Pirinç Patlaması Hastalığının (Magnaporthe oryzae) Erken Enfeksiyon Bölgelerinin Arpa (Hordeum vulgare) Üzerinde Temel Bir Mikroskop ve Akıllı Telefon Kullanarak Görselleştirilmesi
Summary
Bu, minimum reaktifler ve ortak laboratuvar ekipmanı (temel bir akıllı telefon dahil) kullanan bir arpa yaprağı kılıfı testinin basit bir protokolüdür. Amaç, gelişmiş mikroskopi ekipmanlarına erişimi olmayan laboratuvarlarda patlama hastalığının erken enfeksiyon sürecini görselleştirmektir.
Abstract
Bitkilerin ve patojenlerin nasıl etkileşime girdiğini ve bu etkileşimin savunma veya hastalıkla sonuçlanıp sonuçlanmadığını anlamak, bitki sağlığı için daha güçlü ve daha sürdürülebilir stratejiler geliştirmek için gereklidir. Enfeksiyon ve kolonizasyon sırasında bitki-patojen örneklerini daha etkili bir şekilde görüntüleyen yöntemlerdeki ilerlemeler, pirinç ve mantar patojeni Magnaporthe oryzae arasındaki enfeksiyon ve erken kolonizasyon olaylarının izlenmesinde yararlı olan pirinç yaprağı kılıfı testi gibi araçlar sağlamıştır. Bu hemi-biyotrofik patojen, pirinç ve darı, çavdar, arpa ve daha yakın zamanda buğday dahil olmak üzere ilgili monokotlarda ciddi hastalık kaybına neden olur. Yaprak kılıfı testi, doğru bir şekilde gerçekleştirildiğinde, araştırmacıların patojen saldırısı sırasında canlı hücre görüntülemesi yapmalarına veya belirli özellikler için boyanmış sabit örnekler oluşturmalarına olanak tanıyan birkaç kat kalınlığında, optik olarak net bir bitki bölümü verir. Arpa-M. oryzae etkileşimine ilişkin ayrıntılı hücresel araştırmalar, bu tahılın hayvanlar ve insanlar için bir besin kaynağı ve fermente içecekler olarak artan önemine rağmen, pirinç konağının gerisinde kalmıştır. Burada, aşılama sonrası ilk 48 saat boyunca M. oryzae etkileşimlerinin karmaşık çalışmaları için bir arpa yaprağı kılıfı testinin geliştirilmesi bildirilmiştir. Yaprak kılıfı testi, hangi türün çalışıldığına bakılmaksızın, hassastır; Arpa yetiştirme koşullarından yaprak kılıfı elde edilmesine, bitki yaprakları üzerindeki patojenin aşılanmasına, inkübasyonuna ve görüntülenmesine kadar her şeyi kapsayan bir protokoldür. Bu protokol, görüntüleme amacıyla akıllı telefon kadar basit bir şey kullanılarak yüksek verimli tarama için optimize edilebilir.
Introduction
Magnaporthe oryzae, pirinç patlama mantarı, arpa, buğday ve pirinç1 dahil olmak üzere çeşitli tahıl bitkilerini enfekte eder. Bu patojen yıkıcı hastalıklara neden olur ve bu değerli ürünler için dünya çapında bir tehdit oluşturur ve kontrol edilmezse tam ürün kaybına neden olur. Dünyadaki birçok laboratuvar, küresel tehdidi ve bitki-mantar etkileşimleri için mükemmel bir model olarak özellikleri nedeniyle pirinç patlama hastalığına odaklanmaktadır2. Tamamen sıralanmıştır ve enfektif döngüsünün genetiği, özellikle de erken olaylar, 3,4 olarak belirlenmiştir. Yaşam döngüsü, bir yaprak yüzeyinde çimlenen bir sporla başlar ve appressorium adı verilen özel penetrasyon yapısını oluşturur. Appressorium yaprak dokusuna nüfuz eder ve enfeksiyon, sporülasyon sürecini başlatan ve hastalık4’ü yayan lezyonların gelişimi ile devam eder. Bu erken olaylardan herhangi birini önlemek, bu yıkıcı hastalığı büyük ölçüde engelleyecektir. Sonuç olarak, patlama hastalığı ile ilgili en güncel araştırmalar, bir appressoryum oluşturan çimlenmiş konidiadan invaziv hiflerin ve biyotrofik ara yüzey kompleksinin (BIC) gelişimine kadar erken enfeksiyon adımlarına odaklanmıştır5.
M. oryzae çeşitli mahsuller için önemli bir patojen olmasına rağmen, patlama hastalığı üzerine çok sayıda araştırma pirinçte yapılmıştır ve yeni evrimleşmiş suşlar buğday6 için küresel bir tehdit olarak ortaya çıkmaktadır. Pirinç, buğday ve mısırla birlikte nüfusu beslemek için kullanılan ilk üç temel üründen biri iken, arpa hayvan yemi ve bira üretimi açısından dördüncü tahıl tanesidir7. Zanaat birası endüstrisi büyüdükçe, arpanın ekonomik değeri de artar. M. oryzae ve arpanın patlama hastalığını incelemek için bir patosistem olarak kullanılmasının belirgin avantajları vardır. İlk olarak, sadece arpayı enfekte eden M. oryzae suşlarının yanı sıra birden fazla çim türünü enfekte edebilen suşlar da vardır. Örneğin, 4091-5-8 öncelikle sadece arpayı enfekte ederken, Guy11 ve 70-15 hem arpa hem de pirinç8’i enfekte edebilir. Bu suşlar genetik olarak benzerdir ve enfeksiyon süreci karşılaştırılabilir9. İkincisi, standart laboratuvar ve sera koşullarında, pirincin karmaşık gereksinimlerine (özlü sıcaklık kontrolü, yüksek nem, spesifik ışık spektrumları) sahip olmadığı için arpanın yetiştirilmesi daha kolaydır. Arpanın10 göstermediği yaprak yüzeyinin hidrofobikliği nedeniyle pirinçle ilgili görüntüleme zorlukları da vardır.
Bu protokol, çoklu enfeksiyon aşamalarının mikroskobik analizi için arpa yaprağı kılıflarını izole etmek ve etkili bir şekilde kullanmak, ortak laboratuvar malzemeleri ve veri toplamak için bir akıllı telefon kullanmak için basit bir yöntem sunar. Arpa yaprağı kılıf testi için bu yöntem, minimum malzeme gerektirdiği için dünyadaki laboratuvarlar için uyarlanabilir ve yine de patojen ile enfekte ettiği ilk birkaç hücre arasındaki mikroskobik etkileşimin net bir resmini sağlar. Sprey veya damlacık aşılaması gibi patojenite testleri, patojenin lezyon oluşturma yeteneğinin makro bir görünümünü sağlayabilirken, bu tahlil araştırmacının penetrasyon öncesi olaylardan epidermal hücrelerin kolonizasyonuna kadar erken enfeksiyonun belirli adımlarını görselleştirmesine olanak tanır. Ayrıca, araştırmacılar vahşi tip mantar ile enfeksiyonu, virülansta azaltılmış bir mutant ile enfeksiyonla kolayca karşılaştırabilirler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sprey veya damlacık aşılamaları gibi uyumlu veya uyumsuz bir enfeksiyon yanıtının makroskopik düzeyde bir görselini sağlayan M. oryzae suşlarını test etmek için yaygın olarak kullanılan birçok tahlil ve lezyon boyutlarını ölçmek için derecelendirme sistemlerinin kullanımı13,14 vardır. M. oryzae için bir başka yaygın tahlil, patojenin özel penetrasyon yapısını, apppressorium15’i oluşturma y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, USDA-NIFA ödülü 2016-67013-24816’dan fon sağladığını kabul etmektedir.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996 (2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
