マウスにおける連続局所キメラ抗原受容体(CAR)T細胞注入のための頭蓋内カニューレ移植

すべてのプロトコル手順は、AAALACによって認定されているフィラデルフィア小児病院の施設動物管理および使用委員会(IAC 19-000907)によって承認されました。この研究では、同所性異種移植片腫瘍を有する6〜12週齢のNOD scid γ(NSG)マウスを使用しました。しかしながら、このプロトコルは、任意のマウス系統に利用することができる。NSGマウスを無菌バリア条件で飼育し、手術は無菌のバイオセーフティキャビネットの下で行った。腫瘍細胞やT細胞などのヒト材料を使用する場合、手順と取り扱いはABSL-2バイオセーフティキャビネットで完了する必要があります。 1.手術のためのマウスの準備 適切な麻酔面に達するまで(約5分)、イソフルラン(2〜4%)を酸素流量1 L / minで誘導チャンバーでマウスを麻酔します。. 体重計を使用してマウスの体重を0.1 g近くまで増やし、皮下徐放性(SR)ブプレノルフィン(1 mg / kg)またはその他の鎮痛剤を投与します。.注:SRブプレノルフィンは72時間の鎮痛を提供します。 電気バリカンまたは脱毛剤を使用して、マウスの頭のてっぺんの毛皮を剃ります。 ヘラを使って定位アームの底をそっと開き、鉗子を使ってガイドカニューレを挿入します。カニューレの白いプラスチック部分の約1/2〜2/3が開口部の底から突き出るように、カニューレのネジを締めてカニューレを固定します。 マウスの上歯を脳定位固定装置のバイトバーに挿入して固定します。ノーズコーンを前方に引いて締め、マウスがイソフルランを吸入していることを確認します。 過度の圧力を避けて、イヤーカフまたはイヤーバーを使用して、温められた定位固定装置にマウスを取り付けます。注意: ウォームトレイには直腸体温計を挿入し、ウォーミングトレイは手順中にマウスの正常な体温を維持するように調整する必要があります。 綿の先端のアプリケーターを使用して、滅菌眼科用軟膏を両目に塗ります。 パッドまたはアプリケーター上のポビドンヨードで手術部位を拭き、続いてアルコールパッドを拭きます。この手順を合計 3 回実行します。 手順を開始する前に、鉗子でつま先をつまんで、適切な鎮静を評価します。 2.外科的処置 注:外科的処置のすべての側面は、滅菌器具と無菌技術を利用しています。マウスは、処置の期間中、約10〜20分間、イソフルラン(2〜4%)による麻酔下で継続する。 鉗子で耳の間の頭皮をそっと持ち上げます。滅菌ハサミを使用して、頭蓋骨と平行に持ち上げた頭皮を切り、皮膚の楕円形の皮弁(長さ0.75〜1 cm)を取り除き、頭蓋骨を露出させます。注意: はさみは、清潔で楕円形の開口部を提供し、周囲の皮膚や組織への不必要な損傷を防ぐために、メスよりも好まれます。 メスまたは綿先の綿棒と止血綿ペレットを使用して筋膜を押しのけ、必要に応じて過度の出血を遅らせます。注意: 滅菌綿の先端の木製側を使用すると、筋膜を押しのけて、過度の出血を防ぐこともできます。 ランドマークのブレグマとラムダ、頭蓋板が出会う頭蓋骨のそれぞれの前部と後部のマークを特定します13。注:露出した頭蓋骨の上部を過酸化水素で拭くことで識別を強化できます。 メスを使用して頭蓋骨をそっと刻み、アクリルを取り付ける表面を作成します。スコアリングには、互いに90°の角度で長さ約0.5〜1 cmの複数の直線を含める必要があります。 定位固定アームを使用して、カニューレを目的のランドマーク(ブレグマまたはラムダ)にローカライズします。局在化したら、カニューレの先端を頭蓋骨の表面から1〜2 mm上に上げ、目的の座標に移動します。腫瘍内注射の場合、これは腫瘍配置と同じA / PおよびM / L座標を使用します。 カニューレが入る領域から離れた露出した頭蓋骨に、18 Gの針または外科用ドリルで2つのネジ穴を開けます。カニューレのための十分なスペースを含むように穴が間隔を空けていることを確認してください。ドリルビットを使用して、頭蓋骨に引っかかるまでネジ穴をひねります。マイナスドライバーを使用して、2本のネジを穴に挿入して固定します。次に、ネジをそっと引き上げて、ネジが固定されていることを確認します。注意: 頭蓋骨と同じ高さになるまでネジを挿入しないでください、またはネジは下のマウスの脳を損傷する可能性があります。ネジと頭蓋骨の間に少なくとも1〜2 mmの隙間を残します。 18 Gの針または外科用ドリルを使用して、識別された座標で頭蓋骨にドリルで穴を開け、カニューレを挿入するための穴を作成します。 定位アームを使用して、カニューレを目的のD / V座標まで下げます。注:カニューレ移植のD/V座標は、ダミーおよび治療用カニューレの投影長を考慮する必要があり、腫瘍細胞の同所性注射よりも表面的である可能性があります(図1)。 磁器の12穴プレートに、1ウェルにアクリル樹脂粉末(約0.3g)とアクリル樹脂液10〜15滴(約0.5〜0.75mL)を充填する。これにより、粘性のある白色の材料が生成されます。混合物を1 mLシリンジに吸い込み、それを使用して頭蓋骨をコーティングして覆い、カニューレとネジの周りのスペースを埋めます。注意: 粘性材料は時間の経過とともにセメントに硬化するため、このステップは混合後すぐに完了する必要があります。 セメントがまだ柔軟である間に、定位アームのネジを緩め、下部の開口部にヘラを使用してカニューレをホルダーからそっと解放し、定位アームをマウスからゆっくりと上に引っ込めます。 セメントが完全に乾いたら、ダミーのカニューレをガイドカニューレに挿入し、時計回りに回してしっかりと固定します。 手順が完了したら、マウスを温めたホームケージに戻し、注意深く監視し、適切な回復を確認し、マウスが完全に意識を取り戻したことなど、手順後の観察を記録してからコロニーに戻ります。注意: 過熱を避けるために、動物が涼しい側に移動できるように、ケージの半分だけを加熱パッドに置くことをお勧めします。 マウスが術後の痛みを示す行動を示す場合は、メロキシカム5 mg / kgを1日1回最大3日間皮下投与するなど、必要に応じて追加の鎮痛薬を投与します。. 3. CAR T細胞の調製 セルカウンターを使用して、事前にトランスフェクトされたCAR T細胞濃度を測定します。 プリトランスフェクトしたT細胞を200 x g で室温(RT)で5分間遠心分離します。 真空吸引システム上で滅菌パスツールピペットを使用して上清を吸引し、ペレットをホスファエ緩衝生理食塩水(PBS)に所望の濃度に再懸濁します。典型的な送達量は2〜5μLであり、典型的な細胞用量は0.5〜5 x 106 細胞である。 4.CAR T細胞注入 PKGチューブの小片を通して上部を供給して、治療カニューレを準備します。 治療用シリンジにCAR T細胞懸濁液を満たし、治療用カニューレの上部を覆うのに十分なPKGチューブのもう一方の端に挿入します。 マウスをイソフルラン(2〜4%)で1 L / minの酸素流量で麻酔します。 ベースの鉗子を使用してガイドカニューレを安定させ、ダミーカニューレを慎重に緩めて取り外し、ガイドカニューレにアクセスできるようにします。注:定位固定装置のセットアップは必要ありませんが、治療のために頭を安定させるために使用できます。 CAR T細胞を1分間注入し、注入の停止後さらに1分間治療カニューレを所定の位置に保持します。. 治療用カニューレを取り外し、ダミーカニューレをしっかりとねじ込みます。 オプションの疼痛管理のために皮下メロキシカム(5 mg / kg)を投与します。.