ヒト間葉系幹細胞の電気的挙動を特徴付けるための光誘起誘起誘電泳動

電圧と電極のカラーテストは、上記の手順を使用して完了しましたが、ステップ2.2.3とステップ2.2.10でわずかに変化しました。電圧試験では、電極の色と周波数を一定に保ち、5 V pp、10 V pp、および20 Vppを適用しました。電極発色試験では、印加電圧と周波数を30kHzと20Vppで一定に保ち、青、赤、白、黄色(それぞれHEXカラーコード#4472C4、#FF0000、#FFFFFF、#FFFF00で参照)の投影電極を調べました。細胞をトリパンブルーで染色し、血球計算盤を用いて生細胞と死細胞の数をカウントすることにより、細胞生存率を調べた。 LiDEPのセットアップにより、hMSCを操作し、入力周波数に応じてDEP応答曲線を生成することができました。印加電圧や投影電極の色(グラフィックエディタソフトウェアで作成した色違いの形状)などのパラメータを操作して、仮想電極で発生する不均一な交流電界に対して一貫したセルの挙動を観察することで、最適な動作条件を見つけるための一連の実験が行われました。非従来型DEPであるLiDEPを使用した細胞応答について収集されたデータを、3DEPアナライザーである従来のDEPの結果と比較しました。 最初の最適化テストでは、LiDEPチップ内のhMSC(つまり、仮想電極に向かって移動するセル)の正のDEP応答に焦点を当てました。正のDEP応答を示さないセルは、仮想電極から離れることによって負のDEP応答を示したか、静止して回転しているか、または電界に応答しなかった。細胞の応答は、2分30秒の期間にImageJでそれらの速度(μm / s)を追跡することによって定量化されました。仮想電極には黄色の楕円投影を用い、設定周波数30kHzで5V pp、10V pp、20V ppの印加電圧を調べた。仮想電極から50 μm以内にあり、AC電界がオンのセルに焦点を当てて、一貫性と外れ値を最小限に抑えました。20 V ppは、HEK 293セルの平均速度0.035 μm/sで最速のセル移動をもたらし、これに続いて10 V ppで0.032 μm/s、5 Vppで0.020 μm/sと、これらのセルは比較的均質なコントロールを表しています。図2Aのように、20 V ppで0.051 μm/s、10 V ppで0.036 μm/s、5 V ppで0.025 μm/sの平均速度を持つhMSCについても同様の傾向が観察されました(ここで、*はp<0.05を示します)。20 Vppでは、hMSCが同時に陽性および負のDEPを経験することが観察された。これは、10 V ppおよび5 V ppでは観察されなかった。 DEP力を経験した後のhMSCの生存率の所見は、より高い電圧が一般に細胞生存率の低下をもたらし、細胞の66%が5 V ppで生存可能、細胞の58%が10 Vppで生存可能、および細胞の57%が20 V ppで生存可能であることを示しました。 図2Bのように(ここで、**はp<0.01を示す)。 LiDEPは光学ベースのシステムであるため、光強度と電極の色は、LiDEPチップのパフォーマンスを制御するために簡単に調整できるパラメーターです。ここでは、投影される形状に基づいて生成された異なる電極色(白、黄、赤、および青)を評価して、セルのDEP応答への影響を決定しました。HEK 293細胞およびhMSCを20 Vppおよび30 kHzで評価した。白色、黄色、赤色、青色の電極が選択されましたが、LiDEPチップを介した照明は、赤橙色の感光体層の影響を受けました。したがって、投影された白い電極は黄色で内部が白く、赤い電極はオレンジ色に赤い輪郭で見え、青い電極は薄緑色に見えました(図3A-D)。これらの4色の出力は、白、黄、赤、青でそれぞれ0.7μW±77.7μW、1.3μW±92.7μW、0.2μW±21.9μW、0.9μW±56.7μWでした。これは、図3Eのように、黄色と白が最も強いDEPフィールドを持ち、青と赤が弱いことを強く示唆しています(ここで、***はHEK 293細胞<p0.001を示し、**はhMSCのp<0.01を示します)。DEP力の印加中の黄色および白色の仮想電極の縁部上のセルの静止回転も観察された。すべての電極の色の変化について、負と正のDEP応答が同時に発生し、電圧テストで20 Vppで示されたものと相関しました。さらに、セルの速度は電極の色によって変化しましたが、50 μm境界内のほぼすべてのセルがLiDEPに応答しました。hMSCのサイズは19.2 μm±5.8 μmと測定しました。 従来の電極を用いたDEPと比較したLiDEPの能力を評価するために、LiDEPを用いた細胞のDEP挙動と3DEP分析装置で解析した細胞のDEP挙動の違いを評価した。hMSCのDEP応答は、0.5%BSA(~100 μS/cm)を含む低導電率DEP緩衝溶液で測定されました。3DEPアナライザーを模倣するために、単一の楕円形の黄色の仮想電極を10 Vppで投影しました。hMSCのDEP動作は、30kHzから20MHzまで特徴付けられました。25kHz以下の周波数では、マイクロ流体デバイス内の金属層の表面に気泡が発生する電気分解が観察されました。LiDEPの場合、より低い周波数では、 図4Aのように、hMSCは正のDEP力を受け、仮想電極に引き付けられたセルの割合として表されます。細胞は強い正のDEP力で始まり、周波数が増加するにつれて弱まりました。セルは、30kHzから97kHzまで最も強い正のDEP力を経験しました。これらの周波数で交流電界を印加した後、一部の細胞は応答しなくなり、他の細胞は負のDEP挙動を示しました。この傾向は、3DEPアナライザを使用して定量化された観測応答から逸脱しています。 図4Bに示すように、セルは正のDEPで37kHzから255kHzに増加し、正のDEPで1,772kHzから20MHzに減少しました。 図1:hMSCについてここで説明したLiDEPプロトコルの実験セットアップ。 (A)感光体層と実験セットアップを備えたLiDEPチップの概略図と実画像。(B)3DEP分析装置における細胞の正負のDEP応答の代表画像(上段)とLiDEPを用いた細胞の正負のDEP応答の模式図(光投影を仮想電極として使用、下)。(C)仮想電極としてデバイスに投影できるさまざまな形状の例。BioRender.com で作成された図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:hMSCのDEP応答(速度)の特性評価と、与えられた条件下でのそれらの生存率。 (A)5 V pp、10 Vpp、および20 Vppに対するhMSCの正のDEP応答の測定速度。hMSCは、20 V ppで0.051 μm/s、10 Vppで0.036 μm/s、5 Vppで0.025 μm/sで移動しました。(B)仮想電極で発生する正のDEP力を経験した後のhMSCの生存率。生存率は、20 Vpp、10 V pp、および5 Vppでそれぞれ57%、58%、および66%でした。エラーバーは標準偏差(SD)を表します。t検定(*p < 0.05および**p < 0.01)を使用して、プールされたデータセットの統計分析が完了しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:均質(HEK 293)細胞株と異種(hMSC)細胞株間のDEP応答の比較。20 Vppおよび30 kHzでの(A)白色、(B)黄色、(C)赤色、および(D)青色の電極に対するhMSC細胞の正のDEP応答。(E)異なる色の電極に対するHEK 293セルとhMSCの速度応答。HEK 293セルは、黄色と赤の電極でそれぞれ0.035 μm/sと0.033 μm/sで最高の速度を示しました。HEK 293セルは、青色の電極で0.027 μm/sの最低速度を示しました。hMSCは、黄色の電極と白色の電極でそれぞれ0.068 μm/sと0.049 μm/sで最も高い速度を示しました。hMSCは、赤色電極で0.039 μm/sの最低速度を経験しました。エラーバーはSDを表します。 t検定(*p < 0.05、**p < 0.01、および***p < 0.001)を使用してプールされたデータセットで完了した統計分析。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:LiDEPと3DEPを使用したhMSCのDEP応答の比較。 (A)LiDEPおよび(B)3DEPアナライザーで10 Vppで測定したhMSCのDEP応答。LiDEPでは、hMSCの正のDEP応答が30kHzから20MHzに減衰しました。3DEPアナライザーから、セルは正のDEPで37kHzから255kHzに増加し、正のDEPで1,772kHzから20MHzに減少しました。 エラーバーはSDを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 補足図1:このプロトコルの実験に使用されたLiDEPセットアップの代表的な画像。 プロジェクターの統合を示すLiDEPシステムのズームイン写真。光は光源(プロジェクター)から10倍の対物レンズを通ってLiDEPチップのマイクロチャネルに移動します。10倍対物レンズはプロジェクターレンズの上にあります。各コンポーネントは写真で番号が付けられ、側面にリストされています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ビデオ1:白、黄、赤、青の仮想電極に応答するhMSCの代表的なビデオ。 セルは、正のDEP(仮想電極に向かって移動する)、負のDEP(仮想電極から離れる)、静止して回転している、または電界に応答しないとして視覚化されます。hMSCは37kHzと20Vppでテストされ、ビデオは20倍に高速化されました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。