JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

عزل النوى من أنسجة الكبد المجمدة بالفلاش من أجل Multiomics أحادية الخلية

Published: December 09, 2022
doi:
10.3791/64792
, , ,
1Helmholtz Pioneer Campus (HPC),Helmholtz Munich, 2Institute of Computational Biology, Computational Health Department,Helmholtz Munich, 3Division of Infectious Diseases and Tropical Medicine,Ludwig-Maximillian-Universität Klinikum, 4TUM School of Medicine,Technical University of Munich

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل النوى من أنسجة الكبد المجمدة والمؤرشفة ل RNA-seq أحادي النواة و ATAC-seq و multiomics المشتركة (RNA-seq و ATAC-seq).

Abstract

الكبد هو نسيج معقد وغير متجانس مسؤول عن تنفيذ العديد من الوظائف الفسيولوجية الحرجة ، مثل الحفاظ على توازن الطاقة واستقلاب xenobiotics ، من بين أمور أخرى. يتم تنفيذ هذه المهام من خلال التنسيق الوثيق بين الخلايا المتنية الكبدية وغير المتنية. بالإضافة إلى ذلك ، تقتصر الأنشطة الأيضية المختلفة على مناطق محددة من الفصيص الكبدي – وهي ظاهرة تسمى تقسيم الكبد. مكنت التطورات الحديثة في تقنيات تسلسل الخلية الواحدة الباحثين من التحقيق في عدم تجانس الأنسجة بدقة خلية واحدة. في العديد من الأنسجة المعقدة ، بما في ذلك الكبد ، يمكن أن تؤثر بروتوكولات التفكك الأنزيمية و / أو الميكانيكية القاسية سلبا على صلاحية أو جودة المعلقات أحادية الخلية اللازمة لتوصيف هذا العضو بشكل شامل في الصحة والمرض.

تصف هذه الورقة بروتوكولا قويا وقابلا للتكرار لعزل النوى عن أنسجة الكبد المجمدة والمؤرشفة. تنتج هذه الطريقة نوى عالية الجودة متوافقة مع مناهج أوميكس أحادية الخلية ، بما في ذلك RNA-seq أحادي النواة ، مقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية (ATAC-seq) ، بالإضافة إلى omics متعدد الوسائط (RNA-seq المشترك و ATAC-seq). تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لعزل النوى من عينات الكبد المجمدة السليمة والمريضة من البشر والفئران والرئيسيات غير البشرية. يسمح هذا النهج بالعزل غير المتحيز لجميع أنواع الخلايا الرئيسية في الكبد ، وبالتالي ، يقدم منهجية قوية لدراسة الكبد بدقة خلية واحدة.

Introduction

أصبح علم جينوم الخلية الواحدة بسرعة منهجية أساسية لدراسة وظائف الكبد وتقييم تأثير عدم التجانس الخلوي في الصحة والظروف المرضية1. إن التطور السريع ل “multiomics” للقياس المتزامن لطبقات مختلفة من المعلومات والتوسع المتوازي لخطوط الأنابيب الحسابية القوية يمهد الطريق لاكتشاف أنواع الخلايا والأنواع الفرعية غير المعروفة سابقا في الكبد الطبيعي والمريض2.

زادت إمكانية استكشاف البنوك الحيوية والعينات المجمدة المؤرشفة بشكل كبير من فرص إعادة النظر واكتشاف دور الخلايا غير المتنية3،4،5 والتحقيق في دور خلايا الكبد متعددة الصبغيات أثناء الشيخوخة وفي الأمراض المزمنة6،7،8،9 . لذلك ، تصف هذه الورقة بروتوكول عزل أحادي النواة قوي وقابل للتكرار للكبد المؤرشف المجمد (FF) المتوافق مع تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة في نهاية المصب وتسلسل ATAC ، وكذلك مع omics متعدد الوسائط (RNA-seq المشترك و ATAC-seq) (الشكل 1).

يسمح سير العمل هذا بالتحقيق في إمكانية الوصول إلى النسخ والكروماتين لجميع أنواع الخلايا في الكبد ، بغض النظر عن حجم الخلية أو هشاشتها ، في بروتوكولات التفكك الأنزيمي. يمكن إجراؤه باستخدام أقسام الأنسجة الصغيرة (15-30 مجم أو 5-10 مم3) من عينات بشرية ثمينة أو فئران معدلة وراثيا. يتضمن تحديد درجة النقاء العالية لعزل النوى القياس الكمي وقياس الحجم النووي ، والذي قد يرتبط بزيادة حجم الخلية والشيخوخة 10,11 ، وهذا النقاء مناسب لتحليل كل من الصيغة الصبغية للخلايا الكبدية 12 وآليات النسخ المعتمدة على حجم الخلية11,13,14,15 . بالإضافة إلى ذلك ، تحتفظ النوى المعزولة من الكبد المجمد بمعلومات قيمة حول تقسيم الكبد. يسمح سير العمل وجمع الأنسجة بالتحقق من صحة بيانات الجينوم أحادية الخلية أو المزيد من التحليلات التكميلية ، مثل الكيمياء المناعية أو النسخ المكاني من نفس النسيج ونفس الفرد. لذلك ، يمكن تطبيق هذا النهج على حالات أمراض الكبد المتعددة والكائنات الحية النموذجية بشكل منهجي وموثوق.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا لتشريعات رعاية الحيوان الألمانية ولوائح حكومة بافاريا العليا. تمت الموافقة على إسكان الحيوانات وفقا للمادة 11 من قانون رعاية الحيوان الألماني وتم تنفيذه وفقا للتوجيه 2010/63 / EU. 1. إعداد الأنسجة التضحية بفأر C57BL / 6J يبلغ من العمر 3 أشهر إلى 22 شهرا عن طريق خلع عنق الرحم. ضع الحيوان على لوح تشريح ، وقم بتأمين الأطراف بدبابيس ، وقم بتطهير البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بإجراء التشريح على النحو الموصى به من قبل Treuting et al.16.افتح البطن حتى القفص الصدري ، وتصور الكبد ، واستخدم الملقط لإزالة الكبد بعناية دون ثقب الفصيصات. استخراج الكبد سليمة عن طريق عقد الحجاب الحاجز مع ملقط وإزالة الأنسجة المتصلة بالمقص. اغسل العضو في محلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات (PBS) ، واتركه حتى يجف على منشفة ورقية نظيفة ، وقطع فصيصات الكبد إلى عدة قطع لأغراض مختلفة: FF لعزل النواة الواحدة و multiomics ؛ بارافورمالدهيد ثابت (10٪ PFA) لتضمين البارافين ؛ و / أو مضمن في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) لمزيد من التحليلات النسيجية (الشكل 1 أ). قم بتقسيم قطع الكبد إلى أنابيب كريوفيال أو 5 مل ذات غطاء لولبي ، وقم بتجميدها على الفور في النيتروجين السائل. قم بتخزين عينات الكبد المجمدة عند -80 درجة مئوية لتجارب multiomics أحادية النواة في اتجاه مجرى النهر (الشكل 1B ، C).ملاحظة: يمكن تخزين الأنسجة المحفوظة بالتبريد بأمان عند -80 درجة مئوية لعدة سنوات ويجب نقلها دائما على ثلج جاف عند -80 درجة مئوية قبل الاستخدام. 2. عزل النوى تنظيف الطاولة وإعداد المخازن المؤقتة والمواد الاستهلاكيةنظف أسطح الطاولة والماصات العاملة بنسبة 70٪ من الإيثانول ومحلول إزالة التلوث RNase ، أو استخدم أسطح ومواد مخصصة خالية من RNase. قم بتبريد كل من الدلو المتأرجح وأجهزة الطرد المركزي ذات الزاوية الثابتة ، وأنابيب 1.5 مل / 2 مل ، وألواح متعددة الآبار إلى 4 درجات مئوية ، كما هو مفصل أدناه. قم بتبريد الملقط الخالي من RNase والمستخدم مرة واحدة المستخدم في مناولة الأنسجة ، ومشرط معقم يمكن التخلص منه ، وطبق بتري على ثلج جاف (-60 درجة مئوية). قم بتبريد الخالط الزجاجي Dounce والمدقات على الجليد (4 درجات مئوية). ضع كل مدقة (A و B) في أنبوب سعة 5 مل لتجنب الاتصال المباشر بالجليد والتلوث المحتمل ب RNase. قم بإعداد محلول مخفف من وسط اليوديكسانول (IDM) (الجدول 1 أ) ، واستخدمه لعمل تخفيفات بنسبة 50٪ و 29٪ من وسط تدرج كثافة مخزون اليوديكسانول بنسبة 60٪ (الجدول 1B والجدول 1C ، على التوالي). Prechill جميع الأنابيب. لكل عينة ستتم معالجتها ، قم بإعداد الأنابيب التالية:قم بإعداد ثلاثة أنابيب ربط منخفضة الحمض النووي سعة 1.5 مل (واحد لتجانس الأنسجة المفلترة ، والثاني يحتوي على 250 ميكرولتر من تخفيف 50٪ من محلول اليوديكسانول ، والثالث لتعليق النوى النظيف). قم بإعداد أنبوب دائري القاع سعة 2 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من تخفيف 29٪ من محلول اليوديكسانول لفصل تدرج الكثافة. قم بإعداد أنبوب مخروطي واحد سعة 15 مل لوسط عزل النوى -2 (NIM-2) ومخزن التجانس (HB). قم بإعداد وسط عزل النوى -1 (NIM-1) (الجدول 1D) ، واستخدمه لصنع NIM-2 (الجدول 1E) ، وبعد ذلك HB (الجدول 1F). أضف كلا من مثبطات RNAse قبل الاستخدام مباشرة ، كما هو موضح أدناه في البروتوكول. قم بإعداد المخزن المؤقت لتخزين النوى (NSB) كما هو موضح في الجدول 1G. أضف مثبط RNAse المؤتلف قبل الاستخدام مباشرة. أضف مثبط RNAse القائم على البروتين إلى NSB قبل استخدامه لفرز FACS (اختياري). قم بإعداد دورق سعة 500 مل بالماء المعقم لامتصاص المجانسات والمدقات Dounce بعد تجانس الأنسجة من أجل التنظيف الأمثل وصيانة المجانسات. تجانس الأنسجةقطع قطعة مناديل 20-30 مجم (أو 5 مم3) بمشرط مبرد مسبقا داخل طبق بتري على ثلج جاف. ثم انقل طبق بتري على الفور إلى ثلج مبلل (4 درجات مئوية). أضف 1 مل من HB ، وباستخدام المشرط البارد ، قم بفرم الأنسجة قدر الإمكان للسماح باستنشاقها بسهولة باستخدام طرف فتحة عريضة سعة 1 مل.ملاحظة: استخدم دائما أطراف واسعة الفتحة لجميع عمليات نقل الأنسجة / النوى. كبديل ، يمكن قطع أطراف 1 مل بمشرط معقم على غطاء بلاستيكي معقم لتوليد فتحات واسعة (الشكل 2 أ). اجمع معلق الأنسجة ، وانقله إلى خالط Dounce الزجاجي المبرد مسبقا سعة 2 مل (الشكل 2 ب). اغسل طبق بتري ب 0.5-1 مل إضافي من HB ، واجمع كل قطع الأنسجة المتبقية مع الحفاظ على كل شيء على الجليد. ببطء وبعناية تفعل خمس ضربات مع مدقة فضفاضة A على الجليد. تجنب إنشاء فقاعات باستخدام حركات التواء المدقة عند سحبها لأعلى ولأسفل. تأكد من أن المدقة تتحرك بعناية من أعلى إلى أسفل الخالط مع كل ضربة. بعد ذلك ، قم بإجراء 10-15 ضربة بطيئة مع مدقة ضيقة B على الجليد. تجنب خلق الفقاعات.ملاحظة: يوصى بفحص النوى بصريا تحت المجهر بعد 10 ضربات باستخدام المدقة B للتأكد مما إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من السكتات الدماغية. قم بذلك باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق (نسبة 1: 1 من التريبان إلى العينة) ومقياس الدم اليدوي (على سبيل المثال ، امزج 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق مع 10 ميكرولتر من معلق النوى ، واستخدم 10 ميكرولتر من الخليط للفحص تحت المجهر ؛ الشكل 2 ج). قم بتصفية التجانس من خلال مصفاة خلية 50 ميكرومتر أثناء نقلها إلى أنبوب مبرد مسبقا سعة 1.5 مل. استخدم أكثر من مرشح و / أو أنبوب للتجانس الذي يحتوي على كمية عالية من كتل النسيج الضام. اشطف الخالط والمرشحات المستخدمة مع 0.5-1 مل إضافي من HB لجمع كل تجانس الأنسجة تماما. انتقل إلى الطرد المركزي تدرج الكثافة. الطرد المركزي المتدرج الكثافةقم بالطرد المركزي للتجانس المصفى في جهاز طرد مركزي ثابت الزاوية مبرد مسبقا عند 1000 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. أثناء دوران العينة ، قم بإعداد أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 250 ميكرولتر من تخفيف اليوديكسانول بنسبة 50٪ وأنبوب واحد سعة 2 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من تخفيف اليوديكسانول بنسبة 29٪. احتفظ بكلا الأنبوبين على الجليد. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات باستخدام مضخة تفريغ.ملاحظة: سيؤدي استخدام السحب اليدوي إلى الإضرار بجودة تعليق النوى النهائي. أضف 250 ميكرولتر من HB إلى الحبيبات باستخدام طرف ماصة بفتحة عريضة سعة 1 مل ، وأعد تعليقه ببطء شديد. انقل 250 ميكرولتر من معلق النوى إلى أنبوب مبرد مسبقا سعة 1.5 مل يحتوي على 250 ميكرولتر من تخفيف اليوديكسانول بنسبة 50٪ ، واخلطه برفق ولكن بدقة لتوليد تعليق يوديكسانول / نوى بنسبة 25٪. انقل 500 ميكرولتر من معلق اليوديكسانول / النوى بنسبة 25٪ إلى أنبوب مبرد مسبقا سعة 2 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من تخفيف اليوديكسانول بنسبة 29٪.ملاحظة: يجب ترسيب 500 ميكرولتر من معلق اليوديكسانول / النوى بنسبة 25٪ برفق فوق 500 ميكرولتر من محلول اليوديكسانول 29٪ بحيث تظهر مخاليط اليوديكسانول 25٪ / 29٪ فصلا واضحا للطور. استخدم جانب جدار الأنبوب مع وضع طرف الماصة بزاوية 45 درجة لإنشاء واجهة التدرج هذه. من الآن فصاعدا ، يجب التعامل مع الأنبوب برفق حتى لا يزعج هذا التدرج. قم بجهاز طرد مركزي للأنبوب في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح مبرد مسبقا عند 12500 جم لمدة 20 دقيقة مع ضبط الفرامل على إيقاف التشغيل. قبل اكتمال خطوة الطرد المركزي مباشرة ، أضف مثبطات RNAse إلى المخزن المؤقت NSB عند المتابعة إلى خطوط أنابيب scRNA-seq (انظر الجدول 1G). بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات باستخدام مضخة تفريغ.ملاحظة: سيؤدي استخدام السحب اليدوي إلى الإضرار بجودة تعليق النوى النهائي. باستخدام طرف ماصة بفتحة عريضة سعة 1 مل ، أعد تعليق الحبيبات برفق في 100-300 ميكرولتر من NSB ، وانقل تعليق النوى إلى أنبوب نظيف ومبرد مسبقا سعة 1.5 مل. عد النوى باستخدام محلول التريبان الأزرق (نسبة 1: 1 من التريبان إلى العينة) ومقياس الدم اليدوي (على سبيل المثال ، امزج 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق مع 10 ميكرولتر من معلق النوى ، واستخدم 10 ميكرولتر من الخليط للعد ؛ الشكل 2 د). استخدم تعليق النوى الذي تم الحصول عليه على الفور لفحص الجينوم أحادي النواة.ملاحظة: يمكن تخزين تعليق النوى في NSB مبردة عند 4 °C لمدة تصل إلى 1 أسبوع لمزيد من التحليل عن طريق التدفق و / أو قياس التدفق الخلوي للتصوير ولكن ليس ل snRNA-seq أو snATAC-seq. 3. فرز النوى لتوصيف الصبغيات الكبدية أو نهج التسلسل القائم جيدا لفرز الخلايا القائمة على قياس التدفق الخلوي ، قم بتصفية تعليق النوى من خلال مرشح 50 ميكرومتر في أنبوب FACS مبرد مسبقا سعة 5 مل. استخدم فارز قياس التدفق الخلوي المزود بفوهة 100 ميكرومتر. قم بتحميل أنبوب FACS على الفارز، وقم بمعاينة العينة. قم بإعداد استراتيجية البوابة لفرز النوى ، بدءا من بوابة التشتت عن طريق رسم منطقة التشتت الأمامية مقابل منطقة التشتت الجانبية (FSC-A / SSC-A) ، متبوعة ب Hoechst-Height مقابل Hoechst-Area (بوابة النوى) ، ثم Hoechst-Width مقابل Hoechst-Area (بوابة مفردة). تصور ملف تعريف الصيغة الصبغية للنوى على الرسم البياني لمنطقة Hoechst.ملاحظة: للحصول على دقة ذروة أفضل ، تصور قناة Hoechst (450/50) على المقياس الخطي (الشكل 3A). للفرز إلى ألواح بئر 96 / 384 ، اضبط تأخير القطرة ، وقم بتحسين محاذاة اللوحة باستخدام طريقة القياس اللوني مع بيروكسيديز الركيزة والفجل البنزيدين (TMB-HRP) ، كما هو موضح سابقا6. اضبط كلا من تبريد العينة وحامل اللوحة ليبرد عند 4 درجات مئوية ، مع تشغيل دوران العينة عند 300 دورة في الدقيقة. قم بفرز النوى المفردة بتركيز عينة ~ 1 × 105 نوى / مل وبمعدل تدفق عند 200-500 حدث / ثانية. 4. الفحص البصري وتحديد المعلمات النووية عن طريق التصوير الخلوي (اختياري) حمل أنبوبا حجمه 0.5 مل يحتوي على 50 ميكرولتر من معلق النوى بتركيز 2 × 107 نواة/مل. قم بإعداد بوابة جميع الأحداث بناء على نسبة العرض إلى الارتفاع مقابل قناة Hoechst الفلورية لتصور ملف تعريف الصيغة الصبغية للنوى (الشكل 3 ب). احصل على العينة بتكبير 40x باستخدام حقل ساطع (BF) وقناة مضان Hoechst. فحص وتحديد نوى 2n و 4n باستخدام قياس المجال الساطع وكثافة مضان Hoechst باستخدام برنامج قياس الخلايا التصويرية (الشكل 3C). 5. بناء وتسلسل مكتبة RNA-seq أحادية النواة أو ATAC-seq أو multiome بالنسبة لنهج snRNA-seq القائمة على القطيرات ، قم بتحميل تعليق النوى المنقى مباشرة في جهاز الموائع الدقيقة للتقسيم المتوازي الآلي والتشفير الشريطي الجزيئي17. بعد اكتمال تشغيل الموائع الدقيقة في جهاز التقسيم أحادي الخلية ، اجمع النوى المغلفة بحبة الجل ، واحتضانها ، وتنظيفها كما هو موضح سابقا في إرشادات الشركة المصنعة17. قم بإجراء 11 دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للتضخيم المسبق ل cDNA باستخدام البرنامج التالي: 3 دقائق عند 98 درجة مئوية ، (15 ثانية عند 98 درجة مئوية ، 20 ثانية عند 63 درجة مئوية ، و 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية) × 11 ، 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية ، وعقد عند 4 درجات مئوية. استمر في الإصلاح النهائي وخطوة A-tailing وربط المحول ، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة17. لبناء مكتبة التعبير الجيني النهائية اللاحقة ، قم بإجراء 10 دورات PCR باستخدام البرنامج التالي: 45 ثانية عند 98 درجة مئوية ، (20 ثانية عند 98 درجة مئوية ، 30 ثانية عند 54 درجة مئوية ، 20 ثانية عند 72 درجة مئوية) × 10 ، 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية ، وعقد عند 4 درجات مئوية. تسلسل المكتبات التي تم الحصول عليها إلى عمق قراءة ~ 20,000-50,000 متوسط قراءات لكل نواة. بالنسبة للتسلسل القائم على قطرات multiomics المشتركة (RNA + ATAC) ، قم باحتضان نوى الكبد في محلول التحلل لمدة 5 دقائق ، ثم ضع علامة عليها لمدة 1 ساعة ، كما هو موضح سابقا18. قم بتحميل النوى الموسومة مباشرة في جهاز الموائع الدقيقة للتقسيم المتوازي الآلي والترميز الشريطي الجزيئي. بعد اكتمال تشغيل الموائع الدقيقة ، اجمع النوى المغلفة بحبة الجل ، واحتضانها ، وتنظيفها كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة18. قم بإجراء ست دورات PCR لخطوة التضخيم المسبق ل cDNA باستخدام البرنامج التالي: 5 دقائق عند 72 درجة مئوية ، 3 دقائق عند 98 درجة مئوية ، (20 ثانية عند 98 درجة مئوية ، 30 ثانية عند 63 درجة مئوية ، 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية) × 6 ، 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية ، وعقد عند 4 درجات مئوية. خذ 35 ميكرولتر من العينة المضخمة مسبقا ، وقم بإجراء تضخيم cDNA على النحو التالي: 3 دقائق عند 98 درجة مئوية ، (15 ثانية عند 98 درجة مئوية ، 20 ثانية عند 63 درجة مئوية ، 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية) × 6 ، 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية ، وعقد عند 4 درجات مئوية. استمر في الإصلاح النهائي وخطوة A-tailing وربط المحول ، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة18 . بالنسبة لفهرسة العينة النهائية اللاحقة PCR ، قم بإجراء 15 دورة PCR على النحو التالي: 45 ثانية عند 98 درجة مئوية ، (20 ثانية عند 98 درجة مئوية ، 30 ثانية عند 54 درجة مئوية ، 20 ثانية عند 72 درجة مئوية) × 15 ، 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية ، وعقد عند 4 درجات مئوية. لبناء مكتبات ATAC ، استخدم 40 ميكرولتر ، وقم بالتضخيم لست دورات PCR لفهرسة العينات باستخدام البرنامج التالي: 45 ثانية عند 98 درجة مئوية ، (20 ثانية عند 98 درجة مئوية ، 30 ثانية عند 67 درجة مئوية ، 20 ثانية عند 72 درجة مئوية) × 6 ، 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية ، والاحتفاظ بها عند 4 درجات مئوية. تسلسل مكتبات التعبير الجيني متعدد الأضلاع التي تم الحصول عليها إلى عمق قراءة لا يقل عن 20000 زوج قراءة لكل نواة ومكتبات ATAC متعددة الأضلاع إلى عمق قراءة لا يقل عن 25000 زوج قراءة لكل خلية ، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة18.

Representative Results

تم تصميم سير العمل هذا لعزل النواة الواحدة من عينات الكبد المجمدة ل multiomics أحادي النواة ويعتمد على ثلاث خطوات رئيسية ، والتي يمكن تلخيصها على النحو التالي: i) جمع العينات للتحليل المتوازي لعدم التجانس الخلوي وبنية الأنسجة ، ii) تعليق أحادي النواة ، و iii) multiomics أحادي النواة (الشكل 1 ). يتم تشريح الكبد المستخرج من الفئران الرحيمة وتقطيعها إلى قطع للفحص النسيجي إما لتضمين البارافين أو التشريح بالتبريد أو كليهما. يتم تجميد القطع المقطوعة الأخرى على الفور في النيتروجين السائل لعزل المصب أحادي النواة لتحليلات multiomics. يسمح نظام جمع الأنسجة هذا للمستخدم بالتحقق من صحة بيانات أوميكس أحادية النواة على أقسام الأنسجة من نفس الفرد ، وبالتالي استكمال مجموعة البيانات بالنسخ المكاني أو بتحليلات الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، إذا لزم الأمر. يظهر الفحص المجهري للنوى المستخرجة من الكبد المجمد بالطريقة الموضحة هنا أن خطوة الطرد المركزي المتدرج الكثافة تسهل إلى حد كبير إزالة الحطام الخلوي والأنسجة غير المرغوب فيه (الشكل 2C ، D). علاوة على ذلك ، تحافظ هذه المنهجية على جميع مستويات الصيغة الصبغية ، والتي يمكن التحقق من صحتها وقياسها كميا من خلال التحليلات الخلوية (الشكل 3). لمزيد من التحقق من صحة أداء هذا البروتوكول ، أجرينا snRNA-seq القائم على القطيرات على نوى غير مصنفة ومصنفة من قبل FACS وقمنا بتحليل البيانات التي تتبع خط أنابيب Seurat. باختصار ، تم تحضير النوى المفردة المستخرجة ل snRNA-seq القائم على القطيرات كما هو موضح سابقا19. بالنسبة ل snRNA-seq لنوى 2n و 4n أو مستويات أعلى من الصيغة الصبغية ، تم استخدام 11 دورة لخطوة تضخيم cDNA و 10 دورات لبناء مكتبة التعبير الجيني النهائي. تم تسلسل المكتبات الناتجة إلى عمق قراءة ~ 25000-39000 متوسط قراءات لكل نواة. تم تعيين قراءات النوى المفردة التي تم الحصول عليها إلى جينوم الماوس GRCm39 / mm39. عند تشغيل خط أنابيب المعالجة المسبقة ، تمت إضافة الأمر — include-intron للتأكد من تضمين وقياس الحمض النووي الريبي المرسال غير المقسم (mRNA) الموجود في النوى. قامت خوارزمية EmptyDrops المدمجة داخل التقويم بتصفية وإزالة القطرات الفارغة. تم استخدام حزمة R Seurat (الإصدار 4.1.1) لحساب مقاييس مراقبة الجودة (QC) باستخدام مصفوفة عدد المعرف الجزيئي الفريد (UMI) كما تم إخراجها بواسطة خط أنابيب تحليل snRNA-seq. تمت إزالة الأعداد التي تحتوي على أقل من 100 ميزة (جينات) وأقل من 10 خلايا. تم ترشيح النوى وفقا لعتبات مراقبة الجودة المحددة: الحد الأدنى لعدد الجينات = 200 والحد الأقصى لعدد الجينات = 8000 ، وجزء الميتوكوندريا <1٪ وجزء الريبوسوم <2٪. تم استخدام أفضل 3000 جين متغير للغاية (HVGs) لتحليل المكونات الرئيسية (PCA) ، كما تم تنفيذه في سورات. تم إجراء التجميع المستند إلى الرسم البياني بعد إدخال أعلى 15 بعدا للكمبيوتر الشخصي ناتجة عن تحليل PCA. لتجميع الخلايا ، قمنا بتطبيق تقنية تحسين النمطية (خوارزمية Louvane) مع تعيين معلمة دقة على 0.5. لتصور واستكشاف مجموعة البيانات هذه ، قمنا بتشغيل تقليل الأبعاد غير الخطي ، أي تقريب وإسقاط المشعب الموحد (UMAP). تم تعيين هوية كل مجموعة بناء على المعرفة المسبقة بجينات العلامة6،20،21. يوضح الشكل 4A مقاييس عالية الجودة من البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة استخراج النوى هذه. يمثل UMAP عدد الأعداد عبر جميع النوى وأنواع الخلايا الرئيسية التي لا يمكن تحديدها بثقة إلا باستخدام النسخ النووي والتسلسل الضحل نسبيا (~ 25000-40000 قراءة متوسطة لكل خلية) (الشكل 4 ب). يسمح هذا النهج بالتحقيق في عوامل النسخ الخاصة بالكبد مثل Hnf4a و Mlxipl و Ppara ، بالإضافة إلى الجينات المستهدفة النهائية المشاركة في استقلاب xenobiotics (أي Cyp2e1 و Cyp2f2) (الشكل 4C). تجدر الإشارة إلى أن النوى المستخرجة احتفظت بمعلومات مهمة حول تقسيم الكبد ، كما هو موضح في النمط التكميلي للجينات المميزة مثل Cyp2e1 المحيطة بالمركز و periportal Cyp2f2 (الشكل 4C). قمنا كذلك بتقييم توافق النوى غير المصنفة المستخرجة باستخدام هذه الطريقة مع فحوصات multiomics الأحدث للتنميط المتزامن للمشهد فوق الجيني (ATAC) والتعبير الجيني (RNA) في نفس النوىالمفردة 18. قمنا بتحسين وقت حضانة تحلل النوى إلى 5 دقائق قبل التبديل. تم إنشاء مكتبات التسلسل عن طريق تشغيل ست دورات PCR للتضخيم المسبق ل cDNA. من العينة المضخمة مسبقا ، تم أخذ 35 ميكرولتر وتضخيمها بشكل أكبر بواسطة 15 دورة PCR لفهرسة العينة لبناء مكتبة التعبير الجيني. يظهر مخطط كهربي تمثيلي لأثر cDNA في الشكل 5A (أعلى). لبناء مكتبات ATAC ، تم استخدام 40 ميكرولتر من العينة المضخمة مسبقا وتشغيلها لست دورات PCR إضافية لفهرسة العينات ، مع مخطط كهربي تمثيلي لأثر الحمض النووي الموضح في الشكل 5A (أسفل). تم تسلسل مكتبة التعبير الجيني الناتجة (RNA) إلى عمق 44,600 قراءة لكل نواة ومكتبة ATAC إلى عمق 43,500 قراءة لكل نواة (الشكل 5 ب). على غرار ما هو موصوف أعلاه ، تم إجراء بروتوكول التسلسل القائم على القطرات أحادية الطريقة ، ورسم خرائط القراءة ، والمحاذاة ، وإزالة القطرة الفارغة ، وعد الشظايا باتباع الإرشادات القياسية ، كما هو موضح سابقا ، باستخدام الجينوم المرجعي GRCm39 / mm3918. باستخدام حزم Seurat و Signac22 ، أجرينا تحليل “أقرب جار مرجح” (WNN) لقياسات متعددة لكلتا الطريقتين (RNA + ATAC) (الشكل 5C) ، مما سمح لنا بتحديد وتعليق كل من أنواع خلايا الكبد الرئيسية والثانوية دون تحيزات بارزة بسبب حجم الخلية أو الهشاشة النووية (الشكل 5D). يتضمن خط الأنابيب ، كما نشره مختبر Satija22,23 ، خطوات مراقبة الجودة القياسية – المعالجة المسبقة وتقليل الأبعاد – التي يتم إجراؤها على كلا المقايستين بشكل مستقل. للحصول على تمثيل جيد للتركيبة المرجحة لطرائق RNA-seq و ATAC-seq ، تم رسم الرسم البياني WNN واستخدامه لتصور UMAP والتجميع والتعليق التوضيحي بناء على جينات العلامةالمحددة مسبقا 6،20،21. على غرار المقايسات باستخدام طريقة واحدة ، اكتشفنا أيضا منظمات النسخ الأولية (Hnf4a و Psara و Mlxipl) والجينات المميزة لتقسيم الكبد (Hamp و Cyp2e1 و Cyp2f2) (الشكل 5E). الشكل 1: نظرة عامة تجريبية وسير العمل والتطبيقات الجينومية أحادية الخلية. (أ) تمثيل توضيحي لأخذ عينات الأنسجة لعلم الأنسجة (على اليسار ، تم اختيار ثلاثة أقسام لتضمين البارافين و / أو التقطيع بالتبريد) ، وجمع الأنسجة المجمدة لعلم الجينوم أحادي الخلية (الأوسط) ، والكيمياء الهيستولوجية المناعية التمثيلية وتحليلات التألق المناعي (يمين) ؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) الخطوات الحاسمة لنظام التعليق أحادي النواة عالي الجودة. (ج) يمكن تحميل معلقات النوى على شريحة كروم 10x أو استخدامها لفرز FACS والنهج القائمة على الألواح. الاختصارات: H&E = الهيماتوكسيلين ويوزين. DAPI = 4 ‘، 6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ FACS = فرز الخلايا المنشط بالتألق. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 2: تشريح الكبد وتجانس الأنسجة الزجاجية Dounce. (أ) كبد الفئران التمثيلي من فأر C57BL6 / J يبلغ من العمر 3 أشهر (يسار) ؛ قسم الكبد المستخدم لعزل النواة الواحدة قبل (الوسط) وبعد فرم الأنسجة بالمشرط (يمين). قضبان المقياس = 1 سم. (B) صور توضيحية لتجانس زجاج Dounce سعة 2 مل قبل السكتات الدماغية مع المدقة “السائبة” A (يسار) وبعد المدقة “الضيقة” B (يمين). مراقبة تجانس الأنسجة باستخدام مقياس الدم (C) قبل الطرد المركزي المتدرج و (D) بعد الطرد المركزي المتدرج. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 3: فرز الخلايا المنشط بالفلورة وقياس التدفق الخلوي للتصوير لتوصيف النوى عالية الإنتاجية . (أ) استراتيجية البوابات لفرز FACS أحادي النواة في لوحة لاستجواب مستويات مختلفة من الصيغة الصبغية. بوابة مبعثرة على أساس منطقة التشتت الأمامية مقابل منطقة التشتت الجانبية المحددة لاستبعاد الحطام ؛ بوابة النوى على أساس Hoechst-Height مقابل Hoechst-Area التي تضم مجموعات نوى متعددة ؛ بوابة مفردة على أساس Hoechst-Width مقابل Hoechst-A مجموعة للتمييز المزدوج ؛ يسمح الرسم البياني Hoechst-A بتصور ملف تعريف الصيغة الصبغية للنواة. (ب) القياس الكمي للتصوير الخلوي التمثيلي لجميع الأحداث (يسار) والأحداث المفردة (اليمنى) ، مع إظهار نوى ثنائية الصيغة الصبغية ورباعية الصيغة الصبغية. (ج) صور برايتفيلد وهويشت لنوى 2n و 4n وقياسها الكمي باستخدام القياس الخلوي التصويري. الاختصارات: FACS = فرز الخلايا المنشط بالتألق ؛ FSC-A = منطقة التشتت الأمامية ؛ SSC-A = منطقة التشتت الجانبية ؛ Hoechst-H = ارتفاع Hoechst ؛ Hoechst-A = منطقة Hoechst ؛ Hoechst-W = Hoechst-العرض. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 4: التوصيف العميق للصبغيات الكبدية باستخدام snRNA-seq . (أ) مخططات الكمان التي توضح عدد الجينات، والأعداد، والنسبة المئوية لجينات الميتوكوندريا، والنسبة المئوية للجينات الريبوسومية المكتشفة. (ب) يوضح UMAP أنواع الخلايا المكتشفة باستخدام snRNA-seq (يسار) ، مع التعبير عن القياس الكمي بالنسبة المئوية للنوى (يمين). (ج) يوضح UMAP عدد الأعداد ويشير إلى التعبير عن الجينات الخاصة بالخلايا الكبدية. جميع النوى (الصف العلوي) ، نوى 2n (الصف الأوسط) ، ونوى 4n (الصف السفلي). الاختصارات: snRNA-seq = نواة واحدة RNA-seq ؛ UMAP = تقريب وإسقاط مشعب موحد ؛ ميتوك. = جينات الميتوكوندريا. الريبوس. = جينات الريبوسوم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 5: مراقبة الجودة وتحليل multiomics (RNA-seq المشترك و ATAC-seq) من الكبد الصغير المجمد والمؤرشف. (أ) آثار الرحلان الكهربائي التلقائي التمثيلية التي تم الحصول عليها بعد خط الأنابيب المتعدد تظهر منتج الوزن الجزيئي بعد تخليق cDNA و ATAC. (ب) مخطط الكمان يوضح عدد أعداد ATAC-seq و RNA-seq والنسبة المئوية لجينات الميتوكوندريا والنسبة المئوية للجينات الريبوسومية قبل التصفية وبعدها. (C) يوضح UMAP التعبير الجيني من RNA-seq (يسار) ، ATAC-seq (وسط) ، وطرائق مشتركة – RNA-seq و ATAC-seq (يمين). (د) أنواع الخلايا المختلفة مشروحة بألوان مختلفة، مع التعبير عن الجينات المحددة لخلايا الكبد. (ه) مخطط مميز يوضح التعبير العنقودي للجينات المشار إليها في أنواع الخلايا المشار إليها. الاختصارات: ATAC-seq = مقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية ؛ منتصف Hep = خلايا الكبد في منتصف المنطقة ؛ إندو = الخلايا البطانية. PV Hep = خلايا الكبد المحيطة بالبوابة ؛ غير Z Hep = خلايا الكبد غير zonated ؛ CV Hep = خلايا الكبد المحيطة بالمركز. Kup & DC = كوبفر والخلايا المتغصنة ؛ SC = الخلايا النجمية ، Neu = العدلات ؛ تشول = الخلايا الصفراوية. ميتوك. = جينات الميتوكوندريا. الريبوس. = جينات الريبوسوم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الكاشف رصيد 10 مل 15 مل 50 مل (أ ) وسط يوديكسانول (IDM) 250 مللي متر سكروز 1 م 12.5 مل 150 مللي متر KCl 2 م 3.75 مل 30 مللي متر MgCl2 1 م 1.5 مل 60 مللي متر تريس العازلة درجة الحموضة 8.0 1 م 3 مل مياه خالية من RNase فائقة النقاء 29.25 مل (ب) 50٪ IDM يوديكسانول 60% 12.5 مل آي دي إم 2.5 مل (ج) 29٪ IDM يوديكسانول 60% 7.25 مل آي دي إم 7.75 مل (د ) وسط عزل النوى-1 (NIM-1) 250 مللي متر سكروز 1 م 12.5 مل 25 مللي متر KCl 2 م 0.625 مل 5 مللي متر MgCl2 1 م 0.25 مل 10 مللي متر تريس العازلة درجة الحموضة 8.0 1 م 0.5 مل مياه خالية من Rnase فائقة النقاء 36.125 مل (ه ) وسط عزل النوى-2 (NIM-2) المخزن المؤقت NIM-1 9.99 مل ديثيوثريتول (DTT) 1 مليمتر 0.01 مل قرص مثبط الأنزيم البروتيني (خال من EDTA) 1 1 قرص (و ) مخزن التجانس المؤقت (HB) المخزن المؤقت NIM-2 9.697 مل مثبطات RNase المؤتلف 40 وحدة / ميكرولتر 0.1 مل مثبطات الحمض النووي الريبي القائمة على البروتين (SUPERase • IN) 20 وحدة / ميكرولتر 0.1 مل 0.1٪ تريتون إكس 10% 0.1 مل 3 ميكروغرام / مل Hoechst 33342 10 ملغم / مل 0.003 مل (ز ) مخزن تخزين النوى (NSB) 166.5 مللي متر سكروز 1 م 1.665 مل 5 مللي متر MgCl2 1 م 0.05 مل 10 مللي متر تريس درجة الحموضة 8.0 1 م 0.1 مل مثبطات RNase المؤتلف 40 وحدة / ميكرولتر 0.1 مل مثبطات RNase القائمة على البروتين (SUPERase • IN) * 20 وحدة / ميكرولتر 0.1 مل مياه خالية من RNase فائقة النقاء 8.085 مل * اختياري (لفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية فقط) الجدول 1: وصفات الحل. (أ) تحضير وسط اليوديكسانول؛ (ب) تخفيف محلول اليوديكسانول بنسبة 50٪؛ ج: 29٪ تخفيف محلول يوديكسانول. (د) تحضير وسط عزل النواة-1 (NIM-1). (ه) تحضير وسط عزل النواة-2 (NIM-2). (و) إعداد مخزن التجانس (HB). (ز) تحضير مخزن تخزين النوى (NSB).

Discussion

يوفر تشريح التركيب الخلوي للكبد بواسطة خلية واحدة أو نواة واحدة RNA-seq فهما أعمق لتطور أمراض الكبد وتطورها3،4،5،24. يستغرق عزل الخلية الواحدة من الكبد وقتا طويلا ويتطلب بروتوكولات تنطوي على تفكك ميكانيكي أو إنزيمي قاسي25،26،27. من المقبول على نطاق واسع أن كل نسيج يتطلب تقييما منهجيا لتحديد بروتوكول تفكك الأنسجة الأمثل ، بالإضافة إلى طريقة تخزين مناسبة لالتقاط أنواع الخلايا الهشة أو النوى28. اعتمادا على توافر الأنسجة أو المرض محل الاهتمام أو مرحلة النمو أو الكائن الحي النموذجي ، قد يكون إعداد معلق أحادي النواة للمعالجة النهائية منهجية أكثر ملاءمة من استخدام معلقات أحادية الخلية. الأهم من ذلك ، في الكبد ، أظهر scRNA-seq و snRNA-seq ارتباطا عاليا بين mRNA النووي والسيتوبلازمي ، مما يشير إلى أن كلا النهجين يقدمان معلومات تكميلية2،3،4،6،29.

توفر هذه الورقة عزلة أحادية النواة موحدة وقوية وقابلة للتكرار من عينات الكبد المجمدة والمؤرشفة من الفئران والأنواع الأخرى ، بما في ذلك البشر المكاك. يمكن استخدام هذه الطريقة للفئران البرية التي تتغذى على الطعام والنظام الغذائي عالي الدهون (HFD) ولنماذج الفئران من تليف الكبد باستخدام كل من النهج الجينومية أحادية النواة القائمة على الصفائح والقطيرات6. تعتمد هذه الطريقة على البروتوكول الموصوف أصلا لأنسجة المخ بواسطة Krishnaswami et al.30 مع تعديلات إضافية مصممة خصيصا للكبد المجمد. التجانس الأمثل يحرر معظم النوى من الأنسجة دون التأثير سلبا على سلامة الغشاء النووي. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي الإفراط في الإغراق إلى إتلاف النوى الهشة وتقليل جودتها الإجمالية. عادة ما تتطلب الكبد الصغير و / أو الدهني 5 ضربات فقط مع المدقة A و 10 ضربات مع المدقة B ، بينما قد تتطلب الكبد القديم و / أو الليفي 15 ضربة مع المدقة B ولكن ليس أكثر. لذلك ، لا يوصى بإجراء المزيد من السكتات الدماغية بما يتجاوز الأرقام المشار إليها هنا. قد يؤثر الإفراط في تناول الطعام سلبا على جودة التعليق أحادي النواة ويزيد من كمية الحمض النووي الريبي المحيط. بعد ذلك ، قد يؤدي ذلك إلى الحاجة إلى تنفيذ خطوات تصفية حسابية إضافية أثناء تحليلات البيانات النهائية.

البروتوكول المقدم هنا متعدد الاستخدامات ويمكن تعديله وفقا لظروف الكبد المختلفة في الفئران الصغيرة (3 أشهر) والكبيرة (24 شهرا). نظرا لأننا وجدنا أن قسما أكبر من الكبد ضروري للأنسجة القديمة و HFD والأنسجة الليفية ، فإن حجم الأنسجة المتاحة للمعالجة يمكن أن يشكل قيدا لبعض المستخدمين الذين لديهم كميات أقل من المواد البيولوجية الأولية. ومع ذلك ، يوصى بشدة بتنقية التدرج للمعالجة الفورية للعينات باستخدام المقايسات الجينومية القائمة على القطيرات. إذا كانت النوى بحاجة إلى فرز FACS إلى 96-/384 لوحة بئر للمقايسات القائمة على الآبار ، فيمكن حذف تنقية التدرج. نحن نشجع المستخدمين على الاستمرار في إجراء تنقية التدرج إذا كان هناك عينة أنسجة كافية للحصول على تركيز النوى الموصى به لفرز FACS (أي ~ 1 × 105 نوى / مل).

يتميز الكبد بالطبيعة متعددة الصبغيات لخلايا الكبد9 ، لكن دور الصبغيات الكبدية في علم وظائف الأعضاء الطبيعي والمرض لم يتضح بعد. هناك مجموعة متزايدة من الأدلة التي تشير إلى أن الصيغة الصبغية توفر التباين الجيني31 ، ومن المعروف أن الصيغة الصبغية تزداد مع سن32,33. ومع ذلك ، فإن إثراء الخلايا الكبدية رباعية النواة يرتبط أيضا سريريا بسوء التشخيص في سرطان الخلايا الكبدية البشرية (HCC)34. وبالمثل ، ترتبط التغيرات في مستويات الصيغة الصبغية لخلايا الكبد بأمراض الكبد المزمنة المرتبطة بالشيخوخة مثل مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD)35،36،37. الصيغة الصبغية هي حالة امتلاك أكثر من نسختين من الجينوم ، والتي يمكن استكشافها عن طريق تلطيخ محتوى الجينوم بصبغة الحمض النووي مثل Hoechst38. صبغة Hoechst ، التي تضاف إلى HB قبل الاستخراج ، تسمي جميع النوى أثناء بروتوكول العزل. يسمح هذا بالتمييز بين النوى ثنائية الصيغة الصبغية ومتعددة الصبغيات بناء على محتوى الحمض النووي الخاص بها عند إثارتها بواسطة ليزر UV (350 نانومتر) أو ليزر بنفسجي (450 نانومتر) على أداة قياس التدفق الخلوي. باستخدام استراتيجية البوابات المعروضة ، يمكن التحقيق في مستويات 2n و 4n و 8n ومستويات أعلى من الصيغة الصبغية لخلايا الكبد في الكبد المجمد والمؤرشف لفهم دور عدم التجانس الخلوي في وظيفة الأنسجة1 بشكل أفضل (الشكل 3 أ). علاوة على ذلك ، يمكن قياس التشكل النووي ، بما في ذلك الحجم والحجم ، باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير لربط التغيرات في حجم النواة بالتغيرات في العدد الإجمالي للأعداد أو عدد الجينات اعتمادا على مستوى الصيغة الصبغية (الشكل 3B ، C).

يوفر قياس الأوميكس متعدد الوسائط الفرصة للتحقيق في عدة طبقات من التنظيم الجينومي في وقت واحد. يسمح نهج multiomics المشترك RNA + ATAC بالتحقيق في منظمات المنبع والجينات الأيضية النهائية ، مما يوفر نهجا شاملا لدراسة شبكات النسخ وبنية الكروماتين المرتبطة بوظائف الكبد بدقة الخلية الواحدة. علاوة على ذلك ، مع التقدم في الأساليب الحسابية التي يمكن أن تفسر تناثر البيانات وانخفاض تكاليف التسلسل ، فإن multiomics أحادية الخلية رائدة في تقييم طرائق متعددة من نفس الخلية. يتوافق بروتوكول عزل النواة الواحدة هذا مع التقييم الفردي والمشترك لمجموعات بيانات التعبير والكروماتين. لقد استخدمنا خطوط الأنابيب القياسية التي أنشأها Stuart et al.23 (حزمة Signac) لتوضيح جودة البيانات ، في حين يمكن بسهولة اعتماد العديد من الطرق الحسابية المتاحة والبديلة لتحليلات المصب 23،39،40،41.

بشكل عام ، تسمح multiomics أحادية النواة بالتحقيق في أنسجة الكبد الرئيسية المؤرشفة بيولوجيا ، وفأر FF ، والإنسان ، وغير البشري باستخدام كمية صغيرة جدا من مواد عينة البدء من خلال تنفيذ بروتوكول استخراج النواة المقدم هنا. ستمكن هذه الأداة التي لا تقدر بثمن علماء بيولوجيا الكبد من استجواب كل من التعبير الجيني وإمكانية الوصول إلى الكروماتين في سياق أمراض الكبد المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكشف مستويات مختلفة من الصيغة الصبغية للخلايا الكبدية والتعديل الناتج عن التعبير الجيني الذي يعتمد على موقعها في فصيص الكبد عن دورها في أمراض الكبد. لذلك ، نتوقع أن يوفر التحقيق في عدم التجانس الخلوي فرصا جديدة لتطوير الطب الدقيق والتدخلات المستهدفة ضد أمراض مثل HCC و NAFLD.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من قبل حرم هيلمهولتز بايونير (M.S. ، K.Y. ، C.P.M.-J.) ومعهد البيولوجيا الحاسوبية (C. T.-L.). تم دعم هذا البحث أيضا من قبل AMED تحت رقم المنحة JP20jm0610035 (C.P.M.-J.). نشكر دعم الجينوم الأساسي في HMGU (I. de la Rosa) والمعلوماتية الحيوية (T. Walzthoeni) ، ولا سيما Xavier Pastor للتدريب والتوجيه. نشكر A. Feuchtinger و U. Buchholz و J. Bushe وجميع الموظفين الآخرين من مرفق HMGU Pathology and Tissue Analytic الأساسي على دعمهم الفني والعلمي ، بالإضافة إلى J. Zorn و R. Erdelen و D. Würzinger وموظفي E-Streifen ، بالإضافة إلى المرفق الأساسي لخدمات المختبر على دعمهم العلمي المستمر ومناقشاتهم. نحن ممتنون لتحليل خلايا المنشأة الأساسية في TranslaTUM (R. Mishra) ، و Luminex ، شركة DiaSorin (P. Rein). نشكر الدكتور I Deligiannis على دعمه الفني. كان الدكتور إم هارتمان والدكتور أ. شرودر والسيدة أ. باردن (حرم هيلمهولتز بايونير) أساسيين لدعمهم القانوني والإداري والإداري.

Materials

10% Tween 20 – 5 mL Bio-Rad 1662404
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA
Adhesive PCR film Thermo Fisher Scientific AB0558
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1851196
Cell Sorter For fluoresence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter.
Centrifuge 5430R Eppendorf 5428000619 Use chilled at 4 °C
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit 10X Genomics 1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit 10X Genomics 1000127
Chromium Next GEM Chip J Single cell kit, 16 reactions 10X Genomics 1000230
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1, 4 reactions 10X Genomics 1000269
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 reactions 10X Genomics 1000285
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich 11873580001
Dithiothreitol (DTT) 1 M solution Sigma Aldrich 646563 Make 1 mM stock solution and use at 1 µM final concentration.
DNA AWAY Surface Decontaminant Thermo Fisher Scientific 10223471 Wipe surfaces and pipettes before start of experiment
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL Thermo Fisher Scientific 16628742
DNA LoBind Tubes, 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 16638742
Elution Buffer (EB) – 250 mL Qiagen 19086
Eppendorf ThermoMixer C Thermo Fisher Scientific 13527550
Eppendorf ThermoMixer C Accessory: Smartblock Thermo Fisher Scientific 13518470
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade – 100 mL  Thermo Fisher Scientific 10517694
Filters 50 µm, sterile   SYSMEX PARTEC – CELLTRICS 04-004-2327 Adjust filter diameter according with tissue and nuclei size
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) – 1 L Ricca Chemical Company 3290-32
Hard-Shell, 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white Bio-Rad HSP3905
Herenz Heinz ABS Forceps Thermo Fisher Scientific 1131884
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water Invitrogen H3570 Light-sensitive
Imaging Flow Cytometer For imaging flow cytometry analysis, e.g. Luminex Amnis ImageStream
Invitrogen TE Buffer – 100 mL Thermo Fisher Scientific 11568846
KCl (2 M), RNase-free, 100 mL Thermo Fisher Scientific AM9640G
MgCl2 (1 M), 100 mL Thermo Fisher Scientific AM9530G
MicroAmp 8-Cap Strip, clear-300 strips Thermo Fisher Scientific 10209104
MicroAmp 8-Tube Strip, 0.2 mL-125 strips Thermo Fisher Scientific 10733087
Mörser 2 mL DOUNCE Wagner & Munz GmbH 9651632 RNase zap and rinse with MillQ before use
MyFuge 12 Mini MicroCentrifuge C1012 Benchmark Scientific C1012 Or any other strip and tube mini centrifuge
Neubauer Hemocytometer OMNILAB  LABORZENTRUM 5435293 Visualize and count nuclei under microscope
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) Thermo Fisher Scientific AM9937
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma Aldrich D1556
Pipette tips RT LTS 1000 µL, Wide-O Mettler Toledo 30389218
Pistill "A" 2 mL Wagner & Munz GmbH  9651621 RNase zap and rinse with MillQ before use
Pistill "B" 2 mL Wagner & Munz GmbH 9651627 RNase zap and rinse with MillQ before use
Polypropylene 15 mL Centrifuge Tube Thermo Fisher Scientific 10579691
Polystyrene Petri dish, 60 mm x 15 mm Thermo Fisher Scientific 10634141
Polystyrene Round-Bottom 5 mL FACS Tubes Thermo Fisher Scientific 10100151
Protector RNase inhibitor – 2,000 U Sigma Aldrich 3335399001 Keep in -20 °C until use
Protein-based RNase Inhibitor SUPERase•In (20 U/μL) Thermo Fisher Scientific AM2696 Keep in -20 °C until use
Recombinant RNase Inhibitor Clontech Takara 2313B Keep in -20 °C until use
RNAse free microfuge tubes – 0.5 mL Thermo Fisher Scientific AM12450
RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780 Wipe surfaces and pipettes before start of experiment
SPRIselect – 60 mL Beckman Coulter B23318 Aliquot and store in 4 °C
Sucrose, 500 g Sigma Aldrich S0389-500G Make a 1 M stock solution
Swann-Morton Sterile Disposable Stainless Steel Scalpels Thermo Fisher Scientific 11798343
Tris-HCI (1M), pH 8.0 Invitrogen 15568025
Triton X-100, 98%, 100 mL Thermo Fisher Scientific 10671652 Make 10% stock solution. Keep at 4 °C and protect from light.
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 11538886
Vortex- Mixer VWR 444-1372 Or any other type of vortex
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kamies, R., Martinez-Jimenez, C. P. Advances of single-cell genomics and epigenomics in human disease: where are we now. Mamm Genome. 31 (5-6), 170-180 (2020).
  2. Ramachandran, P., Matchett, K. P., Dobie, R., Wilson-Kanamori, J. R., Henderson, N. C. Single-cell technologies in hepatology: New insights into liver biology and disease pathogenesis. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 17 (8), 457-472 (2020).
  3. Ramachandran, P., et al. Resolving the fibrotic niche of human liver cirrhosis at single-cell level. Nature. 575 (7783), 512-518 (2019).
  4. Andrews, T. S., et al. Single-cell, single-nucleus, and spatial RNA sequencing of the human liver identifies cholangiocyte and mesenchymal heterogeneity. Hepatology Communications. 6 (4), 821-840 (2022).
  5. Xiong, X., et al. Landscape of intercellular crosstalk in healthy and NASH liver revealed by single-cell secretome gene analysis. Molecular Cell. 75 (3), 644-660 (2019).
  6. Richter, M. L., et al. Single-nucleus RNA-seq2 reveals functional crosstalk between liver zonation and ploidy. Nature Communications. 12 (1), 4264 (2021).
  7. Matsumoto, T., Wakefield, L., Tarlow, B. D., Grompe, M. In vivo lineage tracing of polyploid hepatocytes reveals extensive proliferation during liver regeneration. Cell Stem Cell. 26 (1), 34-47 (2020).
  8. Chen, F., et al. Broad distribution of hepatocyte proliferation in liver homeostasis and regeneration. Cell Stem Cell. 26 (1), 27-33 (2020).
  9. Donne, R., Saroul-Ainama, M., Cordier, P., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy in liver development, homeostasis and disease. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 17 (7), 391-405 (2020).
  10. Lengefeld, J., et al. Cell size is a determinant of stem cell potential during aging. Science Advances. 7 (46), 0271 (2021).
  11. Lanz, M. C., et al. Increasing cell size remodels the proteome and promotes senescence. Mol Cell. 82 (17), 3255-3269 (2022).
  12. Kim, J. Y., et al. PIDDosome-SCAP crosstalk controls high-fructose-diet-dependent transition from simple steatosis to steatohepatitis. Cell Metabolism. 34 (10), 1548-1560 (2022).
  13. Padovan-Merhar, O., et al. Single mammalian cells compensate for differences in cellular volume and DNA copy number through independent global transcriptional mechanisms. Molecular Cell. 58 (2), 339-352 (2015).
  14. Miettinen, T. P., et al. Identification of transcriptional and metabolic programs related to mammalian cell size. Current Biology. 24 (6), 598-608 (2014).
  15. Vargas-Garcia, C. A., Ghusinga, K. R., Singh, A. Cell size control and gene expression homeostasis in single-cells. Current Opinion in Systems Biology. 8, 109-116 (2018).
  16. Knoblaugh, S. E., Randolph-Habecker, J. . Necropsy and histology. In Comparative Anatomy and Histology: A Mouse, Rat, and Human Atlas (Second Edition). , (2018).
  17. Chromium Next GEM Single Cell 3 Reagent Kits v3.1 User Guide. Document number CG000204 (Rev D). 10x Genomics Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry (2019)
  18. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide. Document number CG000338 (Rev D). 10x Genomics Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide (2021)
  19. MacParland, S. A., et al. Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations. Nature Communications. 9 (1), 4383 (2018).
  20. Martinez-Jimenez, C. P., Kyrmizi, I., Cardot, P., Gonzalez, F. J., Talianidis, I. Hepatocyte nuclear factor 4alpha coordinates a transcription factor network regulating hepatic fatty acid metabolism. Molecular and Cell Biology. 30 (3), 565-577 (2010).
  21. Schmidt, D., et al. Five-vertebrate ChIP-seq reveals the evolutionary dynamics of transcription factor binding. Science. 328 (5981), 1036-1040 (2010).
  22. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
  23. Stuart, T., Srivastava, A., Madad, S., Lareau, C. A., Satija, R. Single-cell chromatin state analysis with Signac. Nature Methods. 18 (11), 1333-1341 (2021).
  24. Sampaziotis, F., et al. Cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver. Science. 371 (6531), 839-846 (2021).
  25. Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes as a tool for studying toxicity and drug metabolism. Current Drug Metabolism. 4 (4), 292-312 (2003).
  26. Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: The choice to investigate drug metabolism in man. Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).
  27. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  28. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
  29. Nault, R., Fader, K. A., Bhattacharya, S., Zacharewski, T. R. Single-nuclei RNA sequencing assessment of the hepatic effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (1), 147-159 (2021).
  30. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  31. Duncan, A. W., et al. Aneuploidy as a mechanism for stress-induced liver adaptation. Journal of Clinical Investigation. 122 (9), 3307-3315 (2012).
  32. Kreutz, C., et al. Hepatocyte ploidy is a diversity factor for liver homeostasis. Frontiers in Physiology. 8, 862 (2017).
  33. Hunt, N. J., Kang, S. W. S., Lockwood, G. P., Le Couteur, D. G., Cogger, V. C. Hallmarks of aging in the liver. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 1151-1161 (2019).
  34. Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. 69 (2), 355-364 (2019).
  35. Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
  36. Schwartz-Arad, D., Zajicek, G., Bartfeld, E. The streaming liver IV: DNA content of the hepatocyte increases with its age. Liver. 9 (2), 93-99 (1989).
  37. Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (6), 387-393 (1993).
  38. Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
  39. Granja, J. M., et al. ArchR is a scalable software package for integrative single-cell chromatin accessibility analysis. Nature Genetics. 53 (3), 403-411 (2021).
  40. Bredikhin, D., Kats, I., Stegle, O. MUON: Multimodal omics analysis framework. Genome Biology. 23 (1), 42 (2022).
  41. Velten, B., et al. Identifying temporal and spatial patterns of variation from multimodal data using MEFISTO. Nature Methods. 19 (2), 179-186 (2022).

Tags

Nuclei IsolationSingle-cell MultiomicsDensity Gradient CentrifugationIodixanolCell StrainerBio-archived Human Liver SamplesMouse ModelNon-human Primate

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Strzelecki, M., Yin, K., Talavera-López, C., Martinez-Jimenez, C. P. Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics. J. Vis. Exp. (190), e64792, doi:10.3791/64792 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image