaande uit het gebruik van een RNA-aas dat de novo is ontworpen door middel van de rekenkracht van het algoritme catRAPID, dat de preferentiële binding van een bepaald eiwit aan bepaalde RNA-sequenties voorspelt18,19,20.
Het hier geïntroduceerde protocol is een versie van een RNA-PD die is geoptimaliseerd om specifieke eiwitpartners te elueren in bijna-fysiologische omstandigheden, zonder het gebruik van detergent, denatureringsmiddelen of hoge temperaturen. Het is gebaseerd op nano-superparamagnetische kralen covalent gecoat met sterk gezuiverd streptavidin en het gebruik van een specifiek in silico ontworpen gebiotinyleerd RNA als lokaas. Dit protocol biedt een snelle en efficiënte methode om de bindingspartners van gebiotinyleerde RNA-moleculen in inheemse omstandigheden te isoleren, en biedt het potentieel voor een breed scala aan downstream-toepassingen. Om dit protocol te testen, werd een 10-nucleotide enkelstrengs RNA-aptameersequentie gebruikt, eerder ontworpen om het eiwit TAR DNA-bindend eiwit 43 (TDP-43) met hoge affiniteit en specificiteit te binden,20. Uitgaande van HEK 293T-cellysaten werden de interactoren van het gebiotinyleerde RNA-aptameer geïdentificeerd door middel van massaspectrometrie-analyse uitgevoerd op monsters die losstonden van het RNA-aas met behulp van een hypertone buffer. Deze analyse bevestigde de succesvolle identificatie en kwantificering van TDP-43 als voorkeursbindmiddel.
Dit protocol maakt de succesvolle identificatie van eiwitinteractoren mogelijk met behulp van slechts een kort, in vitro gesynthetiseerd RNA-oligonucleotide. Bovendien garandeert het gebruik van in silico ontworpen RNA-aptameren als PD-sondes21,22 specificiteit voor de doelen tegen aanzienlijk lagere kosten.
Dit werk rapporteert de optimalisatie van een PD-protocol uitgevoerd met gebiotinyleerde RNA-oligonucleotiden om hun eiwitinteractoren te vangen. Het hier beschreven protocol is eenvoudig uit te voeren, vereist weinig materiaal en produceert zeer betrouwbare resultaten. Belangrijk is dat de meest nieuwe aspecten van dit protocol bestaan uit het gebruik van een RNA-aas dat volledig in silico is ontworpen en specifiek is voor het eiwitdoelwit, en de elutie van alle eiwitten die aan het RNA-aas zijn gebonden door hun interacties met een zoutrijke oplossing direct te verstoren, in plaats van door het streptavidin van het biotine te scheiden met reinigingsmiddel en behandeling bij hoge temperaturen.
Dit protocol maakt gebruik van de sterkte van de binding tussen biotine en streptavidin 29,30. Volgens de gekozen streptavidin-kralen moet het laden van het gebiotinyleerde RNA worden getest en gekwantificeerd voordat verder wordt gegaan. Ook kan de driedimensionale vouw van RNA de laadefficiëntie op de kralen beïnvloeden, omdat het de blootstelling van het biotine aan het streptavidine kan beperken. Het blokkeren van de kralen met niet-gebiotinyleerd tRNA verbetert de reinheid van de resultaten door niet-specifieke interacties met de kralen te beperken. De belastingsbuffer en de elutiebuffer moeten worden gekozen afhankelijk van de downstream-toepassingen. Hier werden zeer milde omstandigheden voorgesteld, geschikt voor de meeste toepassingen en ontwikkeld om potentiële eiwitcomplexen te behouden. Deze methode is echter zeer aanpasbaar; de gebruiker kan elke cellijn en elke RNA-grootte kiezen en kan besluiten het protocol te herhalen na het vouwen / ontvouwen van het RNA om het effect van de structuur op de bindingseigenschappen te bepalen.
Een ander origineel aspect van dit protocol is het gebruik van in silico voorspellingstools om de juistheid van de resultatente garanderen 20. Vooraf weten welke eiwitten moeten worden geïdentificeerd als interactoren van het RNA van belang geeft het ongekende voordeel van het valideren van de technische aspecten van het protocol. Met behulp van een eenvoudige WB-analyse is het bijvoorbeeld mogelijk om de aanwezigheid van een bekend eiwitdoel in de monsters afgeleid van de verschillende stappen van het protocol te verifiëren voordat u doorgaat met de MS-analyse, die gespecialiseerde instrumentatie vereist en duurder is. Daarnaast werd onlangs een methode gerapporteerd om catRAPID20, een intern eiwit-RNA-voorspellingsalgoritme, te gebruiken om de novo RNA specifiek voor een doeleiwit te ontwerpen. Tot voor kort was de enige beschikbare pijplijn om DNA/RNA-aptameren voor een doeleiwit te ontwerpen de SELEX-benadering (systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking)31. De in silico-methode maakt een veel sneller en kosteneffectief ontwerp van RNA-aptameren mogelijk.
De belangrijkste beperkingen van deze methode houden verband met de noodzaak om in nucleasevrije buffers en hulpmiddelen te werken. Bovendien, als het nodig wordt geacht om in vitro de binding tussen een de novo ontworpen RNA en een doeleiwit voorafgaand PD te bevestigen, moet het eiwit worden geproduceerd en gezuiverd en moet de binding worden bepaald met biofysische benaderingen. Dit is een beperking die wordt gedeeld met de productie van monoklonale antilichamen.
Ondanks deze kleine problemen kunnen betrouwbare methoden om RNA-eiwitinteracties in kaart te brengen, zoals hier gepresenteerd, wetenschappers dichter bij het onthullen van macromoleculaire netwerken en complexe hoofdactoren van vele fysiologische en pathologische mechanismen, zoals die betrokken zijn bij kanker, cardiomyopathieën, diabetes, microbiële infecties en genetische en neurodegeneratieve aandoeningen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen de onderzoeksgroep van Prof. Tartaglia en Dr. Cuomo bedanken voor de geboden ondersteuning. E.Z. ontving financiering van de MINDED fellowship van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie onder de Marie Sklodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 754490.
6-well tissue culture plates | VWR | 10861-554 | CELLS |
Cell scrapers | BIOSIGMA | 10153 | CELLS |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientfic | 11995065 | CELLS |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil | Thermo Fisher Scientfic | 10500064 | CELLS |
Phosphate Buffer Saline (PBS, Waltham, MA) | Thermo Fisher Scientfic | 14190169 | CELLS |
Trypsin (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientfic | 15050065 | CELLS |
Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP) | Cellsignal | 7070 | PD |
Biotinylated RNA | Eurofins | Custom RNA oligonucleotides | PD |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | PD |
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Biorad | 1705061 | PD |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Merck – Sigma Aldrich | 5056489001 | PD |
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | PD |
Recombinant anti-TDP43 antibody | Abcam | ab109535 | PD |
Ribonucleic acid, transfer from baker's yeast (S. cerevisiae) | Merck – Sigma Aldrich | R5636-1ML | PD |
Streptavidin Mag Sepharose | Merck – Sigma Aldrich | GE28-9857-99 | PD |
Trans-Blot Turbo RTA Mini 0.2 µm PVDF Transfer Kit | Biorad | 1704272 | PD |
Acetone | Thermo Fisher Scientfic | 022928.K2 | MS |
C18 cartridge | Thermo Fisher Scientfic | 13-110-018 | MS |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientfic | 20290 | MS |
EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | ES902 | MS |
iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich S.r.l. | I6125 | MS |
Lys-C/Trypsin | Promega | V5073 | MS |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientfic | 28904 | MS |
Urea | Thermo Fisher Scientfic | J75826.A7 | MS |
Equipment | |||
ChemiDoc imaging system | Bio-Rad | CELLS | |
Dyna Mag -2 , Magnetic rack | Invitrogen | CELLS | |
Forma Series 3 water jacketed C02 incubator | Thermo Scientific | PD | |
PROTEAN II xi cell , power supply for PAGE applications | Bio-Rad | PD | |
Rotating wheel, rotator SB3 | Stuart | PD | |
Water bath set at 37 °C | VWR | PD | |
XCell SureLock Mini-Cell electrophoresis system | ThermoFisher Scientific | MS | |
Easy-nLC 1200 UHPLC | Thermo Scientific | MS | |
Q exactive Mass Spectrometer | Thermo Scientific | MS | |
Software | Version | ||
MaxQuant | 2.0.3.0 | MS | |
Perseus | 1.6.14.0 | MS |