Nicht-wässrige Isolierung und Anreicherung von glandulären, gestielten und sitzenden Trichomen aus Cannabis sativa
Summary
Es wird ein Protokoll für die bequeme Isolierung und Anreicherung von Drüsen-, Kopfstiel- und sitzenden Trichomen aus Cannabis sativa vorgestellt. Das Protokoll basiert auf einer trockenen, nicht pufferartigen Extraktion von Trichomen, bei der nur flüssiger Stickstoff, Trockeneis und Nylonsiebe verwendet werden, und eignet sich für die RNA-Extraktion und transkriptomische Analyse.
Abstract
In diesem Artikel wird ein Protokoll für die bequeme Isolierung und Anreicherung von gestielten und sitzenden Trichomen aus Cannabis sativa vorgestellt. Die Biosynthesewege für den Cannabinoid- und flüchtigen Terpenstoffwechsel sind hauptsächlich in den Cannabis-Trichomen lokalisiert, und isolierte Trichome sind für die Transkriptomanalyse von Vorteil. Die bestehenden Protokolle zur Isolierung von Drüsentrichomen für die transkriptomische Charakterisierung sind unpraktisch und liefern kompromittierte Trichomköpfe und eine relativ geringe Menge an isolierten Trichomen. Darüber hinaus sind sie auf teure Apparaturen und Isolationsmedien angewiesen, die Proteininhibitoren enthalten, um den RNA-Abbau zu vermeiden. Das vorliegende Protokoll schlägt vor, drei einzelne Modifikationen zu kombinieren, um eine große Menge an isolierten Drüsen-, Kopf-, Stiel- und sitzenden Trichomen aus reifen weiblichen Blütenständen bzw. Fächerblättern von C. sativa zu erhalten. Die erste Modifikation besteht darin, das herkömmliche Isolationsmedium durch flüssigen Stickstoff zu ersetzen, um den Durchgang der Trichome durch die Mikrosiebe zu erleichtern. Die zweite Modifikation beinhaltet die Verwendung von Trockeneis, um die Trichome von der Pflanzenquelle zu lösen. Bei der dritten Modifikation wird das Pflanzenmaterial nacheinander durch fünf Mikrosiebe mit abnehmender Porengröße geleitet. Die mikroskopische Bildgebung zeigte die Wirksamkeit der Isolationstechnik für beide Trichomtypen. Darüber hinaus war die Qualität der RNA, die aus den isolierten Trichomen extrahiert wurde, für die nachgelagerte transkriptomische Analyse geeignet.
Introduction
Drüsen-Trichome sind haarähnliche Strukturen, die in Pflanzen vorkommen und viele sekundäre Metabolitenenthalten 1 und eine wertvolle Bank neuer biosynthetischer Gene und Enzymedarstellen 2. Bei Cannabis ist die Biosynthese der wichtigen Sekundärmetaboliten, Cannabinoide3 und Terpene4, in den Trichomen lokalisiert. In Anbetracht der Rolle der Trichome bei der Bestimmung der Qualität von Cannabis sowohl für medizinische als auch für Freizeitzwecke ist die Untersuchung der Trichom-Genexpression von Interesse. Um die Expression von trichomspezifischen Genen zu charakterisieren, müssen zunächst die interessierenden Trichome isoliert werden. Trichom-Isolationsprotokolle wurden erstmals 1992 beschrieben5, und ihre neuesten Entwicklungen wurden kürzlich überprüft2. Im Allgemeinen können Protokolle zur Extraktion von Drüsentrichomen zur transkriptomischen Charakterisierung in zwei verschiedene aufeinanderfolgende Schritte unterteilt werden. Der erste Schritt beinhaltet eine gründliche physikalische Trennung der Trichome vom Pflanzengewebe. Dieser Schritt kann durch die Verwendung von Trockeneis5, Glasperlen mit einer handelsüblichen Vorrichtung6,7, das Mahlen des Pflanzenmaterials gegen ein Maschensieb8 oder das Vortexen des Pflanzengewebes in einem Isolationspuffer9 durchgeführt werden. Der zweite Schritt beinhaltet eine verfeinerte Trennung der interessierenden Trichome von den mikroskopisch kleinen Pflanzenresten und/oder anderen Trichomtypen. Dieser Schritt kann mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation 8,10 oder Sieben verschiedener Größen 7,9 durchgeführt werden. Aufgrund der extremen Empfindlichkeit der RNA in prozessierten Geweben gegenüber Abbaustoffen werden diese beiden aufeinanderfolgenden Schritte in der Regel im eiskalten Isolationsmedium durchgeführt, oft in Gegenwart von Proteininhibitoren4.
Herkömmliche Trichom-Isolationsprotokolle erfordern neben den eiskalten Temperaturen auch große Mengen an Isolationsmedium, um ein effizientes Extraktionsverfahren zu gewährleisten. Die Kombination dieser Komponenten führt zu einem mühsamen, zeitaufwändigen Isolationsprozess, der einen hohen Durchsatz verhindert. Die Präsentation eines einfachen, benutzerfreundlichen alternativen Protokolls zur Isolierung von Trichomen ist daher wahrscheinlich für verschiedene Aspekte im Zusammenhang mit der Trichomcharakterisierung von Vorteil. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, ein alternatives Protokoll zur Isolierung von gestielten und sitzenden Drüsen-Kopftrichomen aus Cannabis sativa anzubieten, indem mehrere Elemente aus den konventionellen Protokollen kombiniert und integriert werden. Zu diesen Elementen gehören Trockeneis5, das Durchlaufen der Trichome durch mehrere Mikrosiebe mit abnehmender Porengröße 7,9 und die Substitution des Isolationsmediums8 durch flüssigen Stickstoff (LN).
Die Neuartigkeit des vorliegenden Trichom-Isolationsprotokolls im Vergleich zu herkömmlichen Protokollen zeigt sich in vielerlei Hinsicht. Dieses Protokoll ist praktisch, da es keine gefährlichen Komponenten benötigt. Das Verfahren kann mit minimalen Vorsichtsmaßnahmen im Labor durchgeführt werden und ermöglicht einen hohen Durchsatz. Durch den Ersatz des flüssigen Standard-Isolationsmediums durch LN wird die Integrität der Trichome während des gesamten Isolationsprozesses sichergestellt und eine anschließende transkriptomische Analyse ermöglicht. Nach der Sublimation des LN und des Trockeneises bleiben die isolierten Trichome frei von schädlichen Rückständen. Darüber hinaus ermöglicht die Neigung von LN, bei Raumtemperatur zu sublimieren, seine großzügige Verwendung im gesamten Protokoll. Im Gegensatz dazu führt die Verwendung großer Mengen herkömmlicher Isolationsmedien zu praktischen Schwierigkeiten bei der Handhabung. Schließlich verringert das Protokoll die Trennung der Bandscheibenzelle von der verbleibenden zerbrechlichen Kopfstruktur des Drüsentrichoms und ermöglicht so die Beibehaltung des Kopfrauminhalts.
Dieses Protokoll wird in einer detaillierten Schritt-für-Schritt-Anleitung vorgestellt, um die technische Praxis der Isolierung von C. sativa-Drüsen-Kopftrichomen zu unterstützen . Das Protokoll bietet einen überschaubaren Arbeitsablauf, der zu isolierten Trichomen mit einer hohen Konzentration und Reinheit führt, die für die nachgelagerte molekulare Analyse geeignet sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Vergleich zu den derzeit verfügbaren Trichom-Isolationsprotokollen werden im vorliegenden Protokoll zwei wesentliche Modifikationen beschrieben. Dazu gehört das Ablösen der Trichome vom Pflanzenmaterial mit Hilfe von Trockeneis im ersten Schritt und das Ersetzen des üblicherweise verwendeten flüssigen Puffermediums durch LN. Die erste Modifikation für die Reinigung von C. sativa-Trichomen basiert auf einem früheren Protokoll, das die Verwendung von zerkleinertem Trockeneis zur Ablösung der Trichome vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich für die finanzielle Unterstützung von CannabiVar Ltd. Das gesamte Pflanzenmaterial wurde großzügigerweise von Professor Hinanit Koltai vom Volcani Center, Israel, zur Verfügung gestellt.
Materials
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
