فحص بنية الحمض النووي الريبي مع التنميط الطفري لكبريتات ثنائي ميثيل مع التسلسل في المختبر والخلايا
Summary
يوفر البروتوكول تعليمات لتعديل الحمض النووي الريبي مع كبريتات ثنائي ميثيل لتجارب التنميط الطفري. ويشمل التحقيق في المختبر وفي الجسم الحي مع طريقتين بديلتين لإعداد المكتبة.
Abstract
أصبح دور بنية الحمض النووي الريبي في أي عملية بيولوجية تقريبا واضحا بشكل متزايد ، خاصة في العقد الماضي. ومع ذلك ، فشلت الأساليب الكلاسيكية لحل بنية الحمض النووي الريبي ، مثل علم بلورات الحمض النووي الريبي أو cryo-EM ، في مواكبة المجال سريع التطور والحاجة إلى حلول عالية الإنتاجية. التنميط الطفري مع التسلسل باستخدام كبريتات ثنائي ميثيل (DMS) MaPseq هو نهج قائم على التسلسل لاستنتاج بنية الحمض النووي الريبي من تفاعل القاعدة مع DMS. يقوم DMS بميثيل النيتروجين N1 في الأدينوزينات و N3 في السيتوزينات في وجه Watson-Crick عندما تكون القاعدة غير متزاوجة. يؤدي النسخ العكسي للحمض النووي الريبي المعدل مع النسخ العكسي للمجموعة الثانية من الإنترون القابل للحرارة (TGIRT-III) إلى دمج القواعد المثيلية كطفرات في cDNA. عند تسلسل cDNA الناتج وتعيينه مرة أخرى إلى نسخة مرجعية ، فإن معدلات الطفرة النسبية لكل قاعدة تشير إلى “حالة” القاعدة على أنها مقترنة أو غير متزاوجة. على الرغم من أن تفاعلات DMS لها نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية في كل من المختبر والخلايا ، إلا أن هذه الطريقة حساسة للتحيز في إجراءات المعالجة. للحد من هذا التحيز ، توفر هذه الورقة بروتوكولا لعلاج الحمض النووي الريبي باستخدام DMS في الخلايا ومع الحمض النووي الريبي المنسوخ في المختبر .
Introduction
منذ اكتشاف أن الحمض النووي الريبي له خصائص هيكلية 1,2 و3 تحفيزية ، تم الكشف تدريجيا عن أهمية الحمض النووي الريبي ووظيفته التنظيمية في عدد كبير من العمليات البيولوجية. في الواقع ، اكتسب تأثير بنية الحمض النووي الريبي على تنظيم الجينات اهتماما متزايدا4. مثل البروتينات ، يحتوي الحمض النووي الريبي على هياكل أولية وثانوية وثالثية ، في إشارة إلى تسلسل النيوكليوتيدات ، ورسم الخرائط 2D لتفاعلات إقران القواعد ، والطي ثلاثي الأبعاد لهذه الهياكل المقترنة بالقاعدة ، على التوالي. في حين أن تحديد الهيكل الثلاثي هو المفتاح لفهم الآليات الدقيقة وراء العمليات المعتمدة على الحمض النووي الريبي ، فإن الهيكل الثانوي هو أيضا غني بالمعلومات فيما يتعلق بوظيفة الحمض النووي الريبي وهو الأساس لمزيد من الطي 3D5.
ومع ذلك ، فإن تحديد بنية الحمض النووي الريبي كان يمثل تحديا جوهريا مع الأساليب التقليدية. بينما بالنسبة للبروتينات ، فإن علم البلورات والرنين المغناطيسي النووي (NMR) والمجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) قد جعل من الممكن تحديد تنوع الزخارف الهيكلية ، مما يسمح بالتنبؤ بالبنية من التسلسل وحده6 ، فإن هذه الأساليب لا تنطبق على نطاق واسع على الحمض النووي الريبي. في الواقع ، الحمض النووي الريبي عبارة عن جزيئات مرنة ذات كتل بناء (نيوكليوتيدات) تتمتع بحرية أكبر في المطابقة والدوران مقارنة بنظيراتها من الأحماض الأمينية. علاوة على ذلك ، فإن التفاعلات من خلال الاقتران القاعدي أكثر ديناميكية وتنوعا من تلك الموجودة في بقايا الأحماض الأمينية. نتيجة لذلك ، كانت الأساليب الكلاسيكية ناجحة فقط للحمض النووي الريبي الصغير نسبيا مع هياكل محددة جيدا ومدمجة للغاية7.
هناك نهج آخر لتحديد بنية الحمض النووي الريبي من خلال الفحص الكيميائي جنبا إلى جنب مع تسلسل الجيل التالي (NGS). تولد هذه الاستراتيجية معلومات حول حالة الربط لكل قاعدة في تسلسل الحمض النووي الريبي (أي هيكلها الثانوي). باختصار ، يتم تعديل القواعد في جزيء الحمض النووي الريبي التي لا تشارك في تزاوج القواعد بشكل تفاضلي بواسطة مركبات كيميائية صغيرة. يدمج النسخ العكسي لهذه الحمض النووي الريبي مع النسخ العكسي المتخصص (RTs) التعديلات في الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين التكميلي (cDNA) كطفرات. ثم يتم تضخيم جزيئات cDNA هذه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتسلسلها. للحصول على معلومات حول “حالتها” على أنها مقيدة أو غير مرتبطة ، يتم حساب ترددات الطفرة في كل قاعدة في الحمض النووي الريبي محل الاهتمام وإدخالها في برنامج التنبؤ بالهيكل كقيود8. استنادا إلى أقرب قواعد الجيران9 والحد الأدنى من حسابات الطاقة الحرة 10 ، يقوم هذا البرنامج بإنشاء نماذج هيكلية تناسب البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها11,12.
يستخدم DMS-MaPseq DMS ، الذي يثيل النيتروجين N1 في الأدينوزين والنيتروجين N3 في السيتوزينات في وجه Watson-Crick بطريقة محددة للغاية13. يؤدي استخدام النسخ العكسي للمجموعة الثانية القابلة للحرارة (TGIRT-III) في النسخ العكسي إلى إنشاء ملفات تعريف طفرية بنسب إشارة إلى ضوضاء غير مسبوقة ، حتى السماح بفك التفاف الملامح المتداخلة الناتجة عن اثنين أو أكثر من المطابقات البديلة14,15. علاوة على ذلك ، يمكن لنظام DMS اختراق أغشية الخلايا والأنسجة الكاملة ، مما يجعل التحقيق في السياقات الفسيولوجية ممكنا. ومع ذلك ، فإن توليد بيانات عالية الجودة يمثل تحديا ، حيث يمكن أن تؤثر الاختلافات في إجراءات المعالجة على النتائج. لذلك ، نقدم بروتوكولا مفصلا لكل من DMS-MaPseq في المختبر وداخل الخلية لتقليل التحيز وتوجيه الوافدين الجدد إلى الطريقة من خلال الصعوبات التي قد يواجهونها. خاصة في ضوء جائحة SARS-CoV2 الأخيرة ، تعد البيانات عالية الجودة حول فيروسات الحمض النووي الريبي أداة مهمة لدراسة التعبير الجيني وإيجاد العلاجات الممكنة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول هنا كيفية فحص الحمض النووي الريبي في المختبر وفي الخلايا باستخدام تجارب التنميط الطفري DMS. علاوة على ذلك ، فإنه يعطي تعليمات حول كيفية إعداد المكتبات لتسلسل Illumina لإنشاء بيانات خاصة بالجينات وتحليل ملفات .fastq التي تم الحصول عليها. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام أساليب المكتبة على مستوى الجينوم. ومع ذلك ، فإن RT-PCR الخاص بالجينات ينتج أعلى جودة وأقوى البيانات. لذلك ، في حالة المقارنة بين العينات ، من المهم التأكد من إعدادها باستراتيجيات تسلسل متطابقة ، لأن توليد المكتبة يسبب بعض التحيز. يجب دائما قياس قابلية التكرار باستخدام النسخ المتماثلة.
عدة احتياطات
الحمض النووي الريبي هو جزيء غير مستقر حساس للتدهور من خلال درجات الحرارة المرتفعة و RNases. لذلك ، يوصى باتخاذ تدابير خاصة – استخدام معدات الحماية الشخصية (PPE) ، والمواد الخالية من الحمض النووي الريبي ، ومثبطات الحمض النووي الريبي. الأهم من ذلك ، يجب أن تبقى الحمض النووي الريبي على الجليد كلما أمكن ذلك. هذا ينطبق بشكل خاص على الحمض النووي الريبي الميثيلي ، وهو أكثر حساسية لدرجات الحرارة المرتفعة.
من المهم التأكد من أن بنية الحمض النووي الريبي ذات الأهمية ليست حساسة لتركيز DMS والظروف العازلة. تعطي المخازن المؤقتة مثل 100 mM Tris و 100 mM MOPS و 100 mM HEPES عند درجة الحموضة 7-7.5 إشارة عالية ولكنها قد لا تكون كافية للحفاظ على الرقم الهيدروجيني أثناء التفاعل21. نظرا لأن DMS يتحلل بالماء ، مما يقلل من درجة الحموضة ، فإن المخزن المؤقت القوي أمر بالغ الأهمية للحفاظ على درجة حموضة محايدة أثناء تفاعل التعديل. لقد ثبت أن إضافة البيسين تساعد في الحفاظ على الرقم الهيدروجيني كأساسيقليلا 21 ولكنها تؤدي إلى تعديل DMS منخفض على Gs و Us ، والذي يمكن أن يكون مفيدا ولكن يجب تحليله بشكل منفصل بسبب إنتاج إشارة أقل بكثير من As و Cs ولم تتم مناقشته بشكل أكبر في هذا البروتوكول.
في RT-PCR الخاص بالجينات ، يتم نسخ الحمض النووي الريبي المعدل بشكل عكسي إلى الحمض النووي وتضخيمه في أجزاء بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. في حين أن حجم الحمض النووي الريبي يمكن أن يكون نظريا غير محدود ، يجب ألا تتجاوز شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل هذه طول 400-500 زوج أساسي (bp) لمنع التحيز أثناء تفاعل النسخ العكسي. من الناحية المثالية ، يجب أن تكون الأجزاء ضمن نطاق تشغيل التسلسل (على سبيل المثال ، إذا تم إجراء التسلسل باستخدام برنامج تسلسل نهاية مزدوجة 150 × 150 دورة ، يجب ألا يتجاوز الجزء الواحد 300 نقطة أساس). عند استخدام برامج التسلسل مع دورات أقل ، يمكن تجزئة منتجات PCR باستخدام dsDNase. علاوة على ذلك ، نظرا لأن التسلسلات داخل تسلسلات التمهيدي لا تحتوي على أي معلومات هيكلية ، يجب أن تتداخل الأجزاء عندما يتكون الحمض النووي الريبي الذي تم فحصه من جزء >1. يمكن أن تحتوي تفاعلات RT على بادئات RT متعددة لأجزاء مختلفة (حتى 10 بادئات RT مختلفة). اعتمادا على التسلسلات ، يمكن أن يؤدي تجميع بادئات RT إلى جعل النسخ العكسي أقل كفاءة ولكنه يعمل بشكل جيد عادة. يجب إجراء كل تفاعل PCR بشكل منفصل.
عند فحص الحمض النووي الريبي باستخدام DMS ، تلعب الظروف التجريبية دورا إضافيا ، حيث أن العديد من الحمض النووي الريبي غير مستقر ديناميكيا حراريا ويغير شكله بناء على عوامل بيئية مثل درجة الحرارة. لتجنب المخالفات ، يجب أن تظل الظروف التجريبية ثابتة قدر الإمكان ، وكذلك فيما يتعلق بأوقات رد الفعل. يبدو أن الظروف العازلة قابلة للتبادل إلى درجة معينة17،20،22،23 عندما يتم الحفاظ على الشروط الأساسية – قدرة التخزين المؤقت ووجود أيونات أحادية التكافؤ (Na) وأيونات ثنائية التكافؤ (Mg) – لضمان الطي السليم للحمض النووي الريبي 24.
فيما يتعلق بإعداد المكتبة للحمض النووي الريبي المعدل ، يجب مراعاة عدة جوانب. أولا ، كما ذكرنا من قبل ، فإن الحمض النووي الريبي المعدل أقل استقرارا من نظيراته غير المعدلة ، مما يعني أنه قد يتطلب تحسين أوقات التجزئة للتوزيع الأمثل لحجم الشظايا. علاوة على ذلك ، تستخدم بعض مجموعات إعداد مكتبة RNA ، بالإضافة إلى العديد من أساليب RNAseq الأخرى ، مواد أولية عشوائية في مجموعة النسخ العكسي. قد يؤدي هذا إلى انخفاض تغطية المرجع ، خاصة في 3 ‘من الجين ، وفي النهاية ، إلى عمق تغطية غير كاف. إذا كانت تغطية منطقة معينة منخفضة للغاية ، فقد يكون من الضروري إزالة هذه القواعد من التنبؤ بالهيكل. بصرف النظر عن RT-PCR ومجموعات RNAseq للجينوم الكامل ، يمكن استخدام طرق إعداد المكتبة الأخرى. تعتبر البروتوكولات التي تتضمن ربط محولات 3 ‘و / أو 5’ بالحمض النووي الريبي مفيدة عند استخدام أجزاء صغيرة من الحمض النووي الريبي أو عندما يجب تجنب فقدان معلومات الفحص في مناطق التمهيدي.
أخيرا ، يجب دائما تفسير تحليل تجارب الفحص الكيميائي بعناية. حاليا ، لا يوجد برنامج يتنبأ ببنية الحمض النووي الريبي لأي RNA من التسلسل وحده بدقة عالية. على الرغم من أن قيود الفحص الكيميائي تحسن الدقة بشكل كبير ، إلا أن توليد نماذج جيدة للحمض النووي الريبي الطويل (>500 نانومتر) لا يزال يمثل تحديا. يجب اختبار هذه النماذج بشكل أكبر من خلال طرق و / أو طفرات أخرى. يعمل برنامج التنبؤ بالحمض النووي الريبي على تحسين الحد الأقصى لعدد أزواج القواعد ، وبالتالي معاقبة التوافقات المفتوحة بشكل كبير ، والتي قد لا تمثل بدقة طي الحمض النووي الريبي5. وبالتالي ، يجب اختبار نموذج البنية الذي تم الحصول عليه عن طريق تحديد اتفاق التنبؤ الكمي مع بيانات التحقيق الكيميائي الأساسية (على سبيل المثال ، بواسطة AUROC) وبين النسخ المتماثلة (على سبيل المثال ، بواسطة mFMI) ، كما يتضح من Lan et al.20.
من الناحية المثالية ، يجب استخدام العديد من التجارب في أنظمة مختلفة لتحدي نموذج الهيكل الذي تم الحصول عليه لتعزيز فرضية المرء. يمكن أن يشمل ذلك استخدام الأساليب في المختبر وفي الخلية ، والطفرات التعويضية ، وخطوط الخلايا والأنواع المختلفة. علاوة على ذلك ، غالبا ما تكون التفاعلات الخام بنفس القدر أو حتى أكثر إفادة من تنبؤات الهيكل ، لأنها تسجل لقطة “الحقيقة الأرضية” لمجموعة طي الحمض النووي الريبي. على هذا النحو ، فإن التفاعلات الأولية مناسبة جدا وغنية بالمعلومات لمقارنة تغيرات الهيكل بين الظروف المختلفة. الأهم من ذلك ، يجب استخدام أقل هياكل الطاقة الحرة المحسوبة باستخدام قيود التحقيق الكيميائي مع التنبؤ الحسابي فقط كفرضية بداية نحو نموذج بنية كاملة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي
Materials
| 1 Kb Plus DNA Ladder | 10787018 | Thermo | |
| 2-mercaptoethanol | M6250-250ML | Sigma | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 | AM9720 | Thermo | |
| Advantage PCR | 639206 | Takara | |
| CloneAmp HiFi PCR Premix | 639298 | Takara | |
| DMS | D186309 |
Sigma | |
| dNTPs 10 mM each | U151B | Promega | |
| E-Gel EX Agarose Gels, 2% | G402022 | Thermo | precast agarose gels |
| Ethanol (200 proof) | E7023-4X4L | Sigma | |
| Falcon tubes, 15 mL, 50 mL | |||
| GlycoBlue | co-precipitant | ||
| HCT-8 cells | ATCC #CCL-244 | ||
| Invitrogen MgCl2 (1 M) | AM9530G | fisherscientific | |
| Isopropanol | 278475 | Sigma | |
| Megascript T7 transcription | AM1334 | Thermo | |
| NanoDrop spectrophotometer | |||
| Novex TBE Gels, 8%, 10 well | EC6215BOX | Thermo | |
| OC43 | ATCC #VR-1558 | ||
| RiboRuler Low Range RNA Ladder | SM1831 | Thermo | |
| RNAse H | M0297L | NEB | |
| Sodium Cacodylate, 0.4 M, pH 7.2 | 102090-964 | VWR | |
| Sodium hydroxide solution | S8263-150ML | Sigma | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase for FSB and DTT | 18064014 | Thermo | |
| TGIRT-III Enzyme | TGIRT50 | Ingex | |
| The Oligo Clean & Concentrator | D4060 | Genesee | |
| The RNA Clean & Concentrator kits are RNA clean up kits | R1016 | Genesee | |
| TRIzol Reagents | 15596018 | Thermo | RNA isolation reagent |
| Water, (For RNA Work) (DEPC-Treated, DNASE, RNASE free/Mol. Biol.) | BP561-1 | fisherscientific | |
| xGen Broad-range RNA Library Prep 16rxn | 10009865 | IDT | |
| Zymo RNA clean and concentrator columns |
References
- Kim, S. H., et al. Three-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine transfer RNA. Science. 185 (4149), 435-440 (1974).
- Robertus, J. D., et al. Structure of yeast phenylalanine tRNA at 3 Å resolution. Nature. 250 (467), 546-551 (1974).
- Zaug, A. J., Cech, T. R. In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor in nuclei of Tetrahymena. Cell. 19 (2), 331-338 (1980).
- Zhao, Y., et al. NONCODE 2016: An informative and valuable data source of long non-coding RNAs. Nucleic Acids Research. 44, D203-D208 (2016).
- Vandivier, L. E., Anderson, S. J., Foley, S. W., Gregory, B. D. The conservation and function of RNA secondary structure in plants. Annual Review of Plant Biology. 67, 463 (2016).
- Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
- Das, R. RNA structure: A renaissance begins. Nature Methods. 18 (5), 439-439 (2021).
- Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct, versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10 (11), 1643-1669 (2015).
- Mathews, D. H., et al. Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7287-7292 (2004).
- Zuker, M., Stiegler, P. Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary information. Nucleic Acids Research. 9 (1), 133-148 (1981).
- Lorenz, R., et al. ViennaRNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6, (2011).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, (2010).
- Wells, S. E., Hughes, J. M. X., Igel, A. H., Ares, M. Use of dimethyl sulfate to probe RNA structure in vivo. Methods in Enzymology. , 479-493 (2000).
- Tomezsko, P. J., et al. Determination of RNA structural diversity and its role in HIV-1 RNA splicing. Nature. 582 (7812), (2020).
- Zubradt, M., et al. DMS-MaPseq for genome-wide or targeted RNA structure probing in vivo. Nature Methods. 14 (1), (2017).
- Woodson, S. A. Compact intermediates in RNA folding. Annual Reviews in Biophysics. 39, (2010).
- Morandi, E., et al. Genome-scale deconvolution of RNA structure ensembles. Nature Methods. 18 (3), 249-252 (2021).
- Olson, S. W., et al. Discovery of a large-scale, cell-state-responsive allosteric switch in the 7SK RNA using DANCE-MaP. Molecular Cell. 82 (9), 1708-1723 (2022).
- Incarnato, D., Morandi, E., Simon, L. M., Oliviero, S. RNA Framework: An all-in-one toolkit for the analysis of RNA structures and post-transcriptional modifications. Nucleic Acids Research. 46 (16), (2018).
- Lan, T. C. T., et al. Secondary structural ensembles of the SARS-CoV-2 RNA genome in infected cells. Nature Communications. 13 (1), 1128 (2022).
- Homan, P. J., et al. Single-molecule correlated chemical probing of RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (38), 13858-13863 (2014).
- Yang, S. L., et al. Comprehensive mapping of SARS-CoV-2 interactions in vivo reveals functional virus-host interactions. Nature Communications. 12 (1), 5113 (2021).
- Manfredonia, I., et al. Genome-wide mapping of SARS-CoV-2 RNA structures identifies therapeutically-relevant elements. Nucleic Acids Research. 48 (22), 12436-12452 (2020).
- Fischer, N. M., Polěto, M. D., Steuer, J., vander Spoel, D. Influence of Na+ and Mg2+ ions on RNA structures studied with molecular dynamics simulations. Nucleic Acids Research. 46 (10), 4872-4882 (2018).
