JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Физиологическая характеристика голобионта коралла с использованием нового инструмента микрореспирометрии

Published: April 28, 2023
doi:
10.3791/64812
, ,
1Minderoo Foundation, 2Marine Scotland Science, 3Australian Institute of Marine Science

Summary

Этот протокол описывает настройку и работу системы микрореспирометрии, которая может быть использована для исследования физиологических особенностей кораллового голобионта.

Abstract

Метаболическая активность, определяемая как сумма процессов в организме, связанных с энергией, имеет решающее значение для понимания функционирования и эволюции жизни на Земле. Таким образом, измерение скорости метаболизма организмов находится в центре объяснения физиологического состояния организмов, их экологической роли и влияния изменений окружающей среды на виды в наземных и водных экосистемах. На коралловых рифах измерения метаболизма использовались для количественной оценки функционирования симбиоза между кораллами и их облигатными водорослями-симбионтами (Symbiodiniaceae), а также для оценки того, как факторы стресса окружающей среды, включая изменение климата, повлияют на здоровье кораллов. Несмотря на эту значимость, существует недостаток методов и, следовательно, данных, касающихся измерения скорости метаболизма у потомства кораллов, вероятно, из-за их небольшого размера. Чтобы восполнить этот пробел, данное исследование было направлено на разработку специальной установки для измерения дыхания мелких (миллиметровый диапазон размеров) морских животных. Такая низкая стоимость и простота настройки должны позволить улучшить измерение скорости метаболизма. Это будет иметь важное значение для прикладных экологических исследований, использующих половое производство кораллов для восстановления рифов.

Introduction

Дыхание является важнейшим биологическим показателем, который сигнализирует об общей метаболической активности организма, но, как и другие важнейшие черты (рост), его трудно измерить у мелкихорганизмов. Дыхание можно определить как окисление органических молекул с помощью кислорода. Этот процесс генерирует химическую энергию, необходимую для функционирования клеток (т.е. метаболизма), которая необходима для выживания организмов. С другой стороны, анаэробный метаболизм приводит к кислородному дефициту2. Частота дыхания может быть определена с помощью оптодов, которые измеряют использование (и, следовательно, снижение) концентрации кислорода с течением времени в закрытой камере, практика, обычно известная как респирометрия3. Учитывая, что большинство организмов не накапливают кислород, о скорости метаболизма можно судить по прямой корреляции между дыханием и использованием углерода. Из-за этого частота дыхания может быть преобразована в ежедневное потребление углерода, что информирует о критически важных метаболических функциях, таких как рост, размножение и способность поддерживать метаболический гомеостаз вовремя стресса окружающей среды, включая условия аномальной жары, которые обычно приводят к стрессу или обесцвечиванию кораллов.

Коралловые рифы сокращаются во всем мире ускоренными темпами. У кораллового животного есть консорциум партнеров (включая динофлагелляты Symbiodiniaceae, грибы, бактерии и вирусы), которые в совокупности называются «голобионтами»6. По мере повышения температуры океана кораллы и, следовательно, коралловые рифы находятся под растущим давлением, поскольку высокие температуры приводят к исчезновению динофлагеллятов Symbiodiniaceae (далее симбионтов), явление, известное как обесцвечивание. Многие питательные вещества недоступны для кораллов в олиготрофных тропических водах, в том числе неорганический азот и фосфор8. Чтобы справиться с этим, кораллы образуют облигатный питательный симбиоз со своими динофлагеллятными симбионтами (Symbiodiniaceae), которые обеспечивают большую часть питательных веществ, необходимых кораллу-хозяину для выживания и откладывания своих скелетов из карбоната кальция9. Функционирующий симбиоз может характеризоваться высоким уровнем распределения углерода между партнерами10,11, а регуляция симбиоза включает динамический гомеостаз12.

Во время теплового стресса эта динамическая регуляция и коммуникация нарушаются, что приводит к дисбактериозу и обесцвечиванию (рассмотрено в ссылке13). Таким образом, метаболические измерения, такие как фотосинтез и дыхание, обладают потенциалом для выяснения как здорового, так и нерегулируемого, дисбиотического состояния кораллов, и точное измерение этих процессов на протяжении всего онтогенеза имеет решающее значение для понимания функционирования организма. Это особенно важно по мере увеличения частоты и величины массовых обесцвечиваний, что может повлиять на изменения в обмене питательными веществами от симбионтов, где перенос углерода уменьшается помере повышения температуры. Это может быть связано с направленными механизмами секвестрации питательных веществ симбионтом или с жесткими физиологическими компромиссами (повышенная термопереносимость, но снижение выживаемости хозяина 15,16,17). Нарушения симбиоза могут быть связаны как с симбионтом, так и с хозяином, хотя ведущим фактором, вероятно, является клеточная неисправность симбионта18. Однако стресс, вызванный повышением температуры морской воды, дестабилизирует этот симбиоз; Обмен углерода от симбионта к хозяину уменьшается19,20, что может привести к голоданию кораллов. Это может отражаться в уменьшении запасов липидов и углеводов в кораллах из-за увеличения использования хозяином («повышенный катаболизм связанного углерода»), вероятно, из-за уменьшения совместного использования симбионтами11. Наряду с фотосинтезом и дыханием симбионтов кораллов, дыхание кораллового животного является важным показателем для понимания здоровья кораллов, последствий обесцвечивания и обмена питательными веществами между этими партнерами, а также роста голобионта, фенотипа, имеющего значение для выживания в условиях изменения окружающей среды 8,21,22. Наконец, учитывая, что многие кораллы являются симбиотическими, использование респирометрии для характеристики фотосинтеза в дополнение к дыханию особенно полезно для контекстуализации соотношения P:R и понимания того, является ли симбиоз стабильным или нет (например, ссылка23).

Таким образом, изменения окружающей среды вызывают сдвиги в энергетических балансах кораллов и их симбионтов, что приводит к различиям вросте. Чтобы справиться с этим, коралловый хозяин может увеличить дыхание и использование липидов, чтобы удовлетворить свои метаболические потребности; Тепловой стресс может снизить чистую производительность на 60% из-за этого увеличения дыхания14, измеряемого изменением растворенного кислорода. Symbiodiniaceae могут также увеличивать ассимиляцию азота и удержание углерода14,24, а затем использовать эти резервы для перераспределения энергии на свои собственные механизмы восстановления и защиты25,26. Баланс N и C важен для регуляции роста, и P в частности27, что может проявляться как динамическая регуляция численности симбионтов. Действительно, данные, собранные с кораллов на больших рифовых пространствах (>1000 км), свидетельствуют о том, что хозяева обладают способностью ограничивать рост симбионтов за счет регуляции P, хотя это варьируется в зависимостиот вида кораллов.

Взятые вместе, эти исследования предполагают повышение устойчивости к жаре с сопутствующим снижением либо выработки, либо транслокации питательных веществ (т.е. склонности к симбиозу) из-за изменений окружающей среды. Таким образом, для понимания фундаментальных механизмов, связанных с метаболизмом, а затем для решения вопросов сохранения, таких как определение устойчивости к жаре, следует использовать эффективные методы одиночного отбора, такие как количественная оценка использования кислорода с помощью микрореспирометрии. Он представлен здесь как инструмент микрореспирометрии для физиологических измерений, предназначенный для изучения пищевых взаимоотношений между молодью кораллов и их водорослевыми симбионтами, но подходящий для других мелких морских организмов.

Использование или выработка кислорода организмами можно измерить, поместив их в индивидуальные, герметично закрытые респирометрические камеры или «респирометры» (далее камеры), где изменение кислорода измеряется с помощью оптодов3. Оптоды — это зонды, которые измеряют концентрацию кислорода с помощью световых импульсов, а регистрация измерений с течением времени позволяет рассчитать скорость дыхания и/или фотосинтеза. На практике измерение дыхания похоже на измерение фотосинтеза у кораллов, за исключением того, что кораллы инкубируются в полной темноте. Вычитание общего суточного дыхания кораллов и симбионтов из общего суточного фотосинтеза дает дифференциал кислорода (дельта кислорода)2,3. Как правило, организмы потребляют больше кислорода, чем производят, что приводит к его дефициту. Это может быть преобразовано в углеродные эквиваленты, поскольку кислород и углерод потребляются в фиксированномсоотношении2. Избыток углерода может быть использован кораллом для роста, синтеза и размножения слизи, а также для других важных метаболическихпотребностей.

В этом протоколе описывается метод микродыхания (рис. 1), который использовался для измерения скорости дыхания (R) для отдельных молодых кораллов с использованием специально изготовленной стеклянной камеры объемом 1,5 мл (флакон с резьбой GL25 и высотой 20 мм, с бугорком/гребнем, плоским отшлифованным ободком и завинчивающейся крышкой с отверстием; см. таблицу материалов), заполненной отфильтрованной морской водой толщиной 0,5 мкм. Оптоволоконные оптоды (см. Таблицу материалов) вставлялись в каждую камеру через отверстие в боковой части крышки. Каждый отдельный коралл был прикреплен к твердой сетчатой проточной пластине мешалки над магнитным мешалкой, чтобы обеспечить надлежащее перемешивание воды в камере. В приведенном здесь репрезентативном примере две контрольные или «холостые» камеры (камеры, которые были идентичны, за исключением присутствия образца) измерялись одновременно с тремя реплицированными камерами для образцов, поскольку у нас было несколько контроллеров, работающих одновременно. Однако в примере настройки (рис. 2) показано использование только четырех каналов; Этот показатель можно увеличить с помощью нескольких контроллеров и нескольких проточных стоек. В этой системе также можно регулировать температуру, погружая каждую камеру в специально изготовленную водяную баню с заданной температурой воды (27 °C для контроля или 31 °C для высокого температурного стресса в приведенном здесь примере) с помощью системы с рециркуляционным потоком (непрерывный, щадящий поток, установленный на уровне 75 л/ч). Платформа мешалки и пластина мешалки с зубчатыми колесами могут быть любого размера и могут быть выполнены как большими, так и маленькими, насколько это необходимо для размещения количества стеклянных камер. В этом примере платформа и тарелка были примерно 34 см x 26 см x 3 см (Таблица материалов). Калибровка оптодов проводилась перед каждым запуском с использованием двух стандартных растворов, представляющих 0% и 100% насыщение кислородом при соответствующей температуре и солености воды для данной экспериментальной установки.

Protocol

1. Установка оборудования и кораллов в дыхательных камерах ПРИМЕЧАНИЕ: Репродуктивно готовые кораллы (т.е. те, у которых были розоватые пигментированные пучки яйцеклеток/сперматозоидов, видимые из фрагментированных веточек колоний вида Acropora tenuis ), были вытеснены с рифа на острове Магнетик (19° 6,249′ ю. ш.; 146° 51,728′ в. д.) в день полнолуния в октябре 2018 г. (номер разрешения: G12/35236.1), собраны и доставлены в лабораторию для нереста кораллов. где разводили и выращивали молодые кораллы. В день измерений соедините две пластины водяной бани с помощью синей политрубки и соединителей (см. Таблицу материалов; Рисунок 1 [5], рисунок 2А,Б). Они будут служить инкубаторами после соединения с синей политрубой к водонагревателю/чиллеру. Убедитесь, что пластина двигателя хорошо видна через прозрачные пластины водяной бани, когда респирометрические камеры не установлены. Подсоедините два шланга к водонагревателю/чиллеру (см. Таблицу материалов). Включите водонагреватель/чиллер, а затем установите желаемую экспериментальную температуру (27 °C или 31 °C). Подсоедините основание водяной бани (шаг 1.1) к опорной пластине двигателя с помощью магнитных шестерен (Рисунок 1 [6, 7] и Рисунок 3A), а затем подключите этот узел к источнику питания (Рисунок 3B). Включите источник питания, чтобы активировать шестерни, которые активируют мешалки в камерах. Модулируйте поток воды по мере необходимости (например, непрерывный, щадящий расход 75 л/ч с медленным перемешиванием при 30 об/мин) с помощью ручек разъема клапана (Рисунок 3C). Чтобы собрать респирометрическую камеру, добавьте магнитный шарик (Рисунок 1 [1.5]) в стеклянную камеру (Рисунок 1 [1.6]), а затем непрозрачное пластиковое проточное основание стойки (Рисунок 1 [1.4]) в стеклянную камеру (Рисунок 4A). Размер камеры и магнитного шарика будет зависеть от интересующего организма и исследуемой системы.ПРИМЕЧАНИЕ: В пластиковом основании есть отверстия для потока и циркуляции воды от движения магнитного шарика в нижней части. Приклейте коралл с помощью аквариумного клея (см. Таблицу материалов) к черной стяжке-молнии, помещенной в пластиковую основу (Рисунок 4B-D). Для этого сначала приклейте ювенильный коралл к кусочку черного пластика, а затем приклейте этот кусочек к пластиковой основе. После того, как коралл надежно закреплен (отверждение клея происходит почти мгновенно), закрутите крышку с уплотнительным кольцом (Рисунок 4A) на стеклянную камеру. Выполняйте эти действия под водой в отдельном бассейне, чтобы убедиться, что в респирометрической камере нет воздуха.ПРИМЕЧАНИЕ: Объем воды в респирометре (т.е. эффективный объем = 1,5 мл) определялся путем полного погружения камеры под воду. Предполагается, что по отношению к объему воды смещение массы/плотности очень маленького коралла пренебрежимо мало. Пробирка с микроцентрифугой объемом 1,5 мл показана здесь для масштабирования (Рисунок 4A). Плотно поместите камеры в водяную баню (Рисунок 5А). Убедитесь, что стеклянные камеры находятся в контакте с водой с регулируемой температурой для эксперимента. Подсоедините оптоволоконные кабели O2 (см. Таблицу материалов) так, чтобы они соприкасались с точками датчика кислорода (далее именуемыми пятнами; см. Таблицу материалов), вставив их в отверстие, просверленное в боковой части камер крышки. Эти небольшие пятна чувствительны к кислороду и обнаруживают и передают сигнал изнутри камеры по оптоволоконному кабелю.Добавьте сантехническую ленту (белую тонкую самоуплотняющуюся ленту), чтобы кабель плотно прилегал и оставался прочно внутри водяной камеры. Убедитесь, что отдельные кораллы видны (как показано на рисунке 5B) с коричневыми щупальцами, направленными вверх, внутри камеры (рисунок 5B, видео 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Смета стоимости компонентов аппарата приведена в таблице 1. 2. Стандартная операционная процедура измерения дыхания с помощью системыØ2 Откройте программное обеспечение для измерения кислорода (см. Таблицу материалов). Измерьте температуру помещения, где будет производиться калибровка. Это понадобится позже на этапе калибровки (шаг 2.8). Соберите оптические датчики и крышки. Для этого подключите все оптоволоконные кабели к согласующему порту в модулеØ2 . Убедитесь, что колпачок 1 совпадает с датчиком 1, колпачок 2 с датчиком 2 и т. д. Чтобы настроить камеры для калибровки, сначала смочите кусочек чистой губки небольшим количеством воды обратного осмоса (RO) и вставьте его в каждую камеру.ПРИМЕЧАНИЕ: Губка не должна капать, только быть влажной. Он может капать на оптоволоконное пятно. Убедитесь, что пятно не мокрое, прежде чем переходить к следующему шагу. Поместите камеры вверх дном с помощью соответствующего оптоволокна (Рисунок 6). Это позволит открутить камеру, не касаясь оптоволокна и добавить сульфит натрия для 0%-ной калибровки. Проверьте сигнал каждого датчика перед началом калибровки. Пройдитесь по всем вкладкам в интерфейсе программного обеспечения и проверьте значение сигнала (верхний левый угол) (рисунок 7A), убедившись, что они существенно не меняются. Допустимые значения для экспериментальной установки (в зависимости от организма и интересующих условий) сверяются с инструкцией по эксплуатации O2 . Для этой конкретной установки при комнатной температуре 25,3 °C приемлем FTC (точечный поток датчика кислорода через нормальный диапазон ячейки) 20,59 с сигналом 179,5. Откройте «Программа » и проверьте настройки в программном обеспечении, чтобы убедиться в их правильности, как описано ниже. Если всплывающее окно не появляется сразу после открытия программы, это можно сделать, нажав кнопку «Настройки » в левом нижнем углу интерфейса программы. Убедитесь, что внешний датчик температуры активирован (Рисунок 7B). Измените настройку на Фиксированная температура (Fixed temperature) (Фиксированная температура ) (Рисунок 7C). Затем добавьте значение комнатной температуры и нажмите кнопку копировать настройку для всех остальных каналов. Измените настройку на Уменьшить дрейф сигнала (Reduce Signal Drift) (Уменьшить дрейф сигнала) (Reduce Signal Drift) (Уменьшить дрейф сигнала) (Reduce Signal Drift) Затем выберите «Настройки датчика» и выберите уровень 2. В противном случае, при использовании небольших объемов, дрейф будет настолько велик, что калибровку будет сложно выполнить. Проверьте общие настройки каналов. Нажмите OK , если это необходимо. Нажмите кнопку Копировать настройки для всех каналов, а затем нажмите кнопку ОК. Откалибруйте датчики. Для калибровки канала 1 перейдите на вкладку Канал 1 и нажмите кнопку Калибровка . Выберите 2 точки в воде или влажном воздухе. Для калибровки «воздуха» опустите кусок пены в воду, поместите его внутрь камеры и подождите, пока сигнал стабилизируется (см. изображения до и после калибровки воздуха). Когда стабилизируется, нажмите «set air». Нажмите air > Калибровать > задавать воздух. Установите калибровку 0% и 100% (Рисунок 7D). Снимите камеру с крышки и поместите ее в следующую крышку, чтобы сигнал калибровки воздуха был готов к завершению калибровки 0% в первом датчике. Используйте трансферную пипетку и наполните колпачок 2%-ным сульфитом натрия. Дождитесь стабилизации сигнала.ПРИМЕЧАНИЕ: Для стабилизации сигнала обычно требуется больше времени по сравнению с калибровкой воздуха. Если появляется предупреждающее сообщение о том, что «значения выходят за пределы типичного диапазона», убедитесь, что сульфит натрия свежий. Повторите тот же процесс калибровки для всех каналов. Приготовьте сульфит натрия, добавив 2 г в 100 мл воды обратного осмоса. После завершения калибровки хорошо промойте дыхательные камеры и высушите камеры и колпачки. Убедитесь, что в оптоволоконном отверстии нет воды. Поместите организм (в данном примере молодь одиночных кораллов) в дыхательные камеры и закройте крышками. При размещении крышек обязательно делайте это, когда камеры полностью погружены в воду и внутри нет абсолютно никакого воздуха. Плотно поместите камеры в мешалку и подсоедините оптоволоконные кабели. Включите источник питания. Убедитесь, что вода внутри камер полностью перемешалась. Установите температуру в чиллере/нагревателе на выбранные экспериментальные температуры. Включите насос и нагреватель (шаги 1.2 и 1.4). Нажмите кнопку log на интерфейсе измерительного программного обеспечения O2 , чтобы начать запись.

Representative Results

Обработка и анализ данныхНесмотря на то, что существует множество методов обработки исходных данных респирометрических экспериментов, рекомендуется использовать пакет R respR28. В соответствии с предыдущими протоколами, которые выступают за открытую науку и воспроизводимость, этот пакет позволяет обмениваться данными и анализом в легко воспроизводимой форме и был разработан с учетом этого. Это бесплатная платформа с открытым исходным кодом и не зависящая от системы зондирования, и ее легко установить как с CRAN, так и с GitHub. Полный код и примеры для respR поддерживаются и могут быть найдены на https://github.com/januarharianto/respR. Пакет respR имеет функции для импорта, визуализации и контроля качества данных респирометрии, а также для расчета частоты дыхания как автоматически, так и из выбранных вручную областей. Он также может корректировать показатели фонового дыхания и коэффициенты преобразования в часто используемые выходные единицы. Этапы обработки данных системы микрореспирометрии подробно описаны ниже. В данном исследовании в качестве примера использовались данные респирометрической системы, но пакет также принимает входные данные от большинства коммерчески доступных систем кислородных зондов, а также от общих объектов данных R. Более подробную информацию о пакете, включая полную документацию и учебные пособия, можно найти на веб-сайте пакета по адресу https://januarharianto.github.io/respR/index.html. Импорт необработанных данныхИмпортируется необработанный выходной файл (.txt). respR распознает формат и преобразует его в универсальный фрейм данных R, который можно использовать в последующих функциях. Однако важно отметить, что это необязательно; Эти файлы и практически любые данные временных рядов кислорода также могут быть импортированы с помощью базовых функций (приведенных ниже) любым, кто имеет базовые знания R. #load respRБиблиотека(respR) #Import —Данные <- import_file("file.txt")Обнаружен файл #Firesting-Pryo Проверка и визуализация данныхВажнейшей частью любой задачи по анализу данных является построение графиков и проверка данных для поиска очевидных аномалий или закономерностей или даже просто для того, чтобы помочь понять их. Здесь используется функция inspect (рис. 8A), которая проверяет наличие проблем, характерных для данных респирометрии, таких как нечисловые или отсутствующие значения. #inspect одной кислородной колонкиInsp <-inspect(data, time = 3, oxygen = 8, width = 0.2) Эта функция также строит графики временных рядов кислорода и вычисляет скорость вращения (нижняя панель), чтобы помочь понять, как эта скорость может меняться в ходе эксперимента. Эти скользящие графики скорости помогают понять, какие области этих кривых скорости должны быть извлечены. В случае стандартной или рутинной скорости метаболизма, желательными областями являются те, где скорость показывает стабильность (например, примерно после момента 3000; Рисунок 8Б). Здесь снижение уровня кислорода становится заметным только после примерно 200-го ряда на панели полного временного ряда. Подобные паттерны очень распространены в данных респирометрии; В начале эксперимента часто наблюдается длительный период нестабильности, поскольку система стабилизируется и образец акклиматизируется к условиям эксперимента. Рекомендуется, чтобы показатели извлекались из временных рядов только после этой начальной нестабильности, что также подчеркивает важность визуализаций. Расценки на экстрактrespR имеет две функции для определения частоты дыхания. Во-первых, это функция calc_rate(), которая позволяет извлекать скорость вручную, указывая область времени, строку или уровень кислорода. Это очень распространенное явление в респирометрических анализах и является вполне приемлемым методом определения частоты до тех пор, пока критерии отбора определены и применяются последовательно. Более надежным и объективным способом является использование функции auto_rate(), которая определяет линейные области данных. Эти области имеют стабильно устойчивую частоту дыхания, назначаемую автоматически с помощью машинного обучения. Эта функция также полезна для обнаружения слабых сигналов (как в образцах, использованных в данном исследовании, из-за низкой биомассы в этом возрасте). Эта функция позволяет идентифицировать наиболее линейные, минимальные и максимальные показатели с помощью независимых, объективных и статистически надежных методов28. В приведенном ниже примере определена линейная область, происходящая примерно в точках времени от 3 000 до 5 000. Следует отметить, что может быть идентифицировано несколько линейных областей, но этот участок является наиболее ранжированным или наиболее линейным регионом (рис. 8C). #Determine наиболее линейной (т.е. постоянной) скоростиСтавка <-auto_rate (INSP) Настройка фонаФоновые коэффициенты контрольных экспериментов могут быть определены аналогично приведенному выше примеру и могут быть использованы для корректировки скорости образцов с помощью функции adjust_rate() (рис. 9A; обратите внимание, что здесь не показан полный анализ, а только корректировка). Полные примеры подробно описаны на сайте respR . #Adjust ставка для фонаrate_adj <-adjust_rate(rate, by = bg) #saved bg объектпечать(rate_adj) Конвертация курсовЗаключительным этапом является преобразование скоростей в желаемые выходные единицы, используя исходные единицы исходных данных, эффективный объем респирометра и другие экспериментальные данные, включая нормализацию к холостым измерениям (рис. 9B). На выходе может быть абсолютная частота дыхания, т.е. всего образца, или удельная скорость по массе или площади поверхности. В данном случае была использована выходная скорость по отношению к площади поверхности, которая представляет собой абсолютную скорость, деленную на площадь поверхности образца (рис. 9C). Как уже говорилось выше, эта система была разработана для измерения очень маленьких образцов. Поэтому мы ожидали низких значений и потенциального перекрытия с холостыми измерениями. Ожидается, что в болванках ожидается некоторый уровень сигнала, и при исследовании эти значения находятся в пределах ожидаемого диапазона общего экспериментального шума, возможно, из-за дрейфа зонда, незначительных изменений температуры или пузырьков на зондах. Из-за конструкции и из-за небольшого размера образца и, следовательно, малого используемого эффективного объема, использование заготовок здесь особенно важно, особенно для каждого прогона. В качестве примера приведены репрезентативные значения (рис. 10). Учитывая небольшой размер образца, мы рекомендуем использовать заготовки при каждом прогоне, чтобы стандартизировать измерения за один прогон. Эти пустые значения затем используются для стандартизации значений измерений лечения. Учитывая, что кораллы дышат не только кислородом, но и вырабатывают кислород, скорость метаболизма может варьироваться от отрицательных до положительных значений. Здесь приведен пример репрезентативных результатов диапазона значений дыхания, обнаруженных с помощью прибора для микродыхания. Эти результаты были получены в результате успешного эксперимента на одиночных молодых кораллах (рис. 10). В целом, ожидалось, что дыхание будет трудно обнаружить в этом примере набора данных (по замыслу), учитывая небольшой размер выборок; Это подчеркивает ценность этого метода для захвата этого низкого порога сигнала. Эти репрезентативные результаты показывают дыхание в темноте при самых маленьких размерах протестированных образцов, что подчеркивает минимальный порог обнаружения этой системы. Мы также проводили измерения в двух условиях (контрольное и высокотемпературное напряжение). После стандартизации заготовок, измеренных за один прогон, значения варьировались от близкого к нулю (контроль) до медианы ~-5e-5 для обработки напряжения. Как и ожидалось, дыхание было низким. Эти результаты ясно показывают репрезентативные значения для заготовок, а также сравнение контрольных и высокотемпературных образцов для этих очень маленьких образцов. Рисунок 1: Схематическое изображение нового микрореспирометрического инструмента для физиологической характеристики кораллового голобионта (коралловое животное + симбионты) или любого мелкого организма (<1 мм). Изготовлены спирометрические камеры на заказ (No 1; 1,1-1,6). К ним относятся крышки (1.1) с точками для датчиков кислорода (1.2), а отдельные ювенильные (1.3) помещаются на проточную подставку (1.4), установленную на магнитной мешалке (1.5), все они помещаются в стеклянную камеру (1.6). Контроллер (2) крепится к точке оптоволоконным кабелем, который вставляется в крышку (1) и подключается к компьютеру (3). Нагреватель/чиллер (4) соединяется с респирометрической пластиной (5) с проточной водой (указано стрелками шеврона), которая находится в верхней части пластины мешалки (6) с шестернями (7), приводимой в действие двигателем (8) и источником питания (9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Установка микрореспирометрии. Доступно несколько вариантов, в том числе (A) одна респирометрическая пластина или (B) подключенная к нескольким пластинам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Иллюстрация 3: Изготовленная на заказ магнитная мешалка поверх респирометрической пластины. Каждая камера имеет (A) магнитную мешалку внизу, (B) приводимую в действие двигателем, а (C) респирометрическую пластину, соединенную трубкой с нагревателем/чиллером. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Иллюстрация 4: Индивидуальная настройка респирометрической камеры. (A) Компоненты (слева направо: крышка, стеклянный флакон, подставка, пробирка 1,5 мл для весов и мешалка). (B) Индивидуальная проточная стойка, внутри которой находится образец. (C) Вид сверху вниз на проточную стойку. (D) и с подставкой, помещенной внутрь стеклянного флакона с завинчивающейся крышкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Иллюстрация 5: Стеклянные флаконы, помещенные в пластину мешалки. (A) Изготовленная на заказ пластина мешалки с (B) крупным планом стеклянного флакона в сборе с установкой крышки. Молодой коралл можно увидеть через крышку (коричневая точка), поверх застежки-молнии, с оптиком, помещенным в отверстие крышки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Камеры, расположенные вверх дном, готовые к калибровке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 7: Основные шаги в программном обеспечении для измерения кислорода. (A) Проверьте сигнал каждого датчика. Оптимальный сигнал для данного исследования и датчиков показан в пятне лямбда-зонда FTC (нормальный диапазон). (B) Проверьте дрейф сигнала. (C) Установите и проверьте температуру обработки. (D) Установите и проверьте калибровки 0% и 100%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 8: Выходные шаги анализа respR I. (A) Проверьте команду и выходные данные. (B) Проверьте стабильность курса. (C) Определите наиболее линейную скорость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 9: Выходные шаги анализа respR II. (A) Настройте скорость для фона, (B) Конвертируйте и (C) проверьте курсы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 10: Репрезентативные результаты, полученные с помощью прибора микрореспирометрии. Медианное дыхание (O2 ± стандартная ошибка) отдельных молодых кораллов, включая пустые значения, а также дыхание особей, находящихся под контролем и в условиях высокого температурного стресса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Видео 1: Вид сверху вниз на респирометрическую камеру с ювенильным кораллом внутри во время сеанса измерения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео. Таблица 1: Смета затрат на составные части респирометрического аппарата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Discussion

В этой работе описывается создание специально разработанной микрореспирометрической установки, которая может быть использована для количественной оценки количества кислорода, потребляемого и производимого мелкими сидячими водными организмами. Важнейшими компонентами этого протокола являются настройка камер, в том числе точечных, и калибровка низкого сигнала с помощью пакета respR , в котором низкий сигнал может быть определен как скорость, характерная для пологих или зашумленных склонов. Специальная камера и ее настройка позволяют обнаруживать даже слабые сигналы, в то время как использование пакета R помогает защититься от проблем, при которых возникновение пологих или шумных склонов может привести к неправильной интерпретации результатов (например, ложные срабатывания).

Потенциальные модификации, которые потребуются для других пользователей, включают в себя закрепление интересующего организма в специально изготовленной камере. В этом случае была использована маленькая жесткая стяжка-молния и аквариумный клей, чтобы закрепить единственную молодь на пластиковой основе, которая затем была приклеена к галстуку. Следует отметить, что для этого эксперимента молодь кораллов была размещена на черной пластиковой пленке. Этот пластик позволял легко удалять молодь кораллов, которые эффективно соскальзывали с пластика, чтобы не причинить им физического вреда во время удаления. Молодые кораллы прикрепляются к субстрату, на котором они оседают, поэтому рекомендуется поселить их на аналогичном пластиковом материале, используя искусственный пептид16 для облегчения их удаления для процесса склеивания. Чтобы еще больше свести к минимуму стресс при обращении и влияние на реакцию дыхания, рекомендуется дать кораллам, прикрепленным к застежкам-молниям, акклиматизироваться в течение 1-2 недель, как это обычно бывает во многих экспериментах со стрессом для взрослых кораллов. Могут потребоваться и другие модификации, чтобы закрепить организм над пятном в крышке и обеспечить циркуляцию воды. Еще один ключевой этап поиска и устранения неисправностей связан с обнаружением сигнала, в частности, на наклоне временного ряда кислорода, где должны быть определены скорости. В конечном счете, это сводится к комбинации использования здравого смысла для исключения заведомо нестабильных данных и функций в respR , позволяющих извлекать скорости либо из последовательно выбранных областей, либо автоматически путем определения линейных областей данных. Другие примеры того, как это сделать, доступны на веб-сайте respR .

Этот метод был разработан для того, чтобы распространить измерения нижней границы дыхания на чрезвычайно мелких сидячих морских беспозвоночных. Очевидным ограничением является то, что этот протокол может быть более подвержен ложным срабатываниям по сравнению с протоколами, разработанными для большей биомассы. Однако, учитывая, что именно в этом и заключалась цель проектирования — измерить эти нижние пределы, — это было учтено в проекте, и процедура может быть использована с пакетом respR для лучшей защиты от ложных срабатываний. Важно также признать, что существуют и другие системы для измерения дыхания30 и измерения мелких организмов, включая респирометрию на отдельных веслоногих рачках31 в меньших объемах, чем этот (~0,5-1 мл), но они либо дороги, либо не имеют специфических компонентов (способность перемешивать). Тем не менее, эта система имеет открытый исходный код и относительно недорогую по сравнению с коммерческими системами (например, система Core Microplate). Эта система также включает в себя ключевые методологические соображения, такие как перемешивание, которые могут отсутствовать в других системах. Функция внутреннего перемешивания необходима для воспроизведения естественного смешивания воды многими морскими организмами (например, веслоногими рачками при плавании), что часто невозможно и может сделать данные в значительной степени непригодными для использования. В отличие от этого, другие доступные методы смешивания включают в себя размещение всего респирометра на гигантском коромысле, что требует дополнительного оборудования и имеет ограниченный успех в смешивании, или смешивание с помощью вибрации, которая может вызвать нарушение в организме. По этой причине это единственная система, которая может выполнять респирометрию на молодых кораллах или других очень маленьких сидячих организмах. Для справки, диапазон размеров образцов, включенных в этот список, варьировался от 2,1 до 3,6 полипов (что соответствует возрасту всего нескольких месяцев), со средней площадью от 1,3 до 4,5мм2.

Респирометрия является фундаментальной мерой в экологических исследованиях, и для этой цели существует множество методов. Однако большинство из этих существующих методов нацелены на образцы с высокой биомассой, включая целую рыбу, фрагменты кораллов или морские водоросли 32,33,34. Этот метод является первым, в котором используются отдельные молодые кораллы. Кроме того, существует множество потенциальных применений этого метода, поскольку он предоставляет ключевую физиологическую информацию о функционировании организма. Это может быть важно для исследований, стремящихся охарактеризовать исходные оценки состояния здоровья35, понять роль острого или длительного стресса во время онтогенеза кораллов, такого как тепловой стресс36, или определить пороговые значения, которые менеджеры могут установить для защиты и улучшения здоровья коралловых рифов37. Учитывая, что коралл является голобионтом, а сообщество симбионтов является относительно гибким на этой стадии и в течение первого года жизни, было бы интересно сопоставить данные респирометрии с изменениями в сообществах с течением времени, чтобы полностью контекстуализировать функционирование организма в целом. Важно отметить, что этот метод вносит свой вклад в методы «открытой науки», которые помогают создать схему для создания пользовательских экспериментальных установок, которыми можно делиться, улучшать и стандартизировать открыто.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Сэма Нунана за помощь и советы, Свена Утика за использование начальных респирометрических камер, Бена Шелаба за инженерную иллюстрацию и мастерскую Австралийского института морских наук за индивидуальную обработку адаптеров и держателей респирометрических камер. Кораллы были собраны в соответствии со следующим разрешением Морского парка Большого Барьерного рифа в соответствии с AIMS G12/ 35236.1. Кораллы не требуют этических разрешений.

Materials

         Cost
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers  LabGlass Party Ldt. 1.5 ml $407.26
1.1 lids AIMS workshop Vial GL25 thread ~$10
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes) PyroScience Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947 $41.25 AUD each
1.3 individual organism  NA NA NA
1.4 flow-through stand  AIMS workshop Custom included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through
1.5 magnetic stirrer  Any manufactuer is suitable NA ~$2?
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD) Labglass Pty Ltd, Stafford QLD Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole $50.9 AUD
2 FireSting controller (2)  PyroSciences NA 4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here.
3 computer  NA NA NA
4 heater/chiller  VWR International NA Small models around $4,000 AUD
5 respirometry plate platform AIMS workshop 34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers)  $1250 AUD
6 stirrer plate with gears (7) AIMS workshop 34 cm x 26 cm x 3 cm  $1250 AUD
8 powered by the motor  AIMS workshop Custom $700 AUD
9 power supply Non-specific NA ~$300 AUD
Aquarium glue Seachem reef glue 20g $14
Oxygen Logger Software PyroScience  NA NA
Polypipe and connectors John Guest NA $20
Sodium Sulfite Sigma S0505-250G (CAS number 7757-83-7) $54
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Quigley, K. M. A fast, precise, in-vivo method for micron-level 3D models of corals using dental scanners. Methods in Ecology and Evolution. 13 (10), 2159-2166 (2022).
  2. Svendsen, M. B. S., Bushnell, P. G., Steffensen, J. F. Design and setup of intermittent-flow respirometry system for aquatic organisms. Journal of Fish Biology. 88 (1), 26-50 (2016).
  3. Lighton, J. R. B. . Measuring Metabolic Rates: a Manual for Scientists. , (2018).
  4. Carey, N., Harianto, J., Byrne, M. Sea urchins in a high-CO2 world: partitioned effects of body size, ocean warming and acidification on metabolic rate. The Journal of Experimental Biology. 219 (Pt 8), 1178-1186 (2016).
  5. Clark, T. D., Sandblom, E., Jutfelt, F. Aerobic scope measurements of fishes in an era of climate change: respirometry, relevance and recommendations. The Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 15), 2771-2782 (2013).
  6. Voolstra, C. R., et al. Extending the natural adaptive capacity of coral holobionts. Nature Reviews Earth & Environment. 2 (11), 747-762 (2021).
  7. Hoegh-Guldberg, O. Climate change, coral bleaching and the future of the world’s coral reefs. Marine and Freshwater Research. 50 (8), 839-866 (1999).
  8. Morris, L. A., Voolstra, C. R., Quigley, K. M., Bourne, D. G., Bay, L. K. Nutrient availability and metabolism affect the stability of coral-symbiodiniaceae symbioses. Trends in Microbiology. 27 (8), 678-689 (2019).
  9. Yellowlees, D., Rees, T. A. V., Leggat, W. Metabolic interactions between algal symbionts and invertebrate hosts. Plant, Cell & Environment. 31 (5), 679-694 (2008).
  10. Rädecker, N., et al. Using Aiptasia as a model to study metabolic interactions in cnidarian-Symbiodinium symbioses. Frontiers in Physiology. 9, 214 (2018).
  11. Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (50), 13194-13199 (2017).
  12. Davy, S. K., Allemand, D., Weis, V. M. Cell biology of cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 229-261 (2012).
  13. Weis, V. M. Cellular mechanisms of Cnidarian bleaching: stress causes the collapse of symbiosis. The Journal of Experimental Biology. 211 (Pt 19), 3059-3066 (2008).
  14. Baker, D. M., Freeman, C. J., Wong, J. C. Y., Fogel, M. L., Knowlton, N. Climate change promotes parasitism in a coral symbiosis. The ISME Journal. 12 (3), 921-930 (2018).
  15. Chakravarti, L. J., van Oppen, M. J. H. Experimental evolution in coral photosymbionts as a tool to increase thermal tolerance. Frontiers in Marine Science. 5, 227 (2018).
  16. Quigley, K. M., Alvarez Roa, C., Beltran, V. H., Leggat, B., Willis, B. L. Experimental evolution of the coral algal endosymbiont, Cladocopium goreaui: lessons learnt across a decade of stress experiments to enhance coral heat tolerance. Restoration Ecology. 29 (3), e13342 (2021).
  17. Buerger, P., et al. Heat-evolved microalgal symbionts increase coral bleaching tolerance. Science Advances. 6 (20), eaba2498 (2020).
  18. Bieri, T., Onishi, M., Xiang, T., Grossman, A. R., Pringle, J. R. Relative contributions of various cellular mechanisms to loss of algae during cnidarian bleaching. PLoS One. 11 (4), e0152693 (2016).
  19. Tremblay, P., Gori, A., Maguer, J. F., Hoogenboom, M., Ferrier-Pagès, C. Heterotrophy promotes the re-establishment of photosynthate translocation in a symbiotic coral after heat stress. Scientific Reports. 6, 38112 (2016).
  20. Tremblay, P., Grover, R., Maguer, J. F., Hoogenboom, M., Ferrier-Pagès, C. Carbon translocation from symbiont to host depends on irradiance and food availability in the tropical coral Stylophora pistillata. Coral Reefs. 33 (1), 1-13 (2014).
  21. Wooldridge, S. A. Is the coral-algae symbiosis really ‘mutually beneficial’ for the partners. Bioessays. 32 (7), 615-625 (2010).
  22. Wooldridge, S. A. Breakdown of the coral-algae symbiosis: towards formalising a linkage between warm-water bleaching thresholds and the growth rate of the intracellular zooxanthellae. Biogeosciences. 10 (3), 1647-1658 (2013).
  23. Coles, S. L., Jokiel, P. L. Effects of temperature on photosynthesis and respiration in hermatypic corals. Marine Biology. 43, 209-216 (1977).
  24. Marubini, F., Davies, P. S. Nitrate increases zooxanthellae population density and reduces skeletogenesis in corals. Marine Biology. 127, 319-328 (1996).
  25. Iglesias-Prieto, R., Matta, J. L., Robins, W. A., Trench, R. K. Photosynthetic response to elevated temperature in the symbiotic dinoflagellate Symbiodinium microadriaticum in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10302-10305 (1992).
  26. Karako-Lampert, S., Katcoff, D. J., Achituv, Y., Dubinsky, Z., Stambler, N. Responses of Symbiodinium microadriaticum clade B to different environmental conditions. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 318 (1), 11-20 (2005).
  27. Blanckaert, A. C. A., Reef, R., Pandolfi, J. M., Lovelock, C. E. Variation in the elemental stoichiometry of the coral-zooxanthellae symbiosis. Coral Reefs. 39, 1071-1079 (2020).
  28. Harianto, J., Carey, N., Byrne, M. respR-An R package for the manipulation and analysis of respirometry data. Methods in Ecology and Evolution. 10 (6), 912-920 (2019).
  29. Gamble, S., Carton, A. G., Pirozzi, I. Open-top static respirometry is a reliable method to determine the routine metabolic rate of barramundi. Lates calcarifer. Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 47 (1), 19-28 (2014).
  30. Burford, B. P., et al. Rapid range expansion of a marine ectotherm reveals the demographic and ecological consequences of short-term variability in seawater temperature and dissolved oxygen. The American Naturalist. 199 (4), 523-550 (2022).
  31. Morozov, S., McCairns, R. J. S., Merilä, J. FishResp: R package and GUI application for analysis of aquatic respirometry data. Conservation Physiology. 7 (1), coz003 (2019).
  32. Leclercq, N., Gattuso, J. -. P., Jaubert, J. Primary production, respiration, and calcification of a coral reef mesocosm under increased CO2 partial pressure. Limnology and Oceanography. 47 (2), 558-564 (2002).
  33. Anthony, K. R. N., Hoegh-Guldberg, O. Variation in coral photosynthesis, respiration and growth characteristics in contrasting light microhabitats: an analogue to plants in forest gaps and understoreys. Functional Ecology. 17, 246-259 (2003).
  34. Moulin, L., et al. Long-term mesocosms study of the effects of ocean acidification on growth and physiology of the sea urchin Echinometra mathaei. Marine Environmental Research. 103, 103-114 (2015).
  35. Quigley, K. M., Bay, L. K., van Oppen, M. J. H. Genome-wide SNP analysis reveals an increase in adaptive genetic variation through selective breeding of coral. Molecular Ecology. 29 (12), 2176-2188 (2020).
  36. Brunner, C. A., Ricardo, G. F., Uthicke, S., Negri, A. P., Hoogenboom, M. O. Effects of climate change and light limitation on coral recruits. Marine Ecology Progress Series. 690, 65-82 (2022).
  37. Quigley, K. M., Alvarez Roa, C., Torda, G., Bourne, D., Willis, B. L. Co-dynamics of Symbiodiniaceae and bacterial populations during the first year of symbiosis with Acropora tenuis juveniles. MicrobiologyOpen. 9 (2), e959 (2020).
  38. Quigley, K. M., Bay, L. K., Torda, G., Willis, B. L. Leveraging new knowledge of Symbiodinium community regulation in corals for conservation and reef restoration. Marine Ecology Progress Series, 600. , 245-253 (2018).

Tags

Coral HolobiontMicro-respirometryMetabolic ActivitySymbiosisSymbiodiniaceaeRespirometry ChamberOxygen Fiber Optic CablesOxygen Sensor SpotsRespiration MeasurementRespR Package

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Quigley, K., Carey, N., Alvarez Roa, C. Physiological Characterization of the Coral Holobiont Using a New Micro-Respirometry Tool. J. Vis. Exp. (194), e64812, doi:10.3791/64812 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image