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Bioengineering

Evaluación de la terapia de modulación de la contractilidad cardíaca en cardiomiocitos derivados de células madre humanas 2D

Published: December 16, 2022
doi:
10.3791/64848
, , ,
1Office of Science and Engineering Laboratories, Center for Devices and Radiological Health,U.S. Food and Drug Administration

Summary

Aquí, demostramos un método no invasivo de evaluación de contractilidad de dispositivos médicos cardíacos utilizando monocapas 2D de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC-CM), chapadas en un sustrato flexible, junto con microscopía basada en video. Esta herramienta será útil para la evaluación in vitro de las propiedades contráctiles de los dispositivos de electrofisiología cardíaca.

Abstract

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) se están explorando actualmente para múltiples aplicaciones in vitro y se han utilizado en presentaciones regulatorias. Aquí, ampliamos su uso a la seguridad de los dispositivos médicos cardíacos o a las evaluaciones de rendimiento. Desarrollamos un método novedoso para evaluar las propiedades contráctiles de dispositivos médicos cardíacos en monocapas de hiPSC-CM 2D de contracción robusta chapadas en un sustrato de hidrogel basado en matriz extracelular flexible (ECM). Esta herramienta permite la cuantificación de los efectos de las señales del dispositivo de electrofisiología cardíaca en la función cardíaca humana (por ejemplo, propiedades contráctiles) con equipos de laboratorio estándar. Las monocapas 2D hiPSC-CM se cultivaron durante 2-4 días sobre un sustrato de hidrogel flexible en un formato de 48 pocillos.

Los hiPSC-CM se expusieron a señales eléctricas estándar de dispositivos médicos de modulación de contractilidad cardíaca (MCC) y se compararon con los hiPSC-CM de control (es decir, solo estimulación). Las propiedades contráctiles basales de los hiPSC-CM 2D se cuantificaron mediante un análisis de detección basado en video basado en el desplazamiento de píxeles. Los hiPSC-CM 2D estimulados por CCM chapados en el sustrato de hidrogel flexible mostraron propiedades contráctiles significativamente mejoradas en relación con la línea de base (es decir, antes de la estimulación de CCM), incluida una mayor amplitud de contracción máxima y una cinética acelerada de contracción y relajación. Además, la utilización del sustrato de hidrogel flexible permite la multiplexación de las lecturas de acoplamiento de contracción de excitación cardíaca basadas en video (es decir, electrofisiología, manejo de calcio y contracción) en hiPSC-CM sanos y enfermos. La detección y cuantificación precisas de los efectos de las señales electrofisiológicas cardíacas en la contracción cardíaca humana es vital para el desarrollo, la optimización y la eliminación de riesgos de dispositivos médicos cardíacos. Este método permite la visualización y cuantificación robustas de las propiedades contráctiles del sincitio cardíaco, que debería ser valioso para las pruebas de seguridad o efectividad de dispositivos médicos cardíacos no clínicos. Este artículo describe, en detalle, la metodología para generar monocapas de sustrato de hidrogel hiPSC-CM 2D.

Introduction

A medida que la población de los Estados Unidos envejece, el número de pacientes con insuficiencia cardíaca continúa aumentando, junto con los costos médicos directos 1,2. Existe una necesidad crítica de desarrollar nuevas terapias para tratar la insuficiencia cardíaca y metodologías no clínicas innovadoras para probar tales terapias. Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC-CM) se han propuesto como una herramienta in vitro para ayudar al proceso de desarrollo terapéutico y se han utilizado en presentaciones regulatorias 3,4. Sin embargo, su uso generalizado ha sido limitado para estudios de contractilidad debido a la falta de propiedades contráctiles robustas cuando se chapan en condiciones de cultivo 2D rígidas estándar (es decir, plástico o vidrio de cultivo de tejidos convencional)5,6,7,8. Anteriormente demostramos la utilidad de chapar hiPSC-CM individuales aislados en un sustrato de hidrogel flexible para generar propiedades contráctiles visibles robustas9. Demostramos que los hiPSC-CM aislados tienen propiedades contráctiles comparables a las de los cardiomiocitos ventriculares de conejos adultos recién aislados. Además, demostramos la utilidad de este método para evaluar las respuestas contráctiles a los agentes farmacológicos7. Además, otros estudios han aplicado esta tecnología a evaluaciones mecanicistas para ciencia básica y modelado de enfermedades10,11,12. Aquí, esta metodología se ha extendido a monocapas 2D hiPSC-CM, y se demuestra su utilidad en la evaluación in vitro de señales eléctricas de dispositivos médicos de modulación de contractilidad cardíaca (CCM) fisiológicamente relevantes.

La MCC es una terapia de insuficiencia cardíaca intracardíaca en la que se suministran señales electrofisiológicas no excitatorias al miocardio durante el período refractario absoluto del ciclo cardíaco13,14. Faltan métodos reproducibles para evaluar la MCC en modelos de células cardíacas humanas. Trabajos previos han empleado varios modelos de células cardíacas para evaluar la respuesta contráctil de la MCC. Demostramos in vitro que los cardiomiocitos ventriculares de conejo recién aislados responden a la estimulación de la MCC mediante un aumento transitorio del calcio y la amplitud de contracción15. Otro estudio en cardiomiocitos ventriculares caninos aislados demostró una mejora inducida por MCC de la amplitud transitoria de calcio intracelular16. Sin embargo, la mayoría de los estudios de MCP han utilizado preparaciones animales ex vivo e in vivo. Estos estudios son difíciles de correlacionar entre sí porque aplican una variedad de parámetros de pulso CCM y especies17. Un estudio en un modelo papilar de conejo aislado reveló un aumento de la contractilidad inducida por MCC 8,18, y una serie de estudios de corazón completo han demostrado una mejora inducida por MCC de la función contráctil19,20,21. Estos estudios han proporcionado una importante visión mecanicista. Sin embargo, hay una falta de modelos humanos reproducibles para estudios contráctiles de EP cardíaca in vitro, incluida la MCC. Con ese fin, hemos desarrollado varios modelos hiPSC 2D y 3D y hemos demostrado la mejora inducida por CCM de las propiedades contráctiles de una manera dependiente de los parámetros. Además, se ha encontrado que los efectos inotrópicos inducidos por CCM están mediados en parte por la entrada neuronal y la señalización β-adrenérgica 8,17,22. Aún así, se necesita saber más sobre los mecanismos de la terapia CCM, y la utilización de cardiomiocitos humanos contraídos puede ayudar a lograr este resultado. Como tal, existe una necesidad significativa de desarrollar herramientas no clínicas humanas para evaluar nuevos dispositivos y señales de MCP, acelerar el proceso regulatorio, reducir la carga sobre los modelos animales y ayudar a los desarrolladores de dispositivos a tomar decisiones 8,17,23,24. Es importante desarrollar protocolos fáciles de bricolaje que puedan transferirse a cualquier laboratorio y que utilicen equipos estándar y bajos requisitos de celdas para reducir los costos. Este método aclara los efectos de la estimulación de la MCC sobre la función de los cardiomiocitos humanos y proporciona información importante sobre la seguridad o efectividad de la MCC17. Aquí, describimos el método para generar monocapas 2D hiPSC-CM en un sustrato de hidrogel flexible para producir una herramienta no clínica estandarizada para cuantificar las respuestas contráctiles de dispositivos médicos de electrofisiología cardíaca aguda (es decir, CCM) en salud y enfermedad.

Protocol

1. Preparación de las placas y medios NOTA: Una alícuota de hidrogel típica basada en matriz extracelular (ECM) es ~200 μL en un tubo estéril de 1,5 ml almacenado a -20 °C. En una campana de cultivo de tejidos estériles, prepare una placa estéril de 6 pocillos transfiriendo 2 ml de gelatina al 0,1% (Tabla de materiales) a cada pocillo. Coloque la tapa en la placa de 6 pocillos y deje que la placa recubierta se incube a 37 °C durante un mínimo de 1 h. Un día antes de sembrar los hiPSC-CM en el sustrato de hidrogel flexible, descongele una alícuota de hidrogel (Tabla de materiales) en el refrigerador sobre hielo. Prepare el medio cardiomiocitario (Tabla de materiales) mezclando 500 ml de RPMI 1640, 10 ml de suplemento 50x B-27 y 5 ml de penicilina-estreptomicina9. 2. Siembra de hiPSC-CMs criopreservados Dos días antes de sembrar los hiPSC-CM en el sustrato de hidrogel flexible, pre-plaque los hiPSC-CM en placas estériles de 6 pocillos recubiertas de gelatina al 0,1%. Descongele los hiPSC-CM utilizando un protocolo de descongelación estándar 9,25. Luego, coloque 1.500.000 hiPSC-CM (Tabla de materiales) totales por pocillo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 1A)26. Cultivar las hiPSC-CM en medio cardiomiocitos estándar durante 2-4 días para permitir que las hiPSC-CM se recuperen de la criopreservación a 37 °C y 5% deCO2. Refrescar el medio gastado con medio cardiomiocitos 100% cada 48 h. 3. Disociación y recuento de los hiPSC-CM prechapados Compruebe el estado de los hiPSC-CM antes de la disociación. Evaluar el estado de los hiPSC-CMs, asegurando la viabilidad y el batido estable.NOTA: La pureza de la población de hiPSC-CM es importante (p. ej., >90% de troponina T cardíaca)7. Se recomienda un método de selección de cardiomiocitos (p. ej., selección metabólica o clasificación) para reducir la interrupción del sustrato de hidrogel por células no cardiomiocitos25,26. Lave las hiPSC-CMs 2x con 4 mL por pocillo de D-PBS sin CaCl 2 o MgCl2 (Tabla de materiales). Aspirar el D-PBS, añadir 1 ml de reactivo de disociación a temperatura ambiente a cada pocillo y, a continuación, incubar durante 15 min a 37 °C. Agregue 10 ml de medio cardiomiocitario a un tubo cónico estéril de 15 ml. Disociar las hiPSC-CM de la placa de 6 pocillos con una pipeta de 1.000 μL (Figura 1B). Añadir la suspensión celular al tubo cónico de 15 ml26. Enjuague el pocillo con 1 ml de medio cardiomiocitos fresco para recoger cualquier hiPSC-CM residual y agréguelos al tubo cónico de 15 ml. Lleve el volumen final del tubo cónico a 15 ml. Centrifugar durante 5 min (200 × g). Retire el sobrenadante hasta la marca de 1 ml. Resuspender las células en medio cardiomiocitos hasta un volumen final de 5 mL. Cuente los hiPSC-CM con un contador de celdas manual o automatizado. Incubar la suspensión hiPSC-CM a temperatura ambiente mientras se preparan los sustratos de hidrogel flexible (30 min como máximo). 4. Preparación de los sustratos flexibles de hidrogel Prepare un juego de pipetas de 20 μL a 1 μL, puntas de pipeta de 20 μL (por ejemplo, 20 μL) y una placa inferior de vidrio estéril de 48 pocillos. Asegúrese de que un cronómetro / temporizador esté listo antes de hacer los sustratos de hidrogel. En la campana de cultivo de tejido estéril, mezcle el sustrato de hidrogel a base de ECM golpeando suavemente el tubo e inmediatamente colóquelo de nuevo en hielo. Luego, encienda el cronómetro / temporizador inmediatamente antes de que se coloque el primer sustrato de hidrogel, este es el tiempo cero. Pipetear 1 μL del sustrato de hidrogel hacia arriba y hacia abajo ~3x para enfriar la punta de la pipeta. Aplique ~1 μL del sustrato de hidrogel sin diluir horizontalmente al fondo de cada pocillo de la placa de 48 pocillos (Figura 1C, Figura 2A y Figura 3A), sosteniendo la pipeta en un ángulo de 45°. Placa todos los sustratos de hidrogel en la misma orientación en cada pocillo (Figura 2 y Figura 3) para ayudar a identificar el sustrato al realizar los experimentos a un aumento de 40x 7,9,17,27.NOTA: Cada línea de ~1 μL es un sustrato de hidrogel (Figura 3). Por lo general, se tarda ~ 5 minutos en preparar 48 pozos. El uso de un soporte de microplaca inclinado horizontalmente (por ejemplo, 30°) puede permitir una mejor visión del fondo del pozo y del sustrato de hidrogel. Asegúrese de recorrer toda la longitud del pozo (es decir, de izquierda a derecha). Los sustratos cortos de hidrogel pueden ser demasiado gruesos, lo que reduce la estabilidad del sustrato. No permita que el sustrato de hidrogel se seque en la punta de la pipeta. Si esto ocurre, cambie rápidamente a una nueva punta y continúe inmediatamente. Alternativamente, se pueden utilizar puntas de pipeta refrigeradas. El sustrato de hidrogel a base de ECM puede polimerizarse rápidamente cuando no está en hielo. Se sugiere la preparación de varios pozos a la vez (por ejemplo, 10). Además, se recomienda practicar en un plato simulado de 48 pocillos. Coloque la tapa en la placa de 48 pocillos y deje que los sustratos de hidrogel se incuben durante 8-10 minutos a temperatura ambiente en la campana de cultivo de tejido estéril antes de agregar las células (Figura 2B).NOTA: Es importante cumplir con los tiempos de incubación sugeridos. Un tiempo de incubación de más de 10 min dará lugar a sustratos de hidrogel rígidos y sin contracciones visibles. Un tiempo de incubación de menos de 8 min puede provocar el colapso de sustratos. Inmediatamente sembrar los hiPSC-CMs gota a gota directamente sobre los sustratos de hidrogel, con ~30.000 hiPSC-CMs viables por pocillo en un volumen medio bajo de ~200 μL de medio cardiomiocitos, utilizando una pipeta de 1.000 μL (Figura 2B y Figura 3B).NOTA: Este proceso detiene la polimerización del sustrato de hidrogel y asegura que los hiPSC-CM estén en el sustrato 7,9,17,27. Coloque la tapa en la placa y deje que los hiPSC-CM se incuben sin ser molestados durante 10-15 minutos a temperatura ambiente (Figura 2C) en la campana de cultivo de tejido estéril para permitir que los hiPSC-CM se adhieran al sustrato de hidrogel. Agregue suavemente ~100 μL de medio cardiomiocitario fresco a cada pocillo (volumen final: ~300 μL por pocillo). Coloque la tapa en la placa y transfiérala a una incubadora a 37 °C, 5% deCO2 durante 2-4 días. Refresque el medio 100% cada 24 h antes de realizar los experimentos de contracción.NOTA: Inspeccione visualmente los hiPSC-CM para la morfología correcta; inmediatamente después del chapado, los hiPSC-CM deben aparecer redondos (Figura 3B). Para el día 2 después de la siembra, se observará un sincitio monocapa 2D 2D hiPSC-CM confluente (Figura 3C) (Video Suplementario S1) con una contracción visible robusta (Video Suplementario S2). 5. Registro y análisis de contracciones Preparar el medio de ensayo CCM, que es la solución de Tyrode que contiene lo siguiente (en mmol/L): CaCl 2 0,5, NaCl 134, KCl 5,4, MgCl2 1, glucosa 10 y HEPES 10, con el pH ajustado a 7,4 con NaOH, y equilibrar a 37 °C en un baño maría.NOTA: El calcio extracelular submáximo (0,5 mM) se utiliza para mejorar la ventana de ensayo CCM. Encienda el microscopio y la cámara de control ambiental para equilibrar a 37 °C y 5% deCO2. Retire el medio cardiomiocitario de la placa de 48 pocillos y enjuague suavemente cada pocillo dos veces con 600 μL de medio de ensayo CCM. Agregue 300 μL de medio de ensayo CCM por pocillo y coloque la placa de 48 pocillos en el microscopio en la cámara de control ambiental. Inserte los electrodos y equilibre las celdas durante 5 minutos. Use microscopía basada en video para grabar los videos de contracción. Abra el software de grabación de vídeo y establezca una velocidad de fotogramas de 100 fotogramas/s. Seleccione una región de interés (ROI) cerca del centro de la monocapa hiPSC-CM.NOTA: No seleccione un ROI cerca del borde de las monocapas hiPSC-CM, ya que puede ser inestable para grabaciones contráctiles. Luego, estimule el campo de las células con un generador de pulsos comercial (Tabla de materiales) para marcar el ritmo eléctrico de las monocapas 2D hiPSC-CM. Mantenga el ritmo de los hiPSC-CM en un umbral de 1,5x a 1 Hz con parámetros de pulso de referencia (por ejemplo, pulsos de estimulación de onda cuadrada monofásica con una duración de pulso de estímulo de 2 ms de ~ 14 V / cm)17. Grabe el video de contracción de la línea de base, solo con ritmo (es decir, antes del CCM) (Figura 1D) durante un mínimo de cinco latidos17,28. Luego, estimule la monocapa hiPSC-CM con una señal eléctrica experimental (Figura 1D). Para seguir este protocolo, utilice los parámetros estándar de estimulación CCM: dos pulsos bifásicos simétricos de 5,14 ms de duración de fase (20,56 ms de duración total), ~28 V/cm (amplitud de fase), intervalo de interfase cero y un retardo de 30 ms (es decir, tiempo desde el final del pulso de estimulación hasta el comienzo del pulso CCM) (Figura 1D)29,30 , y graba el video de contracción inducida por CCM durante un mínimo de cinco tiempos. Apague la señal CCM, estimule con un pulso de ritmo basal y grabe un video de contracción del período de recuperación (es decir, después del CCM) durante un mínimo de cinco latidos. Utilice un software de contracción estándar para analizar automáticamente los videos de contracción y cuantificar las propiedades contráctiles clave (por ejemplo, la amplitud de la contracción, la pendiente de la contracción, la pendiente de relajación, el tiempo hasta el pico, el tiempo hasta la línea de base del 90% y la duración de la contracción del 50%)7,17,31,32. Utilice los hiPSC-CM 2D en el sustrato de hidrogel flexible para experimentos contráctiles de los días 2 a 14 después del recubrimiento en el sustrato.

Representative Results

En este protocolo se describe una herramienta simple y robusta para generar monocapas 2D hiPSC-CM visiblemente contraídas en un sustrato de hidrogel flexible. La medición de las propiedades contráctiles se logra con grabación basada en video junto con software de análisis de contractilidad. Esto permite la cuantificación de parámetros clave de la contractilidad de los cardiomiocitos, incluida la amplitud de la contracción, la pendiente de la contracción, la pendiente de relajación, el tiempo hasta el pico, el tiempo hasta el 90% de referencia y la duración de la contracción del 50%. El modelo se utiliza para caracterizar las propiedades contráctiles basales de hiPSC-CM (Figura 4) de varios donantes “sanos” y se puede extender a la evaluación de señales de dispositivos médicos de electrofisiología cardíaca (es decir, CCM). La aplicación de los parámetros estándar de estimulación de MCC (Figura 1D)29,30 resultó en propiedades contráctiles mejoradas in vitro (Figura 5 y Tabla 1)17. Además, demostramos que este método puede ser utilizado para evaluar los efectos de la modulación de las concentraciones extracelulares de calcio sobre las propiedades contráctiles humanas con y sin estimulación CCM (Figura 6)17. Se observó la dependencia basales esperada de la contraccióndel calcio 7,17, así como un aumento inducido por CCM en la sensibilidad al calcio a nivel de la monocapa de cardiomiocitos. Además, el interrogatorio farmacológico de la vía de señalización β-adrenérgica (Figura 7) reveló que los efectos inotrópicos inducidos por CCM estaban en parte mediados por la señalización β-adrenérgica17. Además, esta herramienta puede ampliarse a los cardiomiocitos de la enfermedad específica del paciente, incluidos los de la miocardiopatía dilatada (MCD)33,34,35 (Figura 8), para comprender el efecto de la MCC en el contexto de los estados de enfermedad; de hecho, se observó una mayor amplitud contráctil y una cinética acelerada de contracción y relajación a la “dosis” de MCC probada aquí (Figura 8). Si bien tenemos un dispositivo que imita a CCM en nuestro laboratorio, la metodología utilizada aquí no es específica de ese sistema y podría aplicarse a otros dispositivos de electrofisiología cardíaca. Figura 1: Resumen esquemático del modelo 2D de MCC in vitro hiPSC-CM. (A) Los hiPSC-CM se pre-chapan en formato monocapa en placas de 6 pocillos recubiertas de gelatina (0,1%). (B) Después de 2 días en cultivo, los hiPSC-CM se disocian y se preparan para el recubrimiento en un sustrato de hidrogel flexible. (C) Los hiPSC-CM aislados se chapan a una alta densidad sobre sustratos de hidrogel dispuestos en un formato de 48 pocillos (izquierda) y se ensayan en (0,5 mM) de calcio extracelular de Tyrode (derecha). (D) Un generador de pulsos comercial y parámetros de pulso clínicos estándarCCM 29,30 (derecha) se utilizan para estimular los hiPSC-CM; La función cardíaca se evalúa mediante análisis basado en video (izquierda). (E) Registros representativos de contracción antes de la MCP (basal: 5 V), durante la MCP (MCC: 10 V) y después de la MCP (recuperación: 5 V). Esta figura ha sido reimpresa de Feaster et al.17. Abreviaturas: hiPSC-CM = cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos; MCC = modulación de la contractilidad cardíaca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Esquema del recubrimiento y siembra del sustrato de hidrogel flexible. (A) Se aplica un sustrato de hidrogel a base de ECM completamente descongelado y sin diluir a una placa estéril de 48 pocillos (panel izquierdo), con 1 μL de sustrato de hidrogel por pocillo (panel derecho). (B) El sustrato de hidrogel se deja incubar a temperatura ambiente durante 8-10 min (panel derecho), seguido de un recubrimiento de los hiPSC-CM de alta densidad en un volumen medio bajo (~ 200 μL) (panel izquierdo). (C) Después de 10-15 minutos de incubación, se agrega medio a cada pocillo (panel izquierdo) y las placas se mueven a una incubadora de cultivo de tejidos estándar (panel derecho). Abreviaturas: ECM = matriz extracelular, hiPSC-CM = cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos; RT = temperatura ambiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Sustrato de hidrogel basado en matriz extracelular. (A) Sustrato de hidrogel representativo (sin células) en un pocillo de una placa inferior de vidrio de 48 pocillos inmediatamente después de aplicar el sustrato al pozo. (B) Tiempo 0 después de que se siembran los hiPSC-CM. (C) Tiempo 24 h después de que se siembran los hiPSC-CM. Este panel fue reimpreso de Feaster et al.17. Las flechas blancas indican el borde del sustrato de hidrogel, aumento 4x. Barra de escala = 1 mm. Abreviatura: hiPSC-CM = cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Caracterización de las propiedades contráctiles monocapa 2D hiPSC-CM. (A) Grabación representativa de la contracción de los hiPSC-CM 2D con ritmo de 1 Hz (5 V). (B) Trazas de contracción representativas que representan un ciclo de contracción. (C) Gráficos de barras de resumen. Los datos son medias ± SEM. n = 18. Abreviatura: hiPSC-CM = cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Efecto agudo de la MCC en las propiedades contráctiles 2D hiPSC-CM. (A) Registro representativo de contracciones para antes de la MCC (5 V), durante la MCC (10 V) y después de la MCC (5 V). (B) Trazas de contracción representativas de los efectos inmediatos (es decir, último latido antes del MCC, primer latido de MCC y primer latido después del MCC, indicado por +). (C) Gráficos de barras resumidos de los efectos inmediatos. Cambio porcentual, los datos son medias ± SEM. n = 23. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Esta figura ha sido reimpresa de Feaster et al.17. Abreviaturas: hiPSC-CM = cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos; MCC = modulación de la contractilidad cardíaca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Efecto de la modulación extracelular del calcio en la respuesta de la MCC. (A) Trazas representativas de contracción de los efectos inmediatos para cada grupo antes de la MCC (5 V), durante la MCC (10 V) y después de la MCP (5 V); los hiPSC-CMs fueron expuestos a concentraciones crecientes de calcio extracelular (Ca-o) de 0,25-2 mM. (B-D) Datos transformados (sigmoidales) para guiar al ojo que demuestran el efecto de CCM sobre la sensibilidad al calcio de las propiedades contráctiles (es decir, la amplitud y la cinética) (pendiente de la colina = 1.0). n = 6-8 por grupo. Esta figura ha sido reimpresa de Feaster et al.17. Abreviaturas: hiPSC-CM = cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos; MCC = modulación de la contractilidad cardíaca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Desafío farmacológico. Trazas de contracción representativas para cada grupo antes de la MCC (5 V), durante la MCC (10 V) y después de la MCC (5V); los hiPSC-CM fueron pretratados con (A) vehículo o (B) metoprolol (2 μM). (C,D) Gráficos de barras de resumen para cada condición. Cambio porcentual, los datos son medios ± SEM. n = 10 por grupo. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Esta figura ha sido reimpresa de Feaster et al.17. Abreviaturas: hiPSC-CM = cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos; MCC = modulación de la contractilidad cardíaca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8: Efecto agudo de la MCC sobre las propiedades contráctiles de las hiPSC-CM 2D enfermas. (A) Traza de contracción representativa para DCM L35P, control basal (antes, 6 V) y DCM L35P más CCM (10 V). (B) Gráficos de barras de resumen. Cambio porcentual, los datos son la media ± SEM. n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01. Abreviaturas: hiPSC-CM = cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos; MCC = modulación de la contractilidad cardíaca; MCD = miocardiopatía dilatada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Video suplementario S1: Timelapse of the hiPSC-CMs on the extracellular matrix-based hydrogel. HiPSC-CMs bidimensionales chapados en el sustrato de hidrogel flexible; Tiempo: 0-90 h; un pozo de una placa inferior de vidrio de 48 pocillos; Aumento 4x. Los hiPSC-CM forman un sincitio monocapa horizontal (es decir, de izquierda a derecha). Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para descargar este video. Video suplementario S2: hiPSC-CMs en el hidrogel basado en matriz extracelular. HiPSC-CMs bidimensionales chapados en el sustrato de hidrogel flexible; Tiempo: ~24 h; un pozo de una placa inferior de vidrio de 48 pocillos; Aumento 4x. Los hiPSC-CM forman morfología monocapa y muestran una contracción robusta a ~24 h después del recubrimiento. Barra de escala = 1 mm. Este video es de Feaster et al.17. Haga clic aquí para descargar este video. Parámetro CCM Después Amplitud 16 ± 4%** 4 ± 5% Tiempo para alcanzar el pico 50% -20 ± 9%* 7 ± 5% Tiempo para alcanzar el pico 90% -22 ± 8%* 6 ± 5% Tiempo hasta la línea de base 50% -8 ± 5% 4 ± 4% Tiempo hasta la línea de base 90% -12 ± 6%* 5 ± 5% Duración de la contracción 10% -13 ± 6% 3 ± 5% Duración de la contracción 50% -6 ± 5 % 3 ± 5% Duración de la contracción 90% 0 ± 5% 3 ± 4% N 23 23 Tabla 1: Propiedades contráctiles. Cambio porcentual en relación con antes de la MCP (5 V); los datos son medios ± SEM para todos los latidos en cada grupo durante CCM (10 V) y después de CCM (5 V). n = 23. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Esta tabla ha sido reimpresa de Feaster et al.17.

Discussion

El protocolo descrito en este documento describe un método para generar monocapas 2D hiPSC-CM de contracción robusta sobre un sustrato de hidrogel basado en matriz extracelular flexible (ECM) con reactivos comerciales 7,17. Los hiPSC-CMs sembrados en el sustrato de hidrogel flexible permanecen viables y tienen propiedades contráctiles mejoradas7. Esta técnica se basa en equipos y capacidades de laboratorio estándar7. Hay varios pasos críticos en el protocolo, incluso en relación con el trabajo con el sustrato de hidrogel basado en ECM, que requieren una cuidadosa atención al detalle. Un problema potencial es la presencia de suero en el medio. Esto puede dar lugar a que las hiPSC-CM formen redes (por ejemplo, redes endoteliales/vasculares) en lugar de una lámina monocapa confluente; por lo tanto, se recomienda un medio libre de suero durante el establecimiento de las monocapas flexibles de hidrogel hiPSC-CM (es decir, día 0 a día 4). Del mismo modo, preparar demasiados sustratos de hidrogel a la vez puede resultar en sustratos pobres o desiguales debido a la fatiga del operador. Si bien es importante trabajar rápidamente, la integridad de cada sustrato de hidrogel es crítica. Del mismo modo, se deben sembrar cuidadosamente los hiPSC-CM y cambiar el medio; Esto no debe hacerse con fuerza. Al cambiar el medio, debe agregarse suavemente desde el borde superior del pozo para no interrumpir el sustrato de hidrogel o las células. Al igual que con los cultivos 2D hiPSC-CM estándar (es decir, plástico o vidrio de cultivo de tejidos convencionales), el recubrimiento a baja densidad dará como resultado una formación incompleta de monocapas. Es importante inspeccionar visualmente los hiPSC-CM para confirmar que están en el sustrato de hidrogel y utilizar un temporizador para garantizar una sincronización precisa. Además, el cultivo de las monocapas 2D hiPSC-CM durante más de 14 días en el sustrato de hidrogel puede provocar la interrupción de la monocapa, según las propiedades de ECM y las instrucciones del fabricante del sustrato.

Hay varias limitaciones al método actual que deben considerarse. Primero, las células utilizadas en este protocolo eran de un proveedor comercial de hiPSC-CMs, y esas células forman un sincitio de células acopladas eléctricamente. El sincitio contiene una mezcla de hiPSC-CMs de los tres subtipos cardíacos (es decir, ventricular, auricular y ganglionar)17. Los estudios pueden beneficiarse de una población de CM-hiPSC exclusiva del subtipo (es decir, 100% ventricular o 100% auricular). En segundo lugar, este método sólo utilizó hiPSC-CMs, mientras que los no miocitos, incluyendo fibroblastos cardíacos, células endoteliales y neuronas, pueden mejorar la funcionalidad hiPSC-CM22,36. En tercer lugar, los hiPSC-CM 2D muestran varias características de los cardiomiocitos relativamente inmaduros, incluyendo latidos espontáneos, morfología amorfa y falta de respuesta inotrópica 8,37. En cuarto lugar, si bien este protocolo produce monocapas 2D hiPSC-CM de contracción robusta, es probable que los modelos 3D hiPSC-CM funcionalmente mejorados, como los tejidos cardíacos diseñados (TEC), den como resultado una respuesta contráctil inducida por CCM mejorada bajo concentraciones fisiológicasde calcio 8,38. Finalmente, el protocolo descrito aquí está diseñado para un formato de 48 pocillos. Sin embargo, con la optimización y la inclusión de la automatización, esto se puede escalar a un formato de alto rendimiento (por ejemplo, placas de 96 pocillos o 384 pocillos).

El estándar de oro actual para los estudios de hiPSC-CM son las condiciones de cultivo 2D rígidas convencionales (es decir, plástico o vidrio de cultivo de tejidos). Si bien es útil para los estudios de electrofisiología3 y manejo de calcio39, la metodología convencional da como resultado propiedades contráctiles mínimas 5,6,7. Como resultado, las condiciones de cultivo 2D rígidas convencionales no son susceptibles de la evaluación de los efectos contráctiles de la MCP8. Los métodos 3D hiPSC-CM ECT38 mejorados son técnicamente desafiantes, requieren mucho tiempo y requieren equipos sofisticados que no están disponibles en todos los laboratorios. En este protocolo, describimos una metodología simple para generar monocapas 2D hiPSC-CM de contracción robusta en un marco de tiempo más corto que los métodos 3D ECT o los métodos 2D convencionales a largo plazo 7,40,41. Además, los reactivos utilizados aquí están disponibles comercialmente, incluido el sustrato de hidrogel y los hiPSC-CM, y ambos tienen una consistencia considerable de lote a lote. Si bien utilizamos electrodos de alambre de platino extraíbles (distancia entre electrodos: 2.0 mm, ancho: 1.0 mm), varios materiales y configuraciones de electrodos son susceptibles de evaluaciones contráctiles CCM in vitro 8,15,17,18,22. Asimismo, existen múltiples softwares automatizados disponibles que permiten el análisis de videos de contracción 7,31,32.

La mayoría de los métodos no clínicos para evaluar la contractilidad de los dispositivos médicos cardíacos se basan en gran medida en costosos modelos animales in vivo (por ejemplo, perros o cerdos) y tiras musculares papilares técnicamente desafiantes (por ejemplo, conejos)18. Este artículo describió un modelo in vitro humano para evaluar los efectos de las señales de dispositivos médicos de electrofisiología cardíaca sobre la contractilidad. Esta herramienta podría reducir la dependencia de los estudios en animales y ser útil para la evaluación in vitro de las propiedades contráctiles de los dispositivos de electrofisiología cardíaca.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado en parte por un nombramiento para el Programa de Participación en la Investigación en el Centro de Dispositivos y Salud Radiológica administrado por el Instituto Oak Ridge para la Ciencia y la Educación a través de un acuerdo interinstitucional entre el Departamento de Energía de los Estados Unidos y la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos. Los autores agradecen a Richard Gray, Trent Robertson y Anna Avila por sus sugerencias y asistencia técnica. El estudio fue financiado a través de la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU., Oficina de Laboratorios de Ciencia e Ingeniería.

Materials

0.1% Gelatin STEMCELL Technologies 7903 Pre-plating Culture Substrate
48-well Plate MatTek  P48G-1.5-6-F Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass
6-well Plate Thermofisher 140675 hiPSC-CM Culture, Plastic
B-27 Supplement, with insulin Invitrogen 17504-044 Cardiomyocyte Media
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) Fisher Scientific c70-500 Tyrode’s solution
CellOPTIQ Platform and Software  Clyde Biosciences Contraction Recording and Analysis
Conical tube 15 mL Corning  352099 hiPSC-CM Dissociation
Digital CMOS Camera Hamamatsu C11440-42U30 Contraction Video Recording
D-PBS Life Technologies 14190-144 Cell Wash
Environmental Control Chamber OKOLAB INC H201-K-FRAME Environmental Regulation
Glucose  Sigma-Aldrich G8270-1kg Tyrode’s solution
Hemocytometer Fisher Scientific 22-600-107 hiPSC-CM Counting
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Tyrode’s solution
iCell Cardiomyocytes Plating Medium Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.  M1001 hiPSC-CM Plating Media
iCell Cardiomyocytes2, 01434 Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.  R1017 hiPSC-CMs
Incubator (37 °C, 5% CO2) Thermofisher 50116047 Maintain hiPSC-CMs
Inverted Microscope Olympus IX73 Imaging hiPSC-CMs
Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2)  Fisher Scientific m33-500 Tyrode’s solution
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix Corning  356230 Flexible Hydrogel Substrate
Microcentrifuge tubes 1.5 ml Fisher Scientific 05-408-129 Hydrogel Substrate Aliquot
Model 4100 Isolated High Power Stimulator AM-Systems Model 4100  Pulse Generator
MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016 Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.  R1153 DCM hiPSC-CMs
Pen-Strep Invitrogen 15140-122 Cardiomyocyte Media
Pipette L-20 Rainin 17014392 Plating Hydrogel Substrate
Pipette P1000 Fisher Scientific F123602G
Pipette tips, 1000 ul Fisher Scientific 02-707-509
Pipette tips, 20 ul Rainin GPS-L10S Making Hydrogel Substrate
Potassium Chloride (KCl)  Fisher Scientific P330-500 Tyrode’s solution
RPMI 1640, with glucose  Invitrogen 11875 Cardiomyocyte Media
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific s641-212 Tyrode’s solution
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 221465 Tyrode’s solution
Stimulation Electrodes Pacing and CCM Stimulation
Stopwatch/Timer Fisher Scientific 02-261-840 Plating Hydrogel Substrate
Trypan Blue Stain Life Technologies T10282 hiPSC-CM Counting
TrypLE Express  Life Technologies 12605-010 hiPSC-CM Dissociation
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Feaster, T. K., Casciola, M., Narkar, A., Blinova, K. Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (190), e64848, doi:10.3791/64848 (2022).
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