تصور مواقع العدوى المبكرة لمرض انفجار الأرز (Magnaporthe oryzae) على الشعير (Hordeum vulgare) باستخدام مجهر أساسي وهاتف ذكي
Summary
هذا بروتوكول مباشر لفحص غمد أوراق الشعير باستخدام الحد الأدنى من الكواشف ومعدات المختبرات الشائعة (بما في ذلك الهاتف الذكي الأساسي). والغرض من ذلك هو تصور عملية العدوى المبكرة لمرض الانفجار في المختبرات دون الوصول إلى معدات الفحص المجهري المتقدمة.
Abstract
إن فهم كيفية تفاعل النباتات ومسببات الأمراض ، وما إذا كان هذا التفاعل يبلغ ذروته في الدفاع أو المرض ، مطلوب لتطوير استراتيجيات أقوى وأكثر استدامة لصحة النبات. وقد أسفر التقدم في الأساليب التي تصور عينات مسببات الأمراض النباتية بشكل أكثر فعالية أثناء العدوى والاستعمار عن أدوات مثل فحص غمد أوراق الأرز ، والذي كان مفيدا في مراقبة العدوى وأحداث الاستعمار المبكرة بين الأرز والممرض الفطري ، Magnaporthe oryzae. يتسبب هذا العامل الممرض الحيوي النصفي في فقدان المرض الشديد في الأرز وأحاديات الفلقة ذات الصلة ، بما في ذلك الدخن والجاودار والشعير ، ومؤخرا القمح. عند إجراء فحص غمد الأوراق بشكل صحيح ، ينتج قسما نباتيا واضحا بصريا ، بسمك عدة طبقات ، مما يسمح للباحثين بإجراء تصوير الخلايا الحية أثناء هجوم العامل الممرض أو إنشاء عينات ثابتة ملطخة بميزات محددة. وقد تخلفت التحقيقات الخلوية التفصيلية في تفاعل الشعير و M. oryzae عن تلك الخاصة بمضيف الأرز ، على الرغم من الأهمية المتزايدة لهذه الحبوب كمصدر غذائي للحيوانات والبشر وكمشروبات مخمرة. تم الإبلاغ هنا عن تطوير مقايسة غمد أوراق الشعير لإجراء دراسات معقدة لتفاعلات M. oryzae خلال أول 48 ساعة بعد التلقيح. مقايسة غمد الأوراق ، بغض النظر عن الأنواع التي تتم دراستها ، حساسة ؛ يوجد بروتوكول يغطي كل شيء ، من ظروف نمو الشعير والحصول على غمد الأوراق ، إلى التلقيح والحضانة وتصوير العامل الممرض على أوراق النبات. يمكن تحسين هذا البروتوكول للفحص عالي الإنتاجية باستخدام شيء بسيط مثل الهاتف الذكي لأغراض التصوير.
Introduction
Magnaporthe oryzae ، فطر انفجار الأرز ، يصيب مجموعة متنوعة من محاصيل الحبوب ، بما في ذلك الشعير والقمح والأرز1. يسبب هذا العامل الممرض أمراضا مدمرة ويشكل تهديدا عالميا لهذه المحاصيل القيمة ، مما يتسبب في خسارة كاملة للمحاصيل إذا لم تتم السيطرة عليها. تركز العديد من المختبرات حول العالم على مرض انفجار الأرز بسبب تهديده العالمي وسماته كنموذج ممتاز للتفاعلات الفطرية النباتية2. لقد تم تسلسله بالكامل ، وتم تحديد علم الوراثة لدورته المعدية ، وخاصة الأحداث المبكرة ، 3,4. تبدأ دورة الحياة ببوغ ينبت على سطح الورقة ، مكونا بنية اختراق متخصصة تسمى appressorium. يخترق appressorium أنسجة الأوراق ، وتستمر العدوى مع تطور الآفات التي تبدأ عملية التبويض وانتشار المرض4. إن منع أي من هذه الأحداث المبكرة من شأنه أن يمنع هذا المرض المدمر بشكل كبير. وبالتالي ، ركزت معظم الأبحاث الحالية حول مرض الانفجار على خطوات العدوى المبكرة ، من الكونيديا النابتة التي تشكل مادة مضغوطة إلى تطوير الخيوط الغازية والمركب البيني الحيوي (BIC) 5.
وقد أجريت الكم الهائل من البحوث حول مرض الانفجار في الأرز، على الرغم من أن M. oryzae هو ممرض كبير لمجموعة متنوعة من المحاصيل، والسلالات المتطورة حديثا تظهر كتهديد عالمي للقمح6. في حين أن الأرز هو واحد من المحاصيل الأساسية الثلاثة الأولى المستخدمة لإطعام السكان ، إلى جانب القمح والذرة ، فإن الشعير هو رابع حبوب الحبوب من حيث علف الماشية وإنتاج البيرة7. مع نمو صناعة البيرة الحرفية ، تنمو القيمة الاقتصادية للشعير. هناك مزايا واضحة لاستخدام M. oryzae والشعير كنظام مرضي لدراسة مرض الأرومة. أولا ، هناك سلالات من M. oryzae تصيب الشعير فقط ، وكذلك السلالات التي يمكن أن تصيب أنواع العشب المتعددة. على سبيل المثال ، يصيب 4091-5-8 الشعير فقط في المقام الأول ، بينما يمكن أن يصيب Guy11 و 70-15 كلا من الشعير والأرز8. هذه السلالات متشابهة وراثيا ، وعملية العدوى قابلة للمقارنة9. ثانيا ، في ظل ظروف المختبر والدفيئة القياسية ، يكون نمو الشعير أسهل ، لأنه لا يحتوي على المتطلبات المعقدة للأرز (التحكم الموجز في درجة الحرارة ، الرطوبة العالية ، أطياف الضوء المحددة). هناك أيضا تحديات تصوير مع الأرز بسبب الكارهة للماء لسطح الورقة ، والذي لا يظهره الشعير10.
يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل أغلفة أوراق الشعير واستخدامها بفعالية للتحليل المجهري لمراحل العدوى المتعددة ، باستخدام لوازم المختبرات الشائعة وهاتف ذكي لجمع البيانات. هذه الطريقة لفحص غمد أوراق الشعير قابلة للتكيف مع المختبرات في جميع أنحاء العالم لأنها تتطلب الحد الأدنى من الإمدادات ، ومع ذلك توفر صورة واضحة للتفاعل المجهري بين العامل الممرض والخلايا القليلة الأولى التي يصيبها. في حين أن مقايسات الإمراضية ، مثل التلقيح بالرش أو القطيرات ، يمكن أن توفر رؤية كلية لقدرة العامل الممرض على تكوين الآفات ، فإن هذا الفحص يسمح للباحث بتصور خطوات محددة للعدوى المبكرة ، من أحداث ما قبل الاختراق إلى استعمار خلايا البشرة. علاوة على ذلك ، يمكن للباحثين بسهولة مقارنة العدوى بالفطريات البرية بالعدوى بطفرة منخفضة في الفوعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من المقايسات شائعة الاستخدام المتاحة لاختبار سلالات M. oryzae التي توفر رؤية على المستوى العياني لاستجابة عدوى متوافقة أو غير متوافقة ، مثل تلقيح الرش أو القطيرات ، واستخدام أنظمة التصنيف لتحديد أحجام الآفة13,14. اختبار شائع آخر ل M. oryzae هو ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون بالتمويل من جائزة USDA-NIFA 2016-67013-24816.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996 (2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
