容積制御出血性ショックのブタ乳児モデルの説明

このプロトコルの実験は、スペインのマドリッドにあるグレゴリオマラニョン大学病院の動物研究のための施設倫理委員会、およびマドリッド自治政府の農業環境評議会(許可番号:12/0013)によって承認されました。倫理的ケアと実験動物の使用に関するヨーロッパとスペインのガイドラインが研究全体を通して適用されました。実験は、スペインのマドリッドにあるグレゴリオマラニョン大学病院の実験医学および外科で行われました。 注:選択した動物モデルは、生後2〜3か月(8〜12 kg)の健康なミニブタ(Sus scrofa domestica)で構成されていました。ミニブタは、生物医学研究に適した3つの異なる品種の交配の結果です。これらの動物はほぼ同一の血統であり、マドリッドの特別に認可された繁殖施設(IMIDRA)によって提供され、3つのホモ接合体の遺伝子系統を純粋に維持しています。雄と雌の動物は同じ意味で使われていました。動物には標準的な豚の餌を与え、健康を確保するために最低2日間観察しました。誤嚥のリスクを減らすために、処置の前夜に食事を抜いたが、水は出さなかった。一般的な実験では、麻酔導入と手術準備に30分、計装に60分、回復に30分、出血誘発と後方安定化に60分、蘇生に30分、フォローアップに120分など、完了するまでに約6時間かかります。 1.麻酔、挿管、人工呼吸器 首の外側領域、耳の後ろ、または大腿骨後部にケタミン(10 mg / kg)とアトロピン(0.02 mg / kg)の筋肉内注射で豚に前投薬します。.注:アトロピンなどの抗コリン薬は、豚が麻酔下で過剰に唾液を分泌する可能性があるため、有用です10。私たちの経験では、この用量のケタミンはストレスを軽減するのに十分であり、悪影響なしに豚に適切な鎮静と鎮痛を誘発します。ただし、動物が適切に鎮静されていない場合、または飼育室から手術室までの距離が長い場合は、別の用量のケタミン(10 mg / kg)を安全に投与できます。注意:動物を取り扱うときは手袋が必要です。 鎮静された動物を手術室に運び、温かい毛布を備えた手術台に置きます。 豚の耳にクリップで留めたセンサーで末梢酸素飽和度(Sp02)を測定し、連続的な3誘導心電図(EKG)モニタリングを開始します。 ポビドンヨードまたはクロルヘキシジンスクラブとアルコールを少なくとも3回交互に皮膚を消毒します。末梢静脈カテーテル(22-24 G)を耳静脈に挿入します。事前に消毒液で皮膚を消毒してください。 フェンタニル (5 μg/kg)、プロポフォール (4 mg/kg)、アトラクリウム (0.5 mg/kg) の静脈内注射により麻酔を誘発する。自発呼吸がなくなり、反射神経がないことを確認したら、動物を背臥位にし、吸気酸素(Fi02)の割合を100%に設定した犬用マスクでハンドバッグマスクの換気を直ちに開始します。注:神経筋遮断薬の使用に関連する偶発的な認識のリスクを減らすために、豚で有効性が知られており、上限の用量の麻酔薬を使用して、適切なレベルの麻酔を確保する必要があります。.さらに、心拍数、血圧、体温などの心血管徴候を継続的に監視し、離脱反射(足の離脱、眼瞼反射、顎の緊張)がなく、筋肉の緊張がリラックスしている場合にのみ神経筋遮断薬を投与します。. 気管内挿管を行います。この手順には、少なくとも 2 人のオペレーターが必要です。気管内挿管に必要な基本的な機器と手術器具の準備が整っていることを確認します:口を開けてチューブを固定するためのガーゼ、長さ17〜25 cmのストレートブレードを備えた獣医用喉頭鏡、一般的な気管内チューブ(ID 4-5)、スタイレット、空気の入った注射器、粘着テープ。 舌を少し引き出し、上下の犬歯の後ろに置いたタイガーゼを使用して顎を開いたままにします。 喉頭鏡検査を行い、喉頭蓋が見えたら、喉頭鏡の先端を使用して喉頭蓋を舌の付け根に向かって上向きに押します。注:喉頭蓋が軟口蓋に付着している場合、チューブの先端で背側に変位する可能性があります。オペレーター 1 はステップ 1.6.2 を実行し、オペレーター 2 はステップ 1.6.3 を実行します。 声帯が見えてきたら、チューブを気管に少し回転させてゆっくりと進めます。注:気管の最も狭い点は声門下レベルにあります。チューブの挿入が難しい場合は、少し回転させるか、チューブを小さくしてみてください。 スタイレットを取り外し、5 mLのシリンジを使用してカフを膨らませます。 対称的な胸部の上昇、適切な酸素飽和度(95%〜100%)、および適切な波形と潮汐終末CO2(EtCO2 )の読み取り値を観察して、気管内チューブの配置を確認します。.注意:豚は喉頭痙攣や喉頭粘膜の浮腫に非常に敏感であり、喉頭穿孔は、挿管を数回試みた後、または鎮静が不十分な場合にも発生する可能性があります10。 挿管を確認した後、呼吸数20回/分、一回換気量8mL/kg、FiO240%、呼気終末陽圧4cmH2Oの人工呼吸器を使用して人工呼吸器を開始する。二酸化炭素(PaCO2)の分圧が35〜45mmHgになるように換気を調整します。 フェンタニル (10 μg/kg/h)、プロポフォール (10 mg/kg/h)、およびアトラクリウム (2 mg/kg/h) の連続注入 により 、実験全体を通して深い麻酔を維持します。 2. インストルメンテーション 血管カテーテル検査のために大腿骨領域を準備します。包帯を使用して脚を後ろに引き、ポビドンヨードまたはクロルヘキシジンスクラブとアルコールを少なくとも3回交互に鼠径部を消毒します。 超音波で大腿血管を評価し、ドップラー法を使用して動脈と静脈を区別します。静脈のサイズに応じて、大腿静脈の1つに3つのポートを備えた5.5〜7.5フレンチ(F)中心静脈カテーテルを、連続超音波ビューでセルディンガー法を使用して挿入します11,12。 中心静脈カテーテル留置直後に、トランスデューサーシステムを接続して中心静脈圧を測定します。 グルコース注入(20 mL / h)を含む電解質が中心ラインポートの1つに接続され、維持生理食塩水注入(5 mL / h)が残りのポート を介して 注入され、カテーテルの閉塞が防止されていることを確認します。. 同じ技術を使用して、心拍出量モニタリング用に特別に設計された4Fの動脈カテーテルで反対側の大腿動脈をカニューレ挿入します。超音波検査で確認できない場合は、血液ガス検査を行ってカテーテルの正しい位置を確立します。注:重大なけいれんまたは血腫の場合は、対側の大腿動脈にクロスオーバーします。 動脈カテーテルを挿入したら、心拍出量モニターシステムと動脈トランスデューサーの動脈ワイヤーをモニターポートに直接接続します。モニターの静脈測定ユニットを中心静脈トランスデューサーに同時に接続します。注:この実験で使用した心拍出量モニターは、 材料表に指定されています。セットアップ、キャリブレーション、および対策については、製造元の指示13 を参照してください。 静脈トランスデューサーと動脈トランスデューサーの両方がゼロに校正されていることを確認してください。 左内頸動脈と左外頸静脈を切除法 で 露出させます。メス、先端が鈍い手術用ハサミ、組織鉗子、小型の自己保持型組織リトラクター、ニードルホルダー、外科用スワップ、針による縫合糸、18 G IVカニューレ1本、イントロデューサー付き5Fカテーテルシース1本、セルディンガーガイドワイヤー1本など、必要な機器と手術器具が揃っていることを確認します。 動物を背臥位にした状態で、消毒液で首の皮膚を消毒します。 メスを使用して左気管傍切開~10cmを行い、下顎と顎の角度の間の線を二等分します。 外頸静脈を露出させるには、SCMの外側の組織を解剖し、静脈を周囲の筋膜から分離します。 隔離後、静脈の周りにループ状に巻かれた2つの非吸収性シルク縫合糸(USP-0)を使用して、穿刺前に血管を固定します。 ベンフロン針(18 G)で静脈を切開します。静脈内に入ったら、針を引っ込め、ガイドワイヤーをベンフロンチューブに挿入します。 ベンフロンチューブを取り外し、イントロデューサー(5 F)でシースをワイヤーに挿入します。挿入後、イントロデューサーとワイヤーの両方を取り外します。 挿入後すぐに、血栓の形成を防ぐために0.9%NaCl(5 mL / h)でシースをすすぎます。 近位シルク縫合糸をシースの周りに結んで固定します。その後、シースのハンドルをSCMに固定し、ホッチキスで皮膚を閉じます。 外科的準備後、ベースラインモニタリング値と血液サンプルを取得する前に、動物を30分間安定させます。 実験中は、サーマルブランケットとオーバーヘッドウォーマーを使用して、血液温度を37〜39°Cに維持します。注意: 温度は、熱希釈動脈カテーテルの先端にあるサーミスタで測定されます。 3.血行動態および灌流モニタリング 心電図、末梢酸素飽和度、呼吸量と圧力、およびFi02を監視します。 気管内チューブとマルチパラメータモニターの間に肺活量計を接続して、定性的および定量的なEtC02を測定します。メモ: マルチパラメータモニタの詳細については、 材料表を参照してください。 近赤外分光法(NIRS)を使用して、脳組織酸素化指数(bTOI)と内臓組織酸素化指数(aTOI)を監視します。センサーを額と前腹壁(肝下領域)の皮膚に置きます。注:脳センサーは、上矢状洞静脈血で汚染されている可能性があるため、正中線に置かないでください14。 内頸動脈に取り付けた血流プローブをフローモニターに接続し、頸動脈血流(CaBF)を測定します。 前腹壁の皮膚にレーザードップラーセンサーを配置して、皮膚組織血流(CuTBF)を連続的に測定します。注意: 頸動脈および皮膚房状ブローフローセンサーの詳細については、 材料表を参照してください。 ベースライン時および30分ごとに次のパラメータを記録します:血液温度、吸気一回換気量、EtCO2、心拍リズム、心拍数(HR)、収縮期血圧および拡張期血圧、平均動脈血圧(MAP)、ショック指数(HR /収縮期血圧)15、中心静脈圧、心臓指数(CI)、グローバル拡張末期容積指数(GEDVI)、脳卒中容積指数(SVI)、左心室収縮性(Dt / Dpmax)、 全身血管抵抗指数 (SVRI)、血管外肺水指数 (ELWI)、圧力脈拍変動 (PPV)、末梢ヘモグロビン飽和度、中心静脈飽和度 (ScvO2)、脳 (bTOI) および内臓 (aTOI) 組織酸素化指数 NIRS、CaBF、および CuTBF による。 CI値を得るには、中心静脈カテーテルを通して8°C未満の温度で0.9%生理食塩水の5 mLボーラスを注入します。連続する 2 つのメジャーの平均を記録します。 大腿血管から0.3 mLの血液を採取することにより、30分ごとに動脈および静脈の血液ガスプロファイルと乳酸濃度を決定します。標準的な全血球計算、凝固研究、および生化学をベースライン時、出血誘発後、および実験の最後に実施します。 各採血後、0.5 mLの100 IU / mLヘパリンでラインを洗い流します。 4.出血性ショック誘発 インスツルメンテーションとベースラインデータが収集された後、定常状態が達成されたら、30分以上かけて頸静脈から30 mL / kgの血液を回収することにより、血液量減少性ショックを誘発します。. 安定化のために30分かかります。この期間中は、救急医療チームの到着の遅れを模倣するために蘇生努力をしないでください。 5.輸液とフォローアップ 安定化期間の後、ボリュームエキスパンダーまたは血管作用剤のボーラスを30分間注入します。注:テストされたボリュームエキスパンダーと血管作用薬の例は、通常の生理食塩水、高張性アルブミン、アンジオテンシン、およびテルリプレシンです。この研究では、30 mL / kgの生理食塩水(NS)(n = 13)、15 mL / kgの5%アルブミンと3%高張生理食塩水(AHS)(n = 13)、または15 μg / kgのテルリプレシンと15 mL / kgの5%アルブミンと3%高張生理食塩水(TAHS)(n = 13)の単一の静脈内ボーラスが使用されました。 注入後、動物を120分間フォローアップします。血行動態パラメータを記録し、動脈および静脈の血液ガスプロファイルと乳酸濃度の決定のために30分ごとに血液サンプルを取得します。この期間中は蘇生努力をしないでください。 6. 実験終了と安楽死 実験が完了したら、鎮静剤の過剰摂取(5 μg/kgのフェンタニルと10 mg/kgのプロポフォール)と塩化カリウムの静脈内注射(2 mEq/kg)を使用して、蘇生に成功したすべての動物を犠牲にします。 連続心電図ディスプレイで、収縮または脈拍のない電気的活動による循環の欠如、侵襲的動脈圧モニタリング中の拍動性流れの欠如、およびその他のバイタルサインの欠如を確認します。 フォローアップ期間中に動脈血圧が25 mmHg未満に低下した場合は、それ以上の苦しみを避けるために動物を犠牲にしてください。