הדמיה של אתרי זיהום מוקדמים של מחלת פיצוץ האורז (Magnaporthe oryzae) על שעורה (Hordeum vulgare) באמצעות מיקרוסקופ בסיסי וטלפון חכם
Summary
זהו פרוטוקול פשוט של בדיקת נדן עלי שעורה באמצעות ריאגנטים מינימליים וציוד מעבדה נפוץ (כולל טלפון חכם בסיסי). המטרה היא לדמיין את תהליך ההדבקה המוקדם של מחלת הפיצוץ במעבדות ללא גישה לציוד מיקרוסקופיה מתקדם.
Abstract
הבנת האופן שבו צמחים ופתוגנים מתקשרים, והאם אינטראקציה זו מגיעה לשיאה בהגנה או במחלה, נדרשת כדי לפתח אסטרטגיות חזקות ובנות קיימא יותר לבריאות הצמח. ההתקדמות בשיטות המדמה בצורה יעילה יותר דגימות פתוגן צמחי במהלך זיהום וקולוניזציה הניבה כלים כגון בדיקת נדן עלי האורז, אשר היה שימושי בניטור זיהומים ואירועי התיישבות מוקדמת בין האורז לבין הפתוגן הפטרייתי, Magnaporthe oryzae. פתוגן המי-ביוטרופי זה גורם לאובדן מחלות חמורות באורז ובמונוקוטים הקשורים אליו, כולל דוחן, שיפון, שעורה ולאחרונה גם חיטה. בדיקת נדן העלים, כאשר היא מבוצעת כראוי, מניבה חתך צמח שקוף אופטית, בעובי מספר שכבות, המאפשר לחוקרים לבצע הדמיה של תאים חיים במהלך מתקפת פתוגן או לייצר דגימות קבועות מוכתמות עבור תכונות ספציפיות. חקירות תאיות מפורטות של האינטראקציה בין שעורה ל-M. אוריזה פיגרו אחרי אלה של פונדקאי האורז, למרות חשיבותו הגוברת של דגן זה כמקור מזון לבעלי חיים ולבני אדם וכמשקאות מותססים. כאן דווח על פיתוח של בדיקת נדן עלי שעורה למחקרים מורכבים של אינטראקציות M. oryzae במהלך 48 השעות הראשונות לאחר החיסון. בדיקת נדן העלים, ללא קשר למין הנחקר, היא עדינה; מסופק פרוטוקול המכסה הכל, החל מתנאי גידול שעורה וקבלת נדן עלה, ועד חיסון, דגירה והדמיה של הפתוגן על עלי הצמח. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לסינון בתפוקה גבוהה באמצעות משהו פשוט כמו טלפון חכם למטרות הדמיה.
Introduction
Magnaporthe oryzae, פטריית פיצוץ האורז, מדביקה מגוון גידולי דגנים, כולל שעורה, חיטה ואורז1. פתוגן זה גורם למחלות הרסניות ומהווה איום עולמי על גידולים יקרי ערך אלה, וגורם לאובדן יבול מוחלט אם אינו מבוקר. מעבדות רבות ברחבי העולם מתמקדות במחלת פיצוץ האורז בגלל האיום הגלובלי שלה ותכונותיה כמודל מצוין לאינטראקציות צמחיות-פטרייתיות2. הוא רוצף במלואו, והגנטיקה של מחזור ההדבקה שלו, במיוחד האירועים המוקדמים, נקבעה 3,4. מחזור החיים מתחיל בנבג הנובט על פני העלה, ויוצר את מבנה החדירה המיוחד הנקרא אפפרסוריום. האפרסוריום חודר לרקמת העלה, והזיהום ממשיך עם התפתחות נגעים המתחילים בתהליך של נבג ומפיצים מחלה4. מניעת כל אחד מהאירועים המוקדמים הללו תעכב באופן דרסטי את המחלה ההרסנית הזו. כתוצאה מכך, רוב המחקר הנוכחי על מחלת הפיצוץ התמקד בשלבי ההדבקה המוקדמים, החל מהקונידיה הנבטה היוצרת אפפרסויום ועד להתפתחות הקורים הפולשניים והקומפלקס הביוטרופי הבין-פנים (BIC)5.
המחקר הנרחב על מחלת הפיצוץ נערך באורז, למרות ש-M. oryzae הוא פתוגן משמעותי למגוון גידולים, וזנים חדשים שהתפתחו מתגלים כאיום עולמי על חיטה6. בעוד שאורז הוא אחד משלושת הגידולים העיקריים המשמשים להאכלת האוכלוסייה, יחד עם חיטה ותירס, שעורה היא דגן הדגנים הרביעי במונחים של מזון לבעלי חיים וייצור בירה7. ככל שתעשיית בירות הקראפט גדלה, כך גדל הערך הכלכלי של שעורה. ישנם יתרונות ברורים של שימוש ב – M. oryzae ושעורה כמערכת פתו-סיסטם לחקר מחלת הפיצוץ. ראשית, ישנם זנים של M. oryzae שמדביקים רק שעורה, כמו גם זנים שיכולים להדביק מיני דשא מרובים. לדוגמה, 4091-5-8 מדביק בעיקר שעורה, בעוד Guy11 ו 70-15 יכול להדביק גם שעורה ואורז8. זנים אלה דומים גנטית, ותהליך ההדבקהדומה 9. שנית, בתנאי מעבדה וחממה סטנדרטיים, קל יותר לגדל שעורה, מכיוון שאין לה את הדרישות המסובכות של אורז (בקרת טמפרטורה תמציתית, לחות גבוהה, ספקטרום אור ספציפי). ישנם גם אתגרי הדמיה עם אורז בשל הידרופוביות של פני העלה, אשר שעורה אינה מציגה10.
פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה לבידוד וניצול יעיל של נדן עלי שעורה לניתוח מיקרוסקופי של שלבי הדבקה מרובים, תוך שימוש בציוד מעבדה משותף ובסמארטפון לאיסוף נתונים. שיטה זו לבדיקת נדן עלי שעורה ניתנת להתאמה למעבדות ברחבי העולם מכיוון שהיא דורשת אספקה מינימלית, ועם זאת מספקת תמונה ברורה של האינטראקציה המיקרוסקופית בין הפתוגן לבין התאים הראשונים שהוא מדביק. בעוד שמבחני פתוגניות, כגון תרסיס או חיסון טיפתי, יכולים לספק מבט מאקרו על יכולתו של הפתוגן ליצור נגעים, בדיקה זו מאפשרת לחוקר לדמיין שלבים ספציפיים של זיהום מוקדם, החל מאירועים טרום חדירה ועד קולוניזציה של תאי אפידרמיס. יתר על כן, חוקרים יכולים בקלות להשוות זיהום עם פטרייה מסוג בר זיהום עם מוטציה מופחתת באלימות.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנן בדיקות נפוצות רבות הזמינות לבדיקת זני M. oryzae המספקות ראייה ברמה מקרוסקופית של תגובת זיהום תואמת או לא תואמת, כגון חיסוני תרסיס או טיפות, ושימוש במערכות דירוג לכימות גדלים13,14. בדיקה נפוצה נוספת עבור M. oryzae היא לבדוק את יכולתו של הפתוגן ליצור את מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים על מימון מפרס USDA-NIFA 2016-67013-24816.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996 (2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
