硫酸ジメチルによるRNA構造のプロービング in vitro および細胞内でのシーケンシングによる突然変異プロファイリング(英語)

注:このプロトコルで使用されるすべての材料、ソフトウェア、試薬、機器、およびセルに関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。 1. 遺伝子特異的 インビトロ DMS-MaP RNA インビトロ 転写目的のRNAの配列を二本鎖(ds)DNAとして取得します(例:DNAフラグメント、プラスミド、または既存の/ゲノムDNAからのPCRとして)。DNA配列にポリメラーゼプロモーターが含まれている場合は、ステップ3に進みます。 オーバーラップPCRを実行して、目的のDNA断片の上流にRNAポリメラーゼプロモーターを結合させます(T7ポリメラーゼのフォワードプライマー:5’TAATACGACTCACTATAGG +標的配列3’の最初の塩基)。 インビトロでDNA断片をRNAに転写する。RNAは常に氷上に置いてください。 DNaseを使用してDNAを消化します。 カラムベースのアプローチ(ステップ2.4)またはエタノール沈殿(ステップ2.5)を使用してRNAを単離します。適切な量で溶出し、~50 μgの収量を期待します。 アガロースゲル上でRNAを走らせてRNAの完全性を確保します。実行する前に、RNAを70°Cで2〜3分間変性させます。注:バッファーとアガロースには、RNAを分解するRNaseが含まれている可能性があり、RNAサンプルを汚染する可能性があります。プレキャストアガロースゲルは、以前にこのラボで使用されてきました。結果(特にRNAの場合)は時々曖昧でした。最良の結果は、アガロースまたはPAGEゲルで得られました。 直接使用 RNAは、解凍後に分解が見られない限り、-80°Cで数ヶ月間保存してください。 インビトロ DMS の変更 (105 mM の DMS で)十分な量のリフォールディングバッファー(0.4 Mカコジル酸ナトリウム、pH 7.2、6 mM MgCl2を含む)を調製します。注:各反応(最終容量100 μL)に対して、89 μLのリフォールディングバッファーを追加します。 各反応について、89 μLのリフォールディングバッファーを指定された1.5 mLチューブに移し、ケミカルフードの下に置いたサーモシェーカーで37°Cで予温します。注意: DMSは非常に有毒であり、還元剤で急冷されるまで、常に化学フードの下に保管する必要があります。 10 μLのヌクレアーゼフリー水(NF H2O)中の1〜10 pmolのRNAを溶出する。PCRチューブに移します。 サーモサイクラーで95°Cで1分間インキュベートし、RNAを変性させます。 折り間違いを避けるために 、すぐに 氷のブロックの上に置きます。 RNAサンプルを37°Cのリフォールディングバッファーを含む指定チューブに加え、よく混合し、10〜20分間インキュベートしてRNAをリホールドします。注:ほとんどのRNAはミリ秒から秒のオーダーで折りたたまれますが、例外は16あります。 1 μLの100%(10.5 M)DMSをRNAサンプルに加え、毎分800〜1,400回転(rpm)で振とうしながら5分間インキュベートします。注:DMSは疎水性であり、リフォールディングバッファーに完全に溶解しない可能性があるため、このステップでの振とう(またはその他の混合手段)は非常に重要です。反応時間の偏差は、DMS反応性の再現性に影響を与える可能性があります。ピペッティングエラーを最小限に抑えるために、DMSは、最終濃度1%(105 mM)のDMSが維持されている場合、サンプルに加える前に100%エタノールに溶解することができます。未処理の対照の場合、DMSはジメチルスルホキシド(DMSO)または水で置換できます。 反応時間5分後、60 μLの100%β-メルカプトエタノール(BME)でクエンチし、よく混合し、すぐにRNAを氷上に置きます。注:RNAは、BMEとの反応をクエンチしてクリーンアップした後、フードから安全に取り外すことができます。ただし、BMEが周囲に直接さらされることは、その強い臭いと刺激性があるため、避ける必要があります。 酢酸ナトリウム-エタノール沈殿(ステップ2.5を参照)またはカラムベースのアプローチ(ステップ2.6を参照)によってRNAをクリーンアップし、10 μLの水で溶出します。 分光光度計を用いてRNAを定量する。 修飾RNAを-80°Cで保存して直接使用する。注:DMS処理後のRNAの安定性が低下するため、長期保存は避けてください。 修飾RNAの遺伝子特異的RT-PCR注:DMS処理フラグメントのRT-PCRセットアップについては、 図1 を参照してください。10 μLのヌクレアーゼフリー(NF)H2O中の100 ngの修飾RNAを溶出し、PCRチューブに移します。 チューブに、4 μLの5x第一鎖バッファー(FSB)、1 μLのdNTPミックス(各10 mM)、1 μLの0.1 Mジチオスレイトール(DTT)(凍結融解サイクルを避ける)、1 μLのRNase阻害剤、1 μLの10 μMリバースプライマー(単一プライマーまたはプライマーのプール)、および1 μLのTGIRT IIIを追加します。注:プライマーのプールの場合は、各プライマーの10 μMを1 μL直接RTに追加しないでください。代わりに、最初にプライマーを混合し、混合物から1 μLを追加します(総プライマー濃度10 μM)。 サーモサイクラーで57°Cで30分から1.5時間(通常、500ntの製品を作るには30分で十分です)インキュベートします。 4 M NaOHを1 μL加え、ピペッティングで混合し、95°Cで3分間インキュベートしてRNAを分解します。注:このステップは、RNAを分解することによってcDNAからTGIRTを放出するため、非常に重要です。スキップすると、ダウンストリーム PCR が影響を受ける可能性があります。 プライマーを十分に除去するカラムベースのアプローチ(ステップ2.6を参照)を使用してクリーンアップし、10 μLのNF H2Oで溶出します。 収量と忠実度のバランスをとるように設計されたPCRキットを使用して、反応25 μLあたり1 μLの逆転写産物を使用してcDNAをPCR増幅します。注:プライマーの融解温度は~60°Cである必要があります。 2 μLのPCR産物をアガロースゲルまたはプレキャストアガロースゲルで実行し、PCRの成功を確認します。 理想的には、PCRの後に1つのバンドのみが表示されるはずです。その場合は、列ベースのアプローチを使用して反応をクリーンアップします。代替バンドが存在する場合は、残りのPCR反応を使用して、ゲルから正しいバンドを切り取ります。十分に小さい容量(例えば、10μL)で溶出する。 抽出したフラグメントを分光光度計で定量します。 目的のシーケンシングプラットフォームに適したアプローチを使用して、シーケンシング用のdsDNAフラグメントにインデックスを付けます。 図1:大きなDMS処理フラグメントのRT-PCRの実験セットアップ。 修飾されたRNAに対して逆転写を行う場合、プライマーがアニールする配列上の修飾は記録されないであろう。したがって、フラグメントの長さが400〜500bpを超える場合、ここで例示するように、プライマー領域内で重複するフラグメントを設計する必要がある。フラグメントの長さは、シーケンシングのニーズによって異なります。ペアエンド150サイクルシーケンシングを使用する場合、フラグメントは300 bpを超えてはなりません。略語:RT-PCR =逆転写ポリメラーゼ連鎖反応;DMS = 硫酸ジメチル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 2. ウイルス感染細胞を用いた全ゲノムDMS-MaP 注:細胞では、DMS処理を上記の遺伝子特異的増幅アプローチと組み合わせることもできます。全ゲノムライブラリは、単一の遺伝子を完全にカバーするために膨大なシーケンシングの深さを必要とします。ただし、ウイルスRNAが抽出後にリボデ枯渇RNAのかなりの部分を占める場合は、全ゲノムシーケンスが適切です。さらに、他の濃縮法を全ゲノムライブラリー生成法と組み合わせることができる。 DMS治療ウイルスに感染した細胞を感染の望ましい段階まで増殖させる。 必要なバイオセーフティレベルでのウイルスとDMSなどの薬剤によって生成される化学物質の両方の処理に適した専用のヒュームフードにセルコンテナを移します。 2.5%容量のDMSを培地に加え、容器(通常は10 cmプレート)をパラフィルムで密封します。注:DMSを使用すると、簡単に過小変更および過剰変更できます。DMSを細胞に直接添加する場合、よく混合することが非常に重要です。あるいは、新しい培地を50 mLのコニカルチューブで37°Cで予熱し、激しく振とうするDMSを直接加えます。使用済み培地を細胞上でデカントし、DMS含有培地中でゆっくりとピペットでピペットする。 37°Cのインキュベーターに5分間移します。注:インキュベーターの外でDMSを処理するのにかかる時間によっては、5分が過剰変更につながる可能性があります。DMSの追加からインキュベーションまでの時間を≤1分に保ちます。初めて実験を行う場合は、DMS滴定を行い、インキュベーション時間(3分から10分の間)を変えて最適な修飾率を見つけ、濃度のウィンドウ全体で結果が堅牢であることを確認することをお勧めします。 DMS含有培地を慎重にピペットで取り出し(適切な化学廃棄物に入れ)、10 mLのストップバッファー(30%BMEを含むPBS[例:3 mLのBMEと7 mLのPBS])を加えます。注意: DMSとBMEを添加すると、細胞が強く接着していない場合、細胞をプレートから持ち上げることができます。細胞が浮き上がっている場合は、DMS含有培地を除去する代わりに浮遊細胞として処理し、ストップバッファーを直接添加し、DMSとBMEで細胞を50 mLコニカルチューブにこすり落とすことができます。3,000 × gで3分間遠心分離して細胞をペレット化します。大きな液滴で細胞の下にペレット化する可能性のある残留DMSを必ず取り除いてください。DMS培地を最初に除去できない場合は、30%BMEで追加の洗浄ステップをお勧めします。 細胞をこすり、15 mLのコニカルチューブに移します。 3,000 × g で3分間遠心分離してペレット化します。 上清を取り除き、10 mLのPBSで2回洗浄します。 できるだけ多くの残留PBSを慎重に取り除きます。 ペレットを適量のRNA単離試薬(例えば、T75培養フラスコの場合は3 mL、10 cmプレートの場合は1 mL)に溶解します。注:試薬の量が不十分な場合、RNA収量に影響を与える可能性があります。 RNA抽出とリボソームRNA(rRNA)の枯渇RNA単離試薬中のホモジナイズした細胞1 mLに、200 μLのクロロホルムを加え、明るいピンク色になるまで15〜20秒間ボルテックスし、相分離が見えるまで最大3分間インキュベートします。注:ピンク色の脂質相は底に落ち着くはずです。そうでない場合は、ボルテックス時間が不十分であった可能性があります。 最高速度(~20,000 × g)で4°Cで15分間回転します。 上部水相を新しいチューブに移します。 酢酸ナトリウム-エタノール沈殿(ステップ2.5を参照)またはカラムベースのアプローチ(ステップ2.6を参照)によってRNAをクリーンアップし、十分な量のNF H2Oで溶出します。 アガロースゲルのRNA完全性を確認します。2つのリボソームサブユニットに対応する2つのバンドを探します。 好ましいアプローチを用いてrRNAを枯渇させ、適切な量(典型的には20〜50μL)のNF H2Oで溶出する。注:ダウンストリームアプリケーションでは、8 μLの容量で~500 ngの総RNAが推奨されます。 非リボソームRNAは通常、全RNAの5%〜10%しか占めません。 分光光度計を使用して定量します。 ライブラリ生成遺伝子特異的RT−PCRまたは他のアプローチを使用して、ライブラリーを生成する15。プライミングにランダムな六量体を使用する場合は、六量体アニーリングを可能にするために、低いTm( 37〜42°C)でのインキュベーションステップを追加します。注:標準ライブラリ生成キットは、RT酵素をTGIRTに置き換え、RT温度を57°Cに変更することによっても使用できます。 RNA Clean & Concentrator カラムを使用したカラムベースの RNA クリーンアップ注意: すべての手順は室温で実行する必要があります。NF H2Oをサンプルチューブに加えて、50 μLの容量にします。 100 μLの結合バッファーと150 μLの100%エタノールをサンプルに加えます。 混合してスピンカラムに移します。 10,000〜16,000 × g で30秒間回転します。フロースルーを破棄します。 400 μLのRNA調製バッファーを追加します。 10,000〜16,000 × g で30秒間回転します。フロースルーを破棄します。 700 μLのRNA洗浄バッファーを加えます。 10,000〜16,000 × g で30秒間回転します。フロースルーを破棄します。 400 μLのRNA洗浄バッファーを追加します。 10,000〜16,000 × g で30秒間回転します。フロースルーを破棄します。 (オプション)カラムを新しい収集チューブに移し、10,000〜16,000 × g で2分間回転させます。 カラムを清潔なRNAseフリーチューブに移し、適量のNF H2Oを加える。 10,000〜16,000 × g で1分間回転します。 酸性フェノール-クロロホルムRNA抽出。等量の酸性フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを加える。 徹底的に渦巻き、14,000 × g で5分間遠心分離します。 相分離がない場合は、2 M NaClを20 μL添加し、遠心分離を繰り返します。 水相を新しいチューブに移します。 500 μLのイソプロパノールと2 μLの共沈剤を追加します。 混合し、RTで3分間インキュベートします。その後、-80°Cで一晩インキュベートします。 最高速度(~20,000 × g)で4°Cで30分間遠心分離することにより、RNAをペレット化します。 ペレットを200μLの氷冷70%エタノールで洗浄します。 最高速度(~20,000 × g)で5分間回転します。フロースルーを破棄します。 ペレットを適量のNF H2Oに再懸濁する。 オリゴクリーンカラムとコンセントレータカラムを使用したカラムベースのcDNAクリーンアップ注意: すべての手順は室温で実行する必要があります。NF H2Oをサンプルチューブに加えて、50 μLの容量にします。 100 μLの結合バッファーと400 μLの100%エタノールを加えます。 混合してスピンカラムに移します。 10,000〜16,000 × g で30秒間回転します。フロースルーを破棄します。 750 μLのDNA洗浄バッファーを追加します。 10,000〜16,000 × g で30秒間回転します。フロースルーを破棄します。 (オプション)カラムを新しい収集チューブに移し、10,000〜16,000 × g で2分間回転させます。 カラムを清潔なRNAseフリーチューブに移し、適量のNFH2Oを加える。 10,000〜16,000 × g で1分間回転します。 3. シーケンシングデータの解析 注:DMS-MaPシーケンシングデータからRNA二次構造モデルを作成するには、結果の.fastqファイルをいくつかの異なるステップで処理する必要があります。これらの手順は、 アダプターシーケンスをトリムガロアまたはカットアダプトでトリミングします。 Bowtie2を使用してリードを参照配列(.fasta形式)にマッピングします。 特殊なRNA構造ソフトウェア(DREEM14、RNA-Framework17など)でリードをカウントし、反応性プロファイルを作成します。 (オプション)リードをクラスター化し、DREEM14、DRACO 17、DANCE-MaP18などを使用して代替RNAコンフォメーションを見つけます。 RNAStructure12、ViennaRNAなどを使用して、反応性プロファイルに基づいて最小自由エネルギー構造を予測します。 RNA11 構造をVARNA(https://varna.lri.fr/)などを用いて可視化する。注:実用性のために、DREEM(www.rnadreem.org)やRNA-Framework19 などのソフトウェアは、パイプラインにステップ1〜5を大量に組み込んでおり、分析プロセスを合理化しています。しかしながら、いかなる構造予測も注意して取り扱われるべきである(例えば、構造とデータ20との一致を検証することによって)。